臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)PCR技術(shù)的應(yīng)用

1、WS/T 230-2002 臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用Guidelines for use of polymerase chain reaction(PCR) technique in clinical diagnosis1范圍    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用準(zhǔn)則。    本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級(jí)，各類的醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機(jī)構(gòu)應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行臨床診斷。2定義    本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。2.1引物primer    與待擴(kuò)增靶DNA片段兩端

2、互補(bǔ)的寡核昔酸，其本質(zhì)是單鏈DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能進(jìn)行延伸，從而合成新的互補(bǔ)鏈。2.2模板template    待擴(kuò)增的靶DNA或RNA鏈，包括人類基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、eDNA和mRNA、擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物等幾乎所有形式的DNA或RNA。2.3變性denaturation    DNA或RNA由雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)，加熱、提高pH或加入甲酰胺、脲等試劑都可使雙鏈DNA或RNA發(fā)生變性。2.4  退火annealing    引物與互補(bǔ)的核苷酸序列在合適

3、的溫度下通過(guò)氫鍵形式相互結(jié)合的過(guò)程。2.5  延伸  extension    在合適的條件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引導(dǎo)引物DNA鏈延伸的合成過(guò)程。2.6  污染  contamination    由來(lái)源子非待測(cè)樣品的核酸所引起的一個(gè)樣品、一系列樣品或試劑的非特異性擴(kuò)增或擴(kuò)增后在產(chǎn)物分析過(guò)程中造成的樣品之間的污染，污染通常引起假陽(yáng)性結(jié)果。2.7  遺留污染  carry-over contamination    同一類靶序列上一

4、次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)以后擴(kuò)增反應(yīng)的后續(xù)污染。2.8  內(nèi)對(duì)照  internal control    在同一反應(yīng)混合物體系中與待測(cè)靶核酸同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的已知對(duì)照物。2.9 Taq DNA聚合酶  Taq DNA polymerase    一種耐熱的DNA聚合酶，最初是從美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉中存在的水生棲熱菌(Thermu$ aquati-cus)中分離獲得，Taq酶最適活性溫度在70 80，能耐受PCR變性過(guò)程中的高溫，是目前PCR擴(kuò)增反應(yīng)中經(jīng)常使用的DNA聚合酶。2.10抑制物干擾物inhibiti

5、on/interference    臨床樣品中能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性擴(kuò)增的內(nèi)源性物質(zhì)（如血液中的某些成分，痰液中的酸性多糖、尿液、體液等）和外源性物質(zhì)（如滑石粉、抗凝劑等）。2.11  dNTP deoxynueleotide triphosphate    三磷酸脫氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，作為反應(yīng)底物聚合形成新的DNA鏈。2.12熱循環(huán)儀thermocycler    在PCR或其他需要在反應(yīng)過(guò)程中轉(zhuǎn)換溫度的體系中用來(lái)保證溫度準(zhǔn)確快速

6、轉(zhuǎn)換的設(shè)備。3用途    對(duì)目前已有穩(wěn)定、可靠的微生物學(xué)和免疫學(xué)方法檢測(cè)的疾病或病原體，不推薦應(yīng)用PCR進(jìn)行檢測(cè)。例如，大多數(shù)的細(xì)菌感染通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)34天即可報(bào)告并明確藥敏結(jié)果；對(duì)甲型肝炎病毒等的感染。通過(guò)對(duì)其抗原或和抗體的檢測(cè)也可明確診斷。對(duì)于目前尚無(wú)其他實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)或現(xiàn)有的診斷技術(shù)不成熟、敏感性太低、不能及時(shí)準(zhǔn)確地反映感染情況的疾病，可推薦應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。如丙型肝炎病毒的感染，檢測(cè)其抗體不能做到早期診斷、也不能表明血清中有無(wú)病毒的存在，又如結(jié)核桿菌的感染，培養(yǎng)需23個(gè)月，耗時(shí)太長(zhǎng)，影響診斷，對(duì)此類病原體，PCR檢測(cè)有其獨(dú)到的優(yōu)點(diǎn)。 

7、0;  PCR臨床實(shí)驗(yàn)根據(jù)其應(yīng)用的不同可分為三個(gè)互相交叉的類型t“過(guò)篩實(shí)驗(yàn)”，“診斷實(shí)驗(yàn)”、“驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)”。3.1過(guò)篩實(shí)驗(yàn)    過(guò)篩實(shí)驗(yàn)適用于數(shù)目較大的群體，可能大部分元癥狀（疾病的流行性可能很低）。一個(gè)陽(yáng)性結(jié)果并不能確定病原微生物的流行或反映某種疾病狀態(tài)，它只能提示有必要作進(jìn)一步的檢測(cè)。較高的診斷敏感性和陰性可信度是過(guò)篩實(shí)驗(yàn)最重要的特性。3.2診斷實(shí)驗(yàn)    診斷實(shí)驗(yàn)用于當(dāng)?shù)啬撤N疾病流行率很高、疑診患有某種疾?。ɑ蛱禺愋愿腥荆┑娜后w，特異性靶基因（或病原體）的有無(wú)對(duì)診斷和治療有重要意義。因此，要求在保證實(shí)驗(yàn)特異性的情況下-

8、敏感性盡可能地高。3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)    對(duì)于過(guò)篩實(shí)驗(yàn)或診斷實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性的情況，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可作為其補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，用于確診。特異性和陽(yáng)性可信度是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最重要的特性。4方法4.1  引物序列的選擇    引物的設(shè)計(jì)是在模板序列中挑選出兩段寡核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板。模板序列的選擇隨著檢測(cè)的不同而不同，但也有一些共同之處，如：1）模板序列應(yīng)是特異的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部分），模板序列的選擇應(yīng)避免核苷酸重復(fù)片段區(qū)I2）模板序列在某些情況下需要的是種屬內(nèi)部的保守區(qū)、非保守區(qū)（尤其是引物部分）或?qū)賰?nèi)特異區(qū)。

9、60;   選擇合適的引物是保證PCR擴(kuò)增特異性和敏感性的關(guān)鍵。首先，對(duì)應(yīng)用于臨床診斷的PCR。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，其靶核酸的序列一定是已知的，這些基因序列信息可從基因數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）中獲得。雖然引物的設(shè)計(jì)在一定程度上依靠經(jīng)驗(yàn)，尤其是目前已有多種計(jì)算機(jī)軟件可應(yīng)用于核苷酸的序列分析和PCR引物的設(shè)計(jì)，但引物的適用性尚需通過(guò)實(shí)驗(yàn)性研究加以確定。PCR引物設(shè)計(jì)一般遵循以下基本原則：    a)引物的長(zhǎng)度一般為1530個(gè)堿基；        b)兩引物相距的距離以100300核背酸為最優(yōu)，

10、這樣可獲得較佳的擴(kuò)增效果；    c)引物內(nèi)堿基應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堆集現(xiàn)象，引物中GC含量宜在40%60%左右；    d)引物內(nèi)部不應(yīng)有二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間、尤其在3端的序列不應(yīng)互補(bǔ)；    e)引物3端與模板一定要互補(bǔ)，末端堿基不要出現(xiàn)多個(gè)A。4.2常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)方案4.2.1材料    模板DNA (102105拷貝)    上游引物    下游引物    Ta

11、q DNA聚合酶和濃縮反應(yīng)緩沖液    氯化鎂(MgCl2)    無(wú)DNA酶(DNase)的水    無(wú)DNase礦物油    dNTP混合物(含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)4.2.2擴(kuò)增反應(yīng)（一般情況下，每50 L反應(yīng)體積所含組分如下）：    成分                &

12、#160;   終濃度    無(wú)DNase的水      將反應(yīng)體積補(bǔ)足至50L    濃縮反應(yīng)緩沖液    1×工作濃度    dNTP混合物       各0.2 mmol/L    Taq DNA聚合酶    0.51.0 U/50 L  &#

13、160; 氯化鎂(MgCI2)    1.5 mmol/L    上游引物         1 mol/L    下游引物         1mol/L    模板            102105拷貝/50

14、L。    每個(gè)反應(yīng)管加12滴(20L40L)無(wú)DNase的礦物油，根據(jù)適合各個(gè)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增參數(shù)，按變性、退火、延伸三步驟的熱循環(huán)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析    擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同可采用不同的分析方法，瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定點(diǎn)雜交還有助于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型（如HLA-DQ分型）；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異性產(chǎn)物的大小，因此，可增加檢測(cè)的特異性和敏感性。其他一些方法，如微孔板雜交、PCR-酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(

15、ELISA)等均有助于產(chǎn)物的精確分析。4.3.1凝膠電泳    這種方法是根據(jù)帶負(fù)電的DNA可以在pH中性的緩沖液巾向陽(yáng)極遷移的原理而建立的，凝膠基質(zhì)可以是瓊脂糖或聚丙烯酰胺等，核酸的遷移率與瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的濃度、電流、離子強(qiáng)度以及溫度等因素有關(guān)。電泳后，通過(guò)溴化乙啶(EB)染色，在紫外下可以清晰地觀察到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，但擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性必須用探針雜交等方法加以鑒定。4.3.2點(diǎn)雜交法    點(diǎn)雜交法的基本過(guò)程是t首先將擴(kuò)增產(chǎn)物固定到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用核素或非核索標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，由于核素有較大的放射危害性，現(xiàn)

16、在多用非核索進(jìn)行探針標(biāo)記，如生物寨、熒光素、酶及化學(xué)發(fā)光劑等州玉可在反應(yīng)時(shí)直接摻入地高辛或生物素標(biāo)記的單核替酸，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物固定，再用抗地高辛抗體或親合索進(jìn)行反應(yīng)來(lái)檢設(shè)4靶序列。    4.3.3微孔板夾心雜交法    該方法是通過(guò)固定子微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域進(jìn)行特異性雜交，使擴(kuò)增產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用生物泵等非核紊標(biāo)記的檢測(cè)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗、顯色后即可判斷結(jié)果。4.3.4 PCR-ELISA    將引物的5，端用生物素或異硫氰酸熒光素(FITC)等修飾

17、后并不影響其擴(kuò)增特異性靶核酸的特性，因此，可以通過(guò)修飾其中一個(gè)引物的5端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物被捕獲、固定的功能基團(tuán)（如生物紊）。而通過(guò)另一引物5，端的修飾(如FITC)使產(chǎn)物便于檢測(cè)，這樣避免了電泳和雜交等步驟，適于常規(guī)檢測(cè)。4.3.5其他    如限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Restriction-fragment-length-polymorphism，RFLP)、核苷酸序列分析等。5樣品的收集、運(yùn)輸、處理和存放    正確的樣品收集、運(yùn)送和保存是十分重要的。雖然PCR檢測(cè)對(duì)上述環(huán)節(jié)的要求與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)基本相同，

18、但在許多情況下仍有其特殊性。即無(wú)論在什么情況下都至少應(yīng)保持靶核酸的完整性，樣品中的干擾物應(yīng)能被充分稀釋，使其不致于干擾檢測(cè)。5.1樣品的收集    實(shí)驗(yàn)室對(duì)每項(xiàng)特定的PCR檢測(cè)都應(yīng)制定并為臨床提供詳細(xì)的樣品收集規(guī)則。5.1.1樣品收集的時(shí)間    在某一疾病的病程中，樣品收集過(guò)早或過(guò)遲都會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，因此。要注意樣品收集的時(shí)限性或時(shí)效性。5.1.2收集場(chǎng)所的準(zhǔn)備    樣品的收集場(chǎng)所應(yīng)要求避免細(xì)菌污染并去除可能造成污染的物質(zhì)，樣品的收集需由經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)的工作人員來(lái)完成。5.1.3樣品的類型和數(shù)

19、量    樣品的類型、數(shù)量應(yīng)是一定的，它們可能與常規(guī)微生物學(xué)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求相同或不同，這是由疾病病原體的不同特性決定的。一般而畝，如果所收集的樣品可以進(jìn)行培養(yǎng)，那么提取核酸進(jìn)行擴(kuò)增分析也是可行的。5.1.4樣品的質(zhì)量    樣品的質(zhì)量可根據(jù)以下一種或幾種方法進(jìn)行評(píng)估：肉眼觀察、顯微鏡檢查或化學(xué)分析。評(píng)估其細(xì)胞組成、細(xì)胞數(shù)目、核酸總量等。5.1.5樣品的收集運(yùn)輸裝置    樣品的收集需采用一次性材料，樣品的收集材料（如拭子、試紙）或試劑（如防腐荊、抗凝劑或其他常規(guī)添加劑）必須不會(huì)干擾擴(kuò)增或檢測(cè)過(guò)程，抗凝

20、劑一般采用乙二胺四乙酸鹽(EDTA)或枸櫞酸鹽，肝索對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有一定的抑制作用而且在以后的靶核酸提取中不易除去，應(yīng)盡量避免使用l對(duì)游離的核酸，需滅活核酸酶使其穩(wěn)定。靶核酸（如DNA）應(yīng)能從收集裝置中釋放出來(lái)，另外，收集、運(yùn)輸過(guò)程中某些介質(zhì)可能會(huì)稀釋樣品，因此，必須考慮稀釋對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。5.1.6樣品的核對(duì)    收到樣品后，應(yīng)對(duì)病人姓名、樣品類型、收集時(shí)間等進(jìn)行詳細(xì)核對(duì)。5.2樣品的運(yùn)輸    樣品收集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)輸過(guò)程中，特別是在需要保持細(xì)胞的完整性時(shí)，應(yīng)注意避免樣品的過(guò)冷或過(guò)熱，并盡量減少細(xì)菌等污染物的生長(zhǎng)，

21、而且必須保證樣品巾的靶核酸免受內(nèi)源性或外源性核酸酶的破壞與降解；游離核酸需經(jīng)穩(wěn)定化處理，靶核酸為RNA時(shí)要求更為嚴(yán)格（如對(duì)靶核酸為RNA的樣品可加入異硫氰酸胍鹽滅活其中的核酸酶），不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)運(yùn)輸方法都有其特殊要求，應(yīng)明確加以規(guī)定。5.3樣品的處理    樣品中的許多雜質(zhì)能抑制Taq DNA聚合酶的活性，從而干擾擴(kuò)增反應(yīng)，樣品的處理可去除這些干擾雜質(zhì)，增加PCR擴(kuò)增的成功率和可重復(fù)性，有利于檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，純化樣品中的核酸(DNA或RNA)，可使待測(cè)核酸暴露，有利于與引物的退火。5.3.1靶核酸的釋放    待擴(kuò)增的靶核酸可能來(lái)源于不同

22、的臨床樣品，如血液、體液、尿液、糞便、游離的細(xì)胞或組織塊等。靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。如病原微生物的靶核酸可存在于宿主細(xì)胞內(nèi)與宿主DNA整合在一起、游離子宿主細(xì)胞核中或以各種形式存在于宿主細(xì)胞質(zhì)中。而且，臨床樣品中常含有蛋白、脂類等干擾物質(zhì)，因此，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，必須對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)靶核酸不同的存在狀態(tài)，采取相應(yīng)的處理方法。承3.2靶核酸的分離    經(jīng)典的核酸提取方法包括去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及醇類沉淀等步驟，利用玻璃粉、二氧化硅及硅藻等具有吸附核酸特性的固體顆粒建立的核酸提取方法可以簡(jiǎn)單、快速、高效地提取適合于PCR擴(kuò)

23、增的靶核酸，目前已有許多商品化的核酸分離試劑盒可供選擇。5.3.3靶核酸的質(zhì)量    用于擴(kuò)增的靶核酸序列必須是完整的，將制備的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行比較即可初步判斷靶核酸的完整性和含量，也可通過(guò)測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)下的吸光度確定提取的靶核酸的濃度和純度。5.3.4處理過(guò)程的復(fù)雜性    樣品的處理應(yīng)盡量簡(jiǎn)化，以減少樣品的交叉污染或丟失靶核酸的機(jī)會(huì)。5.3.5樣品的生物安全性    樣品中可能含有對(duì)人體有害的生物因子，處理過(guò)程中應(yīng)注意防止其危害操作人員f對(duì)臨床樣品的處理，可參照實(shí)驗(yàn)室對(duì)

24、臨床樣品的常規(guī)處理方法進(jìn)行。5.4樣品的存放    臨床用于PCR測(cè)定的DNA靶核酸樣品應(yīng)在一定的緩沖液(如1×TE)中4保存lRNA靶核酸樣品應(yīng)在一定緩沖液中80或液氮中存放。用乙醇或異丙醇等沉淀的靶核酸樣品存放在20即可。6污染的預(yù)防和控制    由于PCR的擴(kuò)增高效性和檢測(cè)的高敏感性，極微量的污染即可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，因此，必須特別注意避免樣品DNA的污染所導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。PCR的污染途徑主要有三個(gè)：    a)來(lái)自其他待測(cè)樣品DNA的交叉污染；    b)來(lái)

25、自其他實(shí)驗(yàn)材料如克隆質(zhì)?；蚓wDNA的污染；    c)來(lái)自同一靶序列上次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。    其中由同一靶序列上次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所引起的污染（遺留污染）最為常見，必須制定嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(standard operation procedure，SOP)以減少污染所致的假陽(yáng)性結(jié)果。6.1劃分不同的操作區(qū)    PCR的前處理和后處理應(yīng)在不同的隔離工作臺(tái)（生物安全柜）或房間內(nèi)進(jìn)行，整個(gè)操作流程要在不同的隔離區(qū)進(jìn)行：1）試劑準(zhǔn)備和儲(chǔ)存區(qū)；2）樣品處理區(qū)；3）PCR擴(kuò)增區(qū)；4）產(chǎn)物分析區(qū)。雖然

26、上述操作是分開的，但是還要注意儀器設(shè)備和耗材的專用及操作人員、物流的單方向流動(dòng)。如使用擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物檢測(cè)同時(shí)完成的熒光定量PCR方法或全自動(dòng)PCR分析儀時(shí)，3）、4）兩個(gè)區(qū)可以合并。6.2分裝試劑    試劑的分裝是預(yù)防、控制PCR污染的一項(xiàng)重要措施。PCR所用的去離子水和緩沖液均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓滅菌，由于引物和dNTP不能高壓，一定要用高壓過(guò)的去離子水進(jìn)行配制，所有這些試劑均應(yīng)在無(wú)待測(cè)樣品和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑準(zhǔn)備和儲(chǔ)存區(qū)進(jìn)行制備，分裝貯存；同樣，用于PCR檢測(cè)的引物也應(yīng)在以上環(huán)境中進(jìn)行稀釋、分裝，每管標(biāo)記批次。6.3改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作   

27、盡管上次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的遺留污染是大多數(shù)假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，但樣品之間的交叉污染也是污染的原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)謹(jǐn)慎操作，在樣品處理的所有環(huán)節(jié)（從樣品收集到靶核酸提?。┒紤?yīng)注意，下面幾點(diǎn)應(yīng)格外引起重視：    a)加樣器最易受樣品核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠的污染，試劑準(zhǔn)備、樣品準(zhǔn)備和擴(kuò)增產(chǎn)物分析等各步驟中的加樣器應(yīng)嚴(yán)格分開使用；    b)戴一次性手套進(jìn)行操作，在進(jìn)出不同的隔離區(qū)時(shí)都要換手套；    c)避免反應(yīng)液的飛濺，開蓋時(shí)尤應(yīng)注意，可予開蓋前離心幾秒鐘使壁上和蓋上的反應(yīng)液集于管底，一旦飛濺，

28、應(yīng)立即更換手套；    d)用一次性移液器或吸頭進(jìn)行操作，吸頭不要暴露于空氣，以預(yù)防擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠的污染；    e)在操作多份樣品時(shí)，要制備反應(yīng)混合液，先加可混合的組分(dNTP、緩沖液、引物和酶等)，混合后再分裝到不同的反應(yīng)管，這樣，可以減少操作，避免污染，增加反應(yīng)的重復(fù)性；    f)最后加入模板，加入后立即益緊反應(yīng)管；    g)用過(guò)的加樣器吸頭必須放人專門的消毒（如含次氯酸鈉溶液）的容器內(nèi)，實(shí)驗(yàn)桌椅表面每次工作后都應(yīng)進(jìn)行清潔，實(shí)驗(yàn)材料如出現(xiàn)外濺則必須作出記錄。6.4

29、設(shè)立陽(yáng)性與陰性對(duì)照    選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇特異性擴(kuò)增條帶較弱、重復(fù)性較好的樣品；陰性對(duì)照應(yīng)最后配制，這樣，可以反映擴(kuò)增反應(yīng)的基本狀況。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)設(shè)立包括PCR體系各試劑的空白對(duì)照，空白對(duì)照中應(yīng)含有除模板核酸外的所有組分。6.5環(huán)境污染    常見的污染源包括：加樣器、離心機(jī)、真空瓶、電泳裝置、紫外燈箱、水浴鍋、冰箱門把手、門把手和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面（生物安全柜）、空氣氣溶膠等，各區(qū)的工作臺(tái)面工作前可先用0.5%次氯酸鈉、再用70%乙醇擦拭。6.6擴(kuò)增產(chǎn)物的滅活及污染的處理    尿嘧啶DNA糖基化酶(

30、UNG)法；該法是在PCR反應(yīng)中用脫氧尿嘧啶堿基(dU)置換脫氧胸腺嘧啶(dT)，這樣，擴(kuò)增產(chǎn)物中含有幾十或幾百的dU，這種產(chǎn)物與UNG一起孵育后，因UNG可裂艇尿嘧啶堿基和戊糖磷酸骨架間的N。糖苷鍵，可除去dU，產(chǎn)生數(shù)十或數(shù)百的無(wú)dU堿基位點(diǎn)，無(wú)dU的位點(diǎn)阻止Taq DNA聚合酶的鏈延伸作用，使其失去再擴(kuò)增的能力，而且，這樣的位點(diǎn)是熱不穩(wěn)定的，在熱循環(huán)中會(huì)發(fā)生斷裂，防止再次擴(kuò)增的發(fā)生，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物越長(zhǎng)，UNG抗污染的效率就越高。UNG對(duì)不含dU的模板無(wú)任何影響，對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子也無(wú)任何作用。    光化學(xué)滅活：滅活PCR擴(kuò)增產(chǎn)物另一個(gè)可選擇的

31、方法是應(yīng)用可溶性的補(bǔ)骨脂素衍生物，這些化合物具有熱穩(wěn)定性，對(duì)引物退火和Taq DNA聚合酶的活性無(wú)影響。擴(kuò)增前，將補(bǔ)骨脂素衍生物加入到PCR反應(yīng)混合液中，擴(kuò)增后，在打開反應(yīng)管盞之前，用長(zhǎng)波紫外線照射，紫外線能穿透聚丙烯管。激活補(bǔ)骨脂素衍生物，補(bǔ)骨脂素衍生物隨后形成環(huán)丁烷，與擴(kuò)增產(chǎn)物DNA上的嘧啶作用，形成帶有嘧啶堿基的環(huán)戊烷，阻止Taq DNA聚合酶對(duì)這一分子的進(jìn)一步擴(kuò)增，其效率取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度和核苷酸的堿基組成，一般而言，產(chǎn)物長(zhǎng)度超過(guò)300bp、堿基G+C含量大于50%時(shí)，本法幾乎可滅活所有的擴(kuò)增產(chǎn)物。和酶法滅活不同，該方法不僅可滅活擴(kuò)增產(chǎn)物，而且可滅活原始的靶核酸。7質(zhì)量控制 

32、;   進(jìn)行PCR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)經(jīng)過(guò)檢查并符合國(guó)家行政部門的相關(guān)認(rèn)證要求，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的合格上崗人員進(jìn)行操作。有條件的實(shí)驗(yàn)窒還應(yīng)積極參加各級(jí)質(zhì)控機(jī)構(gòu)和組織的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，這樣，有利于對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行同比分析。7.1  擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)量控制  樣品準(zhǔn)備的質(zhì)量控制    設(shè)計(jì)一個(gè)樣品處理方法最先應(yīng)考慮的問(wèn)題是：能夠最有效地分離出靶核酸并避免導(dǎo)入抑制因子和污染物，避免靶核酸被核酸酶降解并除去干擾檢測(cè)的物質(zhì)，設(shè)立這部分的對(duì)照必須能夠反映以下問(wèn)題，即，在樣品中是否有靶核酸以及核酸的分離方式是否影響PCR反應(yīng)。當(dāng)驗(yàn)證一個(gè)實(shí)驗(yàn)系

33、統(tǒng)的樣品處理方法時(shí)，需要用含靶核酸的整個(gè)有機(jī)體、以接近預(yù)期的檢測(cè)極限濃度添加至陰性樣品基質(zhì)中，這樣，所設(shè)立的對(duì)照可提供有關(guān)靶有機(jī)體溶解及靶核酸提取回收是否成功的有關(guān)信息，如果靶核酸存在于細(xì)胞內(nèi)（如淋巴細(xì)胞），就應(yīng)以整個(gè)細(xì)胞作為驗(yàn)證樣品加入陰性基質(zhì)中作為對(duì)照。7.1.2設(shè)立外對(duì)照  每次實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)有弱陽(yáng)性對(duì)照和一份陰性對(duì)照，以確定擴(kuò)增的有效性。7.1.3設(shè)立內(nèi)對(duì)照    利用內(nèi)對(duì)照可驗(yàn)證每個(gè)單份樣品中是否含有核酸，例如人類的HLA-DQAI、-微球蛋白基因和其他一些保守序列，這些基因存在于樣品的有核細(xì)胞中，可將其與靶核酸擴(kuò)增體系一起擴(kuò)增。在設(shè)計(jì)擴(kuò)增和檢測(cè)

34、基因突變時(shí)，可在突變區(qū)之外，同時(shí)擴(kuò)增保守區(qū)序列作為對(duì)照。7.1.4設(shè)立平行組    兩份病人樣品，其中一份加入已知的核酸作為副本，加入量應(yīng)臨近可檢測(cè)到的極限濃度，如果正本PCR結(jié)果為陰性，而副本為陽(yáng)性，則可確定其陰性結(jié)果是真實(shí)的。7.1.5樣品的稀釋    對(duì)制備的樣品進(jìn)行幾個(gè)稀釋度的稀釋，來(lái)檢測(cè)抑制因子的存在，當(dāng)樣品稀釋后，檢測(cè)到的信號(hào)持續(xù)變強(qiáng)，說(shuō)明有抑制因子存在，只要樣品中存在有抑制因子，就應(yīng)考慮進(jìn)行樣品稀釋。但樣品稀釋后靶核酸也被同時(shí)稀釋，因此，必須注意確保稀釋過(guò)程中靶核酸仍保持在具有臨床檢測(cè)意義的范圍之內(nèi)。7.2抑制因子和干擾

35、物的質(zhì)控    在臨床樣品中有多種成分通過(guò)與PCR反應(yīng)組分發(fā)生作用，從而抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)。已知血紅素及其代謝物可抑制DNA聚合酶的活性，腦脊液、尿液中也含有成分尚未確定的DNA聚合酶的抑制因子，痰液中的酸性多糖、糖蛋白組分是聚合酶的抑制因子；臨床樣品中含有的核酸酶，會(huì)降解靶核酸。另外，許多分子生物學(xué)研究巾常用的試劑，如乙二胺四乙酸、去污劑（如十二烷磺酸鈉）、破膜荊（如鹽酸胍）等對(duì)DNA聚合酶的活性也有一定抑制作用，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。    擴(kuò)增反應(yīng)的抑制因子可通過(guò)應(yīng)用對(duì)照模板來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)，這種對(duì)照模板可在樣品準(zhǔn)備過(guò)程中加入（

36、如內(nèi)對(duì)照），因此也可作為靶核酸提取過(guò)程的對(duì)照（見7.1.3）。設(shè)立內(nèi)對(duì)照來(lái)監(jiān)測(cè)是否存在抑制反應(yīng)應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要而定，因?yàn)榻⒑蛻?yīng)用這些內(nèi)對(duì)照有相當(dāng)?shù)募夹g(shù)難度，并且可能會(huì)影響到整個(gè)實(shí)驗(yàn)。7.2.1同源內(nèi)對(duì)照    同源內(nèi)對(duì)照基因與擴(kuò)增的目的靶基因有相似的序列，它們通過(guò)分子大小的差別或內(nèi)部序列的不同相互區(qū)別。同源內(nèi)對(duì)照可以與目的靶基因二起應(yīng)用相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)照模板先加入到反應(yīng)混合液中，每個(gè)反應(yīng)提供10到1 000個(gè)拷貝，用同源引物進(jìn)行擴(kuò)增。但必須注意保證同源內(nèi)對(duì)照的存在不能降低擴(kuò)增體系的敏感性，假如一起擴(kuò)增的內(nèi)對(duì)照模板量太多的話，往往會(huì)降低目的基因擴(kuò)增的敏感性。含

37、抑制物的樣品，如不支持對(duì)內(nèi)對(duì)照的擴(kuò)增，那么很可能也不會(huì)支持對(duì)靶核酸序列的擴(kuò)增，樣品就應(yīng)被視為不適于進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或需要進(jìn)一步處理以減少或清除抑制因子。通常簡(jiǎn)單地將樣品稀釋就會(huì)降低，抑制因子的影響，此時(shí)要注意樣品不能過(guò)度稀釋，以致靶核酸被稀釋到檢測(cè)限度之下。7.2.2異源內(nèi)對(duì)照    異源內(nèi)對(duì)照不包含靶序列，需要用另一組獨(dú)立的引物來(lái)擴(kuò)增對(duì)照基因。異源內(nèi)對(duì)照通常采用人類HLA-DQAI和人類-微球蛋白位點(diǎn)基因，任意靶核酸一般都可滿足需要。對(duì)照組擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量應(yīng)與目的靶基因大小相同或更大，以保證更小分子量的任何產(chǎn)物都能被成功擴(kuò)增。7.3儀器的質(zhì)量控制 &#

38、160;  所有的儀器設(shè)備都必須保持清潔并進(jìn)行定期維護(hù)，所有的水浴裝置、培養(yǎng)箱都應(yīng)貼有適當(dāng)溫度范圍的質(zhì)量控制表，記錄每天的溫度。在實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證(Quality Assurance，QA)手冊(cè)中應(yīng)有儀器校對(duì)的操作方法。  a)加樣槍，加樣槍必須保證每年校正兩次，校正方法可參考生產(chǎn)廠商推薦的方法或采取吸樣稱重法；    b)水浴箱：實(shí)驗(yàn)前用溫度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)；    c)離心機(jī)：離心機(jī)的速度每年應(yīng)檢查兩次，離心機(jī)可能是污染的重要來(lái)源，應(yīng)注意采取必要的預(yù)防措施；    d)酶標(biāo)儀：每年進(jìn)行兩

39、次校準(zhǔn)；    e)熱循環(huán)儀：目前各實(shí)驗(yàn)室使用的熱循環(huán)儀有許多不同的種類和型號(hào)，可根據(jù)生產(chǎn)廠商推薦的方法進(jìn)行校正，一年內(nèi)至少對(duì)儀器校正兩次I除儀器的自檢功能外，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行循環(huán)參數(shù)的校正和功能性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同部位的加熱孔應(yīng)保證其溫度的均一性。7.4校正測(cè)試    校正測(cè)試是用來(lái)確保臨床實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和評(píng)價(jià)臨床實(shí)驗(yàn)室的操作技能。每一個(gè)檢測(cè)臨床樣品的實(shí)驗(yàn)室都需要作校正測(cè)試，并以此來(lái)確定實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行某一特定實(shí)驗(yàn)的能力。每年應(yīng)至少進(jìn)行兩到三次校正測(cè)試，每次實(shí)驗(yàn)的間隔要相等，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少5個(gè)樣品，所提供的樣品必須覆蓋整個(gè)反應(yīng)范圍，從強(qiáng)陽(yáng)性反

40、應(yīng)到陰性反應(yīng)，由實(shí)驗(yàn)室日常進(jìn)行PCR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)人員按實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)要求進(jìn)行操作。一般來(lái)說(shuō)，校正實(shí)驗(yàn)所用樣品與臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)樣品的類型應(yīng)相同或組成成份相似，即全血、血漿、血清、尿、腦脊液或組織樣品等。校正測(cè)試樣品可以從相關(guān)部門（如各級(jí)室間質(zhì)評(píng)機(jī)構(gòu)和組織）獲得，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)的校正測(cè)試樣品，已有的商品試劑盒中的對(duì)照樣品是一個(gè)重要來(lái)源。8結(jié)果的判讀、報(bào)告和解釋8.1一般考慮    與其他檢測(cè)方法相比，PCR的檢測(cè)下限很低，因此，應(yīng)當(dāng)明確如此低的檢測(cè)限度的臨床意義及結(jié)果的解釋標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)對(duì)該疾病已經(jīng)做過(guò)的其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與PCR檢驗(yàn)結(jié)果之間的一致性和差異性進(jìn)行比較，闡明PC

41、R技術(shù)相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)越性和PCR技術(shù)的合理應(yīng)用等。例如，臨床樣品中結(jié)核桿菌的直接PCR檢測(cè)，仍需進(jìn)行常規(guī)的涂片顯微鏡鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)來(lái)確定PCR檢測(cè)的敏感性，并鑒定不同種群的重疊感染。8.2不能確定的結(jié)果    PCR實(shí)驗(yàn)和其他臨床實(shí)驗(yàn)一樣，可能有不能確定的結(jié)果，這些結(jié)果將反映出樣品的質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)方法的影響。因此，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)應(yīng)當(dāng)有一個(gè)明確的結(jié)果判讀方式，并對(duì)不能確定結(jié)果的樣品有適當(dāng)?shù)啮w釋和處理方法，例如，重復(fù)取樣、重復(fù)實(shí)驗(yàn)或反向?qū)嶒?yàn)等。在任何診斷實(shí)驗(yàn)中，都會(huì)有很小百分率的健康人群的檢驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為陽(yáng)性或異常，因此，重復(fù)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)經(jīng)常應(yīng)用的重要策略。

42、8.3結(jié)果的報(bào)告  雖然擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)有嚴(yán)格的自身控制，但如果沒有經(jīng)過(guò)細(xì)致的審查，錯(cuò)誤結(jié)果還是會(huì)報(bào)告出來(lái)，審查人員應(yīng)仔細(xì)檢查每一個(gè)待報(bào)告的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)步驟中必須包括結(jié)果的解釋標(biāo)準(zhǔn)，包括對(duì)不可確定結(jié)果的解釋標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)已商品化的PCR診斷試劑盒，有關(guān)信息必須由生產(chǎn)廠商提供。臨床實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)對(duì)本醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)受試人群實(shí)驗(yàn)結(jié)果的及時(shí)報(bào)告和解釋；臨床醫(yī)生在綜合考慮其他可利用的臨床信息后，負(fù)責(zé)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床解釋，臨床和實(shí)驗(yàn)室的溝通對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理、有效的應(yīng)用是十分重要的。8.4對(duì)不合格樣品的處理    如果實(shí)驗(yàn)室收到的樣品不宜用于檢測(cè)，必須馬上通知樣品呈送單位，對(duì)運(yùn)送方法不當(dāng)、送

43、達(dá)時(shí)間過(guò)遲及數(shù)量不足的樣品應(yīng)拒絕接收。8.5結(jié)果回報(bào)時(shí)間    實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定回報(bào)時(shí)間的規(guī)定，并對(duì)延誤報(bào)告的原因進(jìn)行分析。附錄A（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）定量PCR技術(shù)    定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)對(duì)靶核酸進(jìn)行量化檢測(cè)來(lái)反映靶核酸量的變化與臨床疾病的關(guān)系，并可用于檢測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展，考察治療藥物的療效等。A1定量PCR技術(shù)的方法學(xué)    定量PCR技術(shù)一般通過(guò)定量分析擴(kuò)增產(chǎn)物的量的多少來(lái)判斷待測(cè)樣品中初始靶核酸模板的拷貝數(shù)，目前常用以下幾種方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行量化檢測(cè)。

44、A1.1競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)量化檢測(cè)核酸技術(shù)    基本原理：具有相同引物結(jié)合區(qū)的兩種模板在同一管中擴(kuò)增可得到幾乎相同的擴(kuò)增效果。初始含量多的模板，其擴(kuò)增產(chǎn)物就多，兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量與二者初始核酸模板含量的比值有相關(guān)性；其中一種核酸為已知含量的內(nèi)參照模板，而另一種核酸為待測(cè)樣品，同時(shí)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，因?yàn)榇郎y(cè)核酸與內(nèi)參照擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小或序列不同，因此可通過(guò)凝膠電泳或探針雜交等方法進(jìn)行檢測(cè)，從而得到兩種核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的比值，而初始內(nèi)參照的模板量是已知的。根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以推算出待測(cè)核酸的初始含量。本方法將內(nèi)參照模板與樣品靶核酸模板放在同一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)

45、增，保證兩者在同等的反應(yīng)條件下，避免了管與管之間的差異，是一種靈敏度較高、能比較客觀反映樣品初始狀態(tài)時(shí)靶核酸模板含量的方法；但該方法由于存在內(nèi)參照模板與樣品模板長(zhǎng)度的差異以及最小二級(jí)結(jié)構(gòu)不完全相同等影響因素，因此二者的擴(kuò)增效率不可能完全一致。A1.2自動(dòng)化熒光檢測(cè)法    擴(kuò)增體系所采用的引物除具有退火、延伸功能外，還包含有兩段額外基因，一段為信號(hào)基因(re-porter)，單獨(dú)存在時(shí)可以發(fā)光；另一段為抑制基因(quencher)，其存在時(shí)可抑制信號(hào)基因的功能，不產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，由于Taq酶具有一定的5端外切酶活性，可將引物上的信號(hào)基因切下、失

46、去抑制基因的抑制作用而產(chǎn)生熒光，每當(dāng)一次擴(kuò)增中一條引物被退火、延伸后，整個(gè)體系就會(huì)增加一個(gè)單位的熒光。該擴(kuò)增儀在每一次擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后都要通過(guò)熒光光度計(jì)進(jìn)行掃描，由此可得出每一次擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后產(chǎn)物的量。A1.3固相雜交酶免疫法量化檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物    使用酶免疫法(EIA)量化檢測(cè)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，是目前應(yīng)用較為普遍的核酸量化檢測(cè)手段，如應(yīng)用生物素標(biāo)記引物，這樣在PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物帶有生物素成分，隨后通過(guò)包被子酶標(biāo)微孔板上的鏈親和素（包被蛋白）將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲到固相載體上，解鏈變性后加入FITC標(biāo)記的特異性探針雜交成DNA雙鏈，再加入辣根酶標(biāo)記的FITC抗體使底物顯色，通過(guò)顯色反應(yīng)顏色的深淺來(lái)量化反映樣品中核酸模板的情況。或?qū)⑻禺愋蕴结槹蛔庸滔噍d體上（包被探針）。通過(guò)雜交反應(yīng)將標(biāo)記有生物素的產(chǎn)物固定在酶標(biāo)微孔板上，再加入辣根酶標(biāo)記的鏈親和素-利用顯色反應(yīng)顯示待測(cè)樣品中核酸模板的情況。這兩種方法靈敏度較高、特異性好、可以避免因PCR非特異擴(kuò)增引起的假陽(yáng)性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本不高，更有利于推廣和普及。但由于PCR體系不同管之間不同的模板提取效率、逆轉(zhuǎn)錄效率、擴(kuò)增效率等因素的影響，酶標(biāo)結(jié)果并不能完全客觀地表示模板含量，而且酶免疫顯色反應(yīng)的線