高效液相色譜儀的定性定量分析未知樣品中苯甲酸含量的測定演示教學(xué)

1、高效液相色譜儀的定性定量分析未知樣品中苯甲酸含量的測定 二。實(shí)驗(yàn)原理：二。實(shí)驗(yàn)原理： 高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，（的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，（經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法使用粗粒使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃管柱內(nèi)，流動(dòng)相僅靠重力多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃管柱內(nèi)，流動(dòng)相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度極其緩慢，柱入流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度極其緩慢，柱入口壓力低，僅有低的柱效，分析時(shí)間長；口壓力低，僅有低的柱效，分析時(shí)間長；氣相色譜氣相色譜原

2、理類似，原理類似，流動(dòng)相為氣體，只能分離小分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，配流動(dòng)相為氣體，只能分離小分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，配合程序升溫可分析高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物。）彌補(bǔ)了經(jīng)典液相色合程序升溫可分析高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物。）彌補(bǔ)了經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜的缺點(diǎn)。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小譜法和氣相色譜的缺點(diǎn)。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過高壓輸液泵進(jìn)入高壓的色譜口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過高壓輸液泵進(jìn)入高壓的色譜柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，從而在短時(shí)間內(nèi)柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得高的分離能力。獲得高的分離能力?？煞治?/p>

3、低分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，可分析低分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，更多適用于分析中、高分子量、高沸點(diǎn)及熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化更多適用于分析中、高分子量、高沸點(diǎn)及熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物合物。由于由于80%的有機(jī)化合物都可以用高效液相色譜法分析的有機(jī)化合物都可以用高效液相色譜法分析，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境檢測、石油化工等行業(yè)。環(huán)境檢測、石油化工等行業(yè)。 根據(jù)使用的根據(jù)使用的固定相及流動(dòng)相固定相及流動(dòng)相的極性不同，分為的極性不同，分為正相正相液相色譜和反相液相色譜液相色譜和反相液相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極：固定相為極

4、性，流動(dòng)相為非極性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧化鎂，流動(dòng)相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動(dòng)化鎂，流動(dòng)相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動(dòng)相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳粒和氧化鋁，流動(dòng)相為水、醇等）。粒和氧化鋁，流動(dòng)相為水、醇等）。（1）定性分析：）定性分析： 液相色譜法可以分離有機(jī)化合物，在分配色譜中，組分在液相色譜法可以分離有機(jī)化合物，在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度取決于它們在固定相和流動(dòng)相中的分配系色譜柱上的保留程度取決于它們在固定相

5、和流動(dòng)相中的分配系數(shù)數(shù)K：K=（組分在固定相中的濃度）（組分在固定相中的濃度）/（組分在流動(dòng)相中的濃度）（組分在流動(dòng)相中的濃度） 顯然，顯然，K值越大，組分在固定相上的停留時(shí)間越長，容易值越大，組分在固定相上的停留時(shí)間越長，容易理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)，理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)，K值越大停留的時(shí)間也越長，值越大停留的時(shí)間也越長，K值值越小，停留的時(shí)間也越短，由于組分在固定相的越小，停留的時(shí)間也越短，由于組分在固定相的K不同，就會(huì)不同，就會(huì)出現(xiàn)差速遷移，從而達(dá)到分離的目的。出現(xiàn)差速遷移，從而達(dá)到分離的目的。 一般情況下，當(dāng)一般情況下，當(dāng)外界條件及方法外界條件及方法確定，溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)確定，溶質(zhì)流經(jīng)

6、色譜柱時(shí)，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時(shí)間不一致，在檢測器上，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時(shí)間不一致，在檢測器上得到響應(yīng)，表現(xiàn)為出峰時(shí)間不一致，同一組分（得到響應(yīng)，表現(xiàn)為出峰時(shí)間不一致，同一組分（K值固定），值固定），保留時(shí)間保留時(shí)間To一致，一致，根據(jù)這個(gè)特性，可以分離不同的有機(jī)化合根據(jù)這個(gè)特性，可以分離不同的有機(jī)化合物物。（2）定量分析（）定量分析（ESTD法）：法）： 用高效液相色譜法測定未知樣品中的苯甲酸含量，將用高效液相色譜法測定未知樣品中的苯甲酸含量，將已配置濃度不同的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液也進(jìn)入色譜系統(tǒng)，已配置濃度不同的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液也進(jìn)入色譜系統(tǒng)，繪制繪制濃度濃度峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7、峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如流速和泵的壓力在整個(gè)實(shí)如流速和泵的壓力在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中是恒定的，測定它們在色譜圖上的保留時(shí)間驗(yàn)過程中是恒定的，測定它們在色譜圖上的保留時(shí)間 （T0或保留距離）和峰面積或保留距離）和峰面積A后，可直接用后，可直接用 T0 定性，用峰定性，用峰面積作為定量測定的參數(shù)，面積作為定量測定的參數(shù)，注入未知樣品后，得知未知樣注入未知樣品后，得知未知樣品的峰面積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出未知樣中的苯甲酸的含量品的峰面積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出未知樣中的苯甲酸的含量。三儀器和試劑三儀器和試劑：1 高效液相色譜儀，高效液相色譜儀，VWD（254nm）檢測儀。）檢測儀。2色譜柱：色譜柱：C183超聲波發(fā)生器

8、或水泵超聲波發(fā)生器或水泵(用于過濾或排氣用于過濾或排氣)4注射器：注射器：50微升微升5容量瓶：容量瓶：100ml若干若干6移液管：移液管：2ml、4ml、8ml7流動(dòng)相：甲醇：乙酸流動(dòng)相：甲醇：乙酸+乙酸氨（乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制備前，先調(diào)節(jié)水制備前，先調(diào)節(jié)水(用酸或緩沖鹽用酸或緩沖鹽)的的PH=3.5，進(jìn)入系統(tǒng)，進(jìn)入系統(tǒng)色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。四實(shí)驗(yàn)步驟四實(shí)驗(yàn)步驟：（ESTD法）1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置：準(zhǔn)確量?。簻?zhǔn)確量取0.144克苯甲酸鈉試劑克苯甲酸鈉試劑，用純水或去離子水溶解，定容到，用純水或去離子水溶解，定容到

9、100毫升，濃度為毫升，濃度為1.44mg/ml. 分別取此標(biāo)準(zhǔn)液分別取此標(biāo)準(zhǔn)液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀稀釋為釋為10 ml，則濃度分別為，則濃度分別為0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。2 打開計(jì)算機(jī)，開儀器，穩(wěn)定后，打開桌面的打開計(jì)算機(jī)，開儀器，穩(wěn)定后，打開桌面的ONLINE工作站。工作站。 設(shè)定方法設(shè)定方法：設(shè)置泵的流速為：設(shè)置泵的流速為1ml/min，柱溫為室溫（，柱溫為室溫（40度左右），停止時(shí)間為度左右），停止時(shí)間為4min，流動(dòng)相比例（甲醇：水，流動(dòng)相比例（甲醇：水=60；40），當(dāng)流動(dòng)相通過色譜柱

10、約），當(dāng)流動(dòng)相通過色譜柱約5-10min，記錄儀上基，記錄儀上基線穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣。線穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣。3 進(jìn)樣：進(jìn)樣閥進(jìn)樣：進(jìn)樣閥放在裝載的位置上，用注射器取放在裝載的位置上，用注射器取25微升微升濃度最低的標(biāo)準(zhǔn)樣（比進(jìn)樣閥上的定量環(huán)多濃度最低的標(biāo)準(zhǔn)樣（比進(jìn)樣閥上的定量環(huán)多5-10微升以上微升以上），注入進(jìn)樣閥中。），注入進(jìn)樣閥中。4進(jìn)樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進(jìn)樣位，同時(shí)按進(jìn)樣按扭，工作站進(jìn)樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進(jìn)樣位，同時(shí)按進(jìn)樣按扭，工作站開始記錄并出圖開始記錄并出圖11。5苯甲酸的色譜峰出完后，按照苯甲酸的色譜峰出完后，按照4-5步驟連續(xù)操作四次，步驟連續(xù)操作四次，獲得從最低濃度到最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)試液的五張

11、色譜圖，分獲得從最低濃度到最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)試液的五張色譜圖，分別為別為11，12，13，14，15（15為流動(dòng)相進(jìn)樣，設(shè)濃度為為流動(dòng)相進(jìn)樣，設(shè)濃度為0 mg/ml）。）。6按照按照4-5步驟取步驟取25微升的未知樣品，進(jìn)樣，出譜圖微升的未知樣品，進(jìn)樣，出譜圖W1。六數(shù)據(jù)分析六數(shù)據(jù)分析1. 1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中的保留時(shí)間，找到并標(biāo)出飲根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中的保留時(shí)間，找到并標(biāo)出飲料色譜圖中的苯甲酸的色譜峰位置。料色譜圖中的苯甲酸的色譜峰位置。2根據(jù)圖根據(jù)圖11，12，13，14，15的濃度和峰面積，作苯的濃度和峰面積，作苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知中苯甲酸的濃在標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知中苯甲酸的濃度。度。七問題討論七問題討論1用框架圖畫出用框架圖畫出HP1100液相色譜儀的構(gòu)造流程。液相色譜儀的構(gòu)造流程。2用正相色譜柱可以進(jìn)行苯甲酸的定性和定量分