高效液相色譜儀的定性定量分析未知樣品中苯甲酸含量的測定演示教學

1、高效液相色譜儀的定性定量分析未知樣品中苯甲酸含量的測定 二。實驗原理：二。實驗原理： 高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜和氣相色譜的基礎上發(fā)展起來的，（的基礎上發(fā)展起來的，（經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法使用粗粒使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃管柱內(nèi)，流動相僅靠重力多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃管柱內(nèi)，流動相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴散速度極其緩慢，柱入流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴散速度極其緩慢，柱入口壓力低，僅有低的柱效，分析時間長；口壓力低，僅有低的柱效，分析時間長；氣相色譜氣相色譜原

2、理類似，原理類似，流動相為氣體，只能分離小分子量、低沸點的有機化合物，配流動相為氣體，只能分離小分子量、低沸點的有機化合物，配合程序升溫可分析高沸點的有機化合物。）彌補了經(jīng)典液相色合程序升溫可分析高沸點的有機化合物。）彌補了經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜的缺點。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小譜法和氣相色譜的缺點。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動相通過高壓輸液泵進入高壓的色譜口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動相通過高壓輸液泵進入高壓的色譜柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴散速度大大加快，從而在短時間內(nèi)柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴散速度大大加快，從而在短時間內(nèi)獲得高的分離能力。獲得高的分離能力?？煞治?/p>

3、低分子量、低沸點的有機化合物，可分析低分子量、低沸點的有機化合物，更多適用于分析中、高分子量、高沸點及熱穩(wěn)定性差的有機化更多適用于分析中、高分子量、高沸點及熱穩(wěn)定性差的有機化合物合物。由于由于80%的有機化合物都可以用高效液相色譜法分析的有機化合物都可以用高效液相色譜法分析，目前已經(jīng)廣泛應用于，目前已經(jīng)廣泛應用于生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境檢測、石油化工等行業(yè)。環(huán)境檢測、石油化工等行業(yè)。 根據(jù)使用的根據(jù)使用的固定相及流動相固定相及流動相的極性不同，分為的極性不同，分為正相正相液相色譜和反相液相色譜液相色譜和反相液相色譜：固定相為極性，流動相為非極：固定相為極

4、性，流動相為非極性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧化鎂，流動相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動化鎂，流動相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳粒和氧化鋁，流動相為水、醇等）。粒和氧化鋁，流動相為水、醇等）。（1）定性分析：）定性分析： 液相色譜法可以分離有機化合物，在分配色譜中，組分在液相色譜法可以分離有機化合物，在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度取決于它們在固定相和流動相中的分配系色譜柱上的保留程度取決于它們在固定相

5、和流動相中的分配系數(shù)數(shù)K：K=（組分在固定相中的濃度）（組分在固定相中的濃度）/（組分在流動相中的濃度）（組分在流動相中的濃度） 顯然，顯然，K值越大，組分在固定相上的停留時間越長，容易值越大，組分在固定相上的停留時間越長，容易理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時，理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時，K值越大停留的時間也越長，值越大停留的時間也越長，K值值越小，停留的時間也越短，由于組分在固定相的越小，停留的時間也越短，由于組分在固定相的K不同，就會不同，就會出現(xiàn)差速遷移，從而達到分離的目的。出現(xiàn)差速遷移，從而達到分離的目的。 一般情況下，當一般情況下，當外界條件及方法外界條件及方法確定，溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時確定，溶質(zhì)流經(jīng)

6、色譜柱時，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時間不一致，在檢測器上，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時間不一致，在檢測器上得到響應，表現(xiàn)為出峰時間不一致，同一組分（得到響應，表現(xiàn)為出峰時間不一致，同一組分（K值固定），值固定），保留時間保留時間To一致，一致，根據(jù)這個特性，可以分離不同的有機化合根據(jù)這個特性，可以分離不同的有機化合物物。（2）定量分析（）定量分析（ESTD法）：法）： 用高效液相色譜法測定未知樣品中的苯甲酸含量，將用高效液相色譜法測定未知樣品中的苯甲酸含量，將已配置濃度不同的苯甲酸標準溶液也進入色譜系統(tǒng)，已配置濃度不同的苯甲酸標準溶液也進入色譜系統(tǒng)，繪制繪制濃度濃度峰面積的標準曲線。

7、峰面積的標準曲線。如流速和泵的壓力在整個實如流速和泵的壓力在整個實驗過程中是恒定的，測定它們在色譜圖上的保留時間驗過程中是恒定的，測定它們在色譜圖上的保留時間 （T0或保留距離）和峰面積或保留距離）和峰面積A后，可直接用后，可直接用 T0 定性，用峰定性，用峰面積作為定量測定的參數(shù)，面積作為定量測定的參數(shù)，注入未知樣品后，得知未知樣注入未知樣品后，得知未知樣品的峰面積，查標準曲線，求出未知樣中的苯甲酸的含量品的峰面積，查標準曲線，求出未知樣中的苯甲酸的含量。三儀器和試劑三儀器和試劑：1 高效液相色譜儀，高效液相色譜儀，VWD（254nm）檢測儀。）檢測儀。2色譜柱：色譜柱：C183超聲波發(fā)生器

8、或水泵超聲波發(fā)生器或水泵(用于過濾或排氣用于過濾或排氣)4注射器：注射器：50微升微升5容量瓶：容量瓶：100ml若干若干6移液管：移液管：2ml、4ml、8ml7流動相：甲醇：乙酸流動相：甲醇：乙酸+乙酸氨（乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制備前，先調(diào)節(jié)水制備前，先調(diào)節(jié)水(用酸或緩沖鹽用酸或緩沖鹽)的的PH=3.5，進入系統(tǒng)，進入系統(tǒng)色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。四實驗步驟四實驗步驟：（ESTD法）1 標準儲備液的配置標準儲備液的配置：準確量?。簻蚀_量取0.144克苯甲酸鈉試劑克苯甲酸鈉試劑，用純水或去離子水溶解，定容到，用純水或去離子水溶解，定容到

9、100毫升，濃度為毫升，濃度為1.44mg/ml. 分別取此標準液分別取此標準液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀稀釋為釋為10 ml，則濃度分別為，則濃度分別為0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。2 打開計算機，開儀器，穩(wěn)定后，打開桌面的打開計算機，開儀器，穩(wěn)定后，打開桌面的ONLINE工作站。工作站。 設定方法設定方法：設置泵的流速為：設置泵的流速為1ml/min，柱溫為室溫（，柱溫為室溫（40度左右），停止時間為度左右），停止時間為4min，流動相比例（甲醇：水，流動相比例（甲醇：水=60；40），當流動相通過色譜柱

10、約），當流動相通過色譜柱約5-10min，記錄儀上基，記錄儀上基線穩(wěn)定后，開始進樣。線穩(wěn)定后，開始進樣。3 進樣：進樣閥進樣：進樣閥放在裝載的位置上，用注射器取放在裝載的位置上，用注射器取25微升微升濃度最低的標準樣（比進樣閥上的定量環(huán)多濃度最低的標準樣（比進樣閥上的定量環(huán)多5-10微升以上微升以上），注入進樣閥中。），注入進樣閥中。4進樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進樣位，同時按進樣按扭，工作站進樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進樣位，同時按進樣按扭，工作站開始記錄并出圖開始記錄并出圖11。5苯甲酸的色譜峰出完后，按照苯甲酸的色譜峰出完后，按照4-5步驟連續(xù)操作四次，步驟連續(xù)操作四次，獲得從最低濃度到最高濃度的標準試液的五張

11、色譜圖，分獲得從最低濃度到最高濃度的標準試液的五張色譜圖，分別為別為11，12，13，14，15（15為流動相進樣，設濃度為為流動相進樣，設濃度為0 mg/ml）。）。6按照按照4-5步驟取步驟取25微升的未知樣品，進樣，出譜圖微升的未知樣品，進樣，出譜圖W1。六數(shù)據(jù)分析六數(shù)據(jù)分析1. 1. 根據(jù)標準樣品色譜圖中的保留時間，找到并標出飲根據(jù)標準樣品色譜圖中的保留時間，找到并標出飲料色譜圖中的苯甲酸的色譜峰位置。料色譜圖中的苯甲酸的色譜峰位置。2根據(jù)圖根據(jù)圖11，12，13，14，15的濃度和峰面積，作苯的濃度和峰面積，作苯甲酸的標準曲線，甲酸的標準曲線， 在標準曲線，求得未知中苯甲酸的濃在標準曲線，求得未知中苯甲酸的濃度。度。七問題討論七問題討論1用框架圖畫出用框架圖畫出HP1100液相色譜儀的構造流程。液相色譜儀的構造流程。2用正相色譜柱可以進行苯甲酸的定性和定量分