第6章藥物的含量測定

1、MicrosoftMicrosoft第六章 藥物的含量測定藥藥分分 制制藥藥20112011第一第一節(jié)節(jié) 概概述述藥物的含量測定藥物的含量測定 評價藥物質(zhì)量的主要指標。運評價藥物質(zhì)量的主要指標。運用化學、物理或生物化學的方法用化學、物理或生物化學的方法和技術(shù)，測定藥物中主要有效成和技術(shù)，測定藥物中主要有效成分的含量。分的含量。定定義義藥物的含量測定藥物的含量測定化學、物理學、生物學方法化學、物理學、生物學方法方方法法 利用某些生物學特性利用某些生物學特性或特殊反應(yīng)來定性、或特殊反應(yīng)來定性、定量定量化學反應(yīng)化學反應(yīng)如光吸收如光吸收特性、濁特性、濁度度藥物的含量測定藥物的含量測定基于化學或物理學基

2、于化學或物理學原理的原理的含量測定含量測定。分分兩兩類類基于生物學原理的基于生物學原理的效價測定效價測定?；A(chǔ)礎(chǔ)生物檢定法，微生生物檢定法，微生物檢定法，酶法。物檢定法，酶法。目目標標含量測定。含量測定。含量方法要求含量方法要求n化學原料藥（化學原料藥（API)API)：根據(jù)藥物的化學結(jié)構(gòu)、理根據(jù)藥物的化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等特點綜合考慮適宜的含量測定法。選化性質(zhì)等特點綜合考慮適宜的含量測定法。選用的含量測定法應(yīng)能準確測試有效成分的含量，用的含量測定法應(yīng)能準確測試有效成分的含量，其準確度和精密度均高。其準確度和精密度均高。n制劑：制劑：可能時應(yīng)選用與原料藥相同的測定可能時應(yīng)選用與原料藥相同的測定

3、方法，共存藥物、輔料、附加劑有干擾時，方法，共存藥物、輔料、附加劑有干擾時，可考慮增加預(yù)處理或改進方法可考慮增加預(yù)處理或改進方法, ,但專屬性但專屬性要強。要強。 含量表示方法含量表示方法（一）原料藥含量的表示法（一）原料藥含量的表示法原料藥一般以百分含量表示，指樣品中被測成分（一般為活原料藥一般以百分含量表示，指樣品中被測成分（一般為活性物質(zhì)）的百分含量。一般按干燥品計算。性物質(zhì)）的百分含量。一般按干燥品計算。藥典凡例規(guī)定：藥典凡例規(guī)定： “ “按干燥品（或無水物，或無溶劑）計算按干燥品（或無水物，或無溶劑）計算”時，除另有規(guī)定外，應(yīng)取未經(jīng)干燥（或未去水，或未去溶時，除另有規(guī)定外，應(yīng)取未經(jīng)干

4、燥（或未去水，或未去溶劑）的供試品進行試驗，并將計算中的取用量按檢查項下劑）的供試品進行試驗，并將計算中的取用量按檢查項下測得的干燥失重（或水分，或溶劑）扣除。測得的干燥失重（或水分，或溶劑）扣除。因此：含量因此：含量% %（干燥品計）（干燥品計）= =直接測得量直接測得量（1-1-干燥失重）干燥失重）（二）藥物制劑含量的表示法（二）藥物制劑含量的表示法一般以一般以相當于標示量的百分數(shù)表示相當于標示量的百分數(shù)表示，指一個制劑單，指一個制劑單位中平均含有的藥物成分為制劑標準的位中平均含有的藥物成分為制劑標準的“規(guī)格規(guī)格”項規(guī)定量的百分數(shù)。如：對乙酰氨基酚片，規(guī)格項規(guī)定量的百分數(shù)。如：對乙酰氨基酚

5、片，規(guī)格0.5g0.5g，經(jīng)含量測定測得平均每片含對乙酰氨基酚，經(jīng)含量測定測得平均每片含對乙酰氨基酚0.45g0.45g，則標示量為，則標示量為90%90%。固體制劑含量測定結(jié)果的計算固體制劑含量測定結(jié)果的計算 %100% = =標示量標示量每片實測含量每片實測含量含量含量100 平均片重平均片重= = =標示量標示量供試品重供試品重測得量測得量標示量標示量平均片重平均片重供試品重供試品重測得量測得量100 原料藥原料藥制劑制劑 物質(zhì)的量 效價 生物學法（基于生物學原理） 藥物含量測定方法藥物含量測定方法化學法（基于化學原理） 容量分析法、重量分析儀器分析法（基于物理學原理） 光譜法、色譜法具

6、體方法具體方法n容量分析法：容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、包括重量分析法、滴定法（直接、間接滴定法）間接滴定法）n光譜分析法：光譜分析法：UVUV、IRIR、n色譜分析法：色譜分析法：HPLCHPLC、GCGC第二節(jié)、容量分析法第二節(jié)、容量分析法 為經(jīng)典方法，原料藥分析常采用。為經(jīng)典方法，原料藥分析常采用。常產(chǎn)生滴定誤差，如指示劑和儀器容量常產(chǎn)生滴定誤差，如指示劑和儀器容量 特點：特點：n1 1、快速、快速, ,準確（準確（RSD0.2RSD10n103 3 ，n n越越大柱效高大柱效高進樣tRh0.5hWh/2Wt7.7.分離度分離度 R2（tR2tR1）/（W1W2）pR1.5

7、 認為分離完全認為分離完全W1W2TR2-tR1（二）基本原理（二）基本原理 待分離物質(zhì)在兩相間進行分配時，在固定相中溶解度較待分離物質(zhì)在兩相間進行分配時，在固定相中溶解度較小的組分，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定相中溶小的組分，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定相中溶解度較大的組分，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達解度較大的組分，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達到分離的目的。到分離的目的。 依固定相與流動相極性的不同，分為正相色譜和反相色譜依固定相與流動相極性的不同，分為正相色譜和反相色譜1.1.正相色譜法正相色譜法 流動相極性小于固定相流動相極性小于固定相一般用極性物質(zhì)作固定相，非

8、極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動相，主要用于分離極性化合物，極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。2.2.反相色譜法反相色譜法 流動相極性大于固定相流動相極性大于固定相一般用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動相，主要用于分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。（三）固定相和流動相（三）固定相和流動相1.1.固定相固定相 常用化學鍵合相，分極性和非極性鍵合相，如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18或ODS）和辛基硅烷鍵合硅膠（C8）為最常用的非極性鍵合相，用于反相色譜法； 氨基和氰基硅烷鍵合相為常用的極性鍵合相，用于正相色譜法。2.2.流動相流動相 有機

9、溶劑+水混合一般為色譜純試劑，經(jīng)0.45um的微孔濾膜過濾，需脫氣處理 （四）儀器的基本結(jié)構(gòu)（四）儀器的基本結(jié)構(gòu) 1.1.色譜柱色譜柱柱管柱管- -不銹鋼，填充硅膠和化不銹鋼，填充硅膠和化學鍵合固定相學鍵合固定相 內(nèi)徑內(nèi)徑4.6mm4.6mm長長15cm15cm、20cm20cm和和25cm25cm的三種，的三種，如安捷倫色譜柱、如安捷倫色譜柱、 WatersWaters色色譜柱、迪馬色譜柱等。譜柱、迪馬色譜柱等。 2.2.檢測器檢測器常用紫外檢測器常用紫外檢測器其次有二極管陣列檢測器其次有二極管陣列檢測器(DAD)(DAD)熒光檢測器熒光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢側(cè)器蒸發(fā)

10、光散射檢側(cè)器電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器等電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器等 （五）（五） 系統(tǒng)適用性試驗系統(tǒng)適用性試驗定義：指用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進行試驗，定義：指用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進行試驗，應(yīng)符合要求。應(yīng)符合要求。包括包括柱溫、柱長、固定相、流動相；理論板數(shù)：說明分離過程，色譜柱的塔板數(shù)越多，柱效越高； 分離度：應(yīng)大于1.5；重復性：相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%；等；等； （六）在雜質(zhì)檢查和含量測定中的應(yīng)用（六）在雜質(zhì)檢查和含量測定中的應(yīng)用 1.1.內(nèi)標法（加內(nèi)標法（加校正因子）校正因子）方法：方法：n內(nèi)標物內(nèi)標物+ +對照品對照品對照溶液，進樣，測定，計算校正因子對照溶液，進樣，測定，計算

11、校正因子。RRssCACAf= =校正因子校正因子CR對照品濃度對照品濃度As內(nèi)標物峰面積內(nèi)標物峰面積CS內(nèi)標物濃度內(nèi)標物濃度AR對照品峰面積對照品峰面積n供試品供試品+ +內(nèi)標內(nèi)標供試品溶液，進樣，測定供試品和內(nèi)標物質(zhì)供試品溶液，進樣，測定供試品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，計算含量的峰面積或峰高，計算含量f= AS / CSAx /CxCx=f AxAS / CSCx樣品濃度樣品濃度Ax樣品峰面積樣品峰面積例例.HPLC.HPLC法測定鹽酸阿夫唑嗪片（規(guī)格：法測定鹽酸阿夫唑嗪片（規(guī)格：5mg5mg）的含量：）的含量：取鹽酸特拉唑嗪約取鹽酸特拉唑嗪約20mg20mg，稱定，置，稱定，置100ml

12、100ml量瓶中，加流量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標溶液。取鹽酸動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標溶液。取鹽酸阿夫唑嗪對照品約阿夫唑嗪對照品約10mg10mg，精密稱定，置，精密稱定，置10ml10ml量瓶中，量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液，精密取該儲備液精密取該儲備液1ml1ml，置，置100ml100ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶量瓶中，精密加內(nèi)標溶液液5ml5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液；另取本品溶液；另取本品2020片，精密稱定，研細，精密稱

13、細粉片，精密稱定，研細，精密稱細粉適量（約相當于阿夫唑嗪適量（約相當于阿夫唑嗪10mg10mg），置），置100ml100ml量瓶中，加量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10ml10ml，置，置100ml100ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶液量瓶中，精密加內(nèi)標溶液5ml5ml，用流動，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別精密相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別精密取對照品溶液和樣品溶液各取對照品溶液和樣品溶液各20l20l注入液相色譜儀，記注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按內(nèi)標法以峰面積計算含量。錄色譜圖，按內(nèi)標法以峰面積

14、計算含量。操作：操作：對照品取樣為對照品取樣為10.1mg10.1mg，2020片重為片重為1.6020g1.6020g，取樣細粉稱重取樣細粉稱重158.2mg158.2mg，測得對照品溶液中鹽酸阿，測得對照品溶液中鹽酸阿夫唑嗪和內(nèi)標的峰面積分別為夫唑嗪和內(nèi)標的峰面積分別為54701245470124和和61260126126012，樣品溶液中阿夫唑嗪和內(nèi)標的峰面積分別為樣品溶液中阿夫唑嗪和內(nèi)標的峰面積分別為52199865219986和和6119897861198978，計算本品的含量。，計算本品的含量。 解：解：對照品濃度：對照品濃度：0.0101mg/ml,0.0101mg/ml,內(nèi)標濃

15、度：內(nèi)標濃度：0.01mg/mg0.01mg/mgf=(AS/CS)/(AR/CR)=(6126012/0.01)/(5470124/0.0101)(6126012/0.01)/(5470124/0.0101) =1.13 =1.13 CX=fAX/(AS/CS)=1.131.135219986/(6119898/0.0100)5219986/(6119898/0.0100) =0.009735mg/ml =0.009735mg/ml=（0.0097350.00973510010010/158.2)10/158.2)（1.6020/201.6020/20）/5/5100%=98.58% 100

16、%=98.58% 100平均片重平均片重= = =標示量標示量供試品重供試品重測得量測得量含量含量標示量標示量平均片重平均片重供試品重供試品重測得量測得量100例例.HPLC.HPLC法測定單硝酸異山梨酯注射液（規(guī)格：法測定單硝酸異山梨酯注射液（規(guī)格：5ml:20mg5ml:20mg）的含量：取間三甲氧基苯約的含量：取間三甲氧基苯約20mg20mg，稱定，置，稱定，置100ml100ml量瓶量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標溶液。中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標溶液。取單硝酸異山梨酯對照品約取單硝酸異山梨酯對照品約8mg8mg，精密稱定，置，精密稱定，置100ml100m

17、l量瓶中，精密加內(nèi)標溶液量瓶中，精密加內(nèi)標溶液5ml5ml，用流動相溶解并稀釋至，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取刻度，搖勻，取20l20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品另取本品2ml2ml，同法測定，按內(nèi)標法以峰面積計算含量。，同法測定，按內(nèi)標法以峰面積計算含量。已知：對照品取樣為已知：對照品取樣為8.1mg8.1mg，測得對照品溶液中單硝酸，測得對照品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標的峰面積分別為異山梨酯和內(nèi)標的峰面積分別為54678245467824和和61258436125843，樣品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標的峰面積分別為樣品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標的

18、峰面積分別為52213455221345和和61228456122845，計算本品的含量。，計算本品的含量。解：f=(AS/CS)/( AR/CR)=(6125843/0.01)/(5467824/0.081)=9.07 CX=fAX/(AS/CS)=9.075221345/(6122845/0.01)=0.07735mg/ml 100裝量裝量= = =標示量標示量取樣量取樣量測得量測得量含量含量標示量標示量裝量裝量取樣量取樣量測得量測得量100=(0.7735100/5)2/20100%=96.68%2.2.外標法外標法對照液對照液（R）：）： AR CR 供試液供試液（X）：）： AX C

19、XCX CRAX ARCXCR AXAR要求：進樣量準確、操作條件穩(wěn)定要求：進樣量準確、操作條件穩(wěn)定A A總總=Ai=A1+A2+An=Ai=A1+A2+An (%)=Ai / A (%)=Ai / A總總100%100% 例題例題7 7 用氣相色譜法檢查大豆油的脂肪用氣相色譜法檢查大豆油的脂肪酸組成，相應(yīng)于棕櫚酸、硬酯酸、油酸、亞油酸組成，相應(yīng)于棕櫚酸、硬酯酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的峰面積分別為酸和亞麻酸的峰面積分別為129758129758、4328643286、296522296522、654868654868、9257092570，按峰面積歸一化法，按峰面積歸一化法，計算上述脂肪酸的百

20、分含量。計算上述脂肪酸的百分含量。 3 3、面積歸一化法、面積歸一化法二、氣相色譜法二、氣相色譜法1.1.分離原理分離原理注入進樣口的樣品經(jīng)加熱氣化后，被載氣帶入色譜柱，注入進樣口的樣品經(jīng)加熱氣化后，被載氣帶入色譜柱，由于其分配系數(shù)的不同進行分離，各組分先后進入檢測器，由于其分配系數(shù)的不同進行分離，各組分先后進入檢測器，信號記錄儀、積分儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。分配信號記錄儀、積分儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。分配系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出。系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出。2.2.色譜儀的基本結(jié)構(gòu)色譜儀的基本結(jié)構(gòu)由載氣源、進樣器、色由載氣源、進樣器、色譜柱、柱溫

21、箱、檢測器譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成 . .載氣（流動相）：載氣（流動相）： 如氦、氮和氫等如氦、氮和氫等 . .進樣器：直接進樣或頂空進樣進樣器：直接進樣或頂空進樣 微量注射器微量注射器. . 固定相和載體固定相和載體 色譜柱為色譜柱為填充柱填充柱或或毛細管柱毛細管柱 常用的固定液有常用的固定液有甲基聚硅氧烷甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱填充柱. . 檢測器檢測器 火焰離子化檢測器（火焰離子化檢測器（FID)FID)、熱導檢測器熱導檢測器(TCD)(TCD)、氮磷檢測器（氮磷檢測器

22、（NPD)NPD)、火焰光度檢測器火焰光度檢測器(FPD)(FPD)、電子捕獲檢測器電子捕獲檢測器(ECD)(ECD)、質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器(MS) (MS) 1 1 專屬性專屬性 2 2 線性及其范圍線性及其范圍 3 3 精密度精密度 4 4 準確度準確度 5 5 檢測限檢測限 6 6 定量限定量限 7 7 耐用性耐用性一、專屬性一、專屬性(Specificity)v 指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性。采用的方法能準確測定出被測物的特性。v 分析復雜樣品混合物時衡量其分析復雜樣品混合物時衡量

23、其是否受到干擾是否受到干擾的一種方法。的一種方法。 A- 對照品對照品B- 樣樣 品品C- 陰陰 性性二、線性與范圍二、線性與范圍( (L Linearity inearity A And nd R Rangeange) )v線性：線性：在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與被測物濃度在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與被測物濃度呈正比關(guān)呈正比關(guān)系系的程度。的程度。 vY=a+bx （r0.999) 范圍：范圍：達到一定精密度、準確度和線性的條件下，測試方達到一定精密度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。eg.eg.原料藥和制劑含量測定，范圍應(yīng)為測試濃度的原料藥

24、和制劑含量測定，范圍應(yīng)為測試濃度的80%80%120%120%；制劑含量均勻度檢查，范圍應(yīng)為測試濃度的；制劑含量均勻度檢查，范圍應(yīng)為測試濃度的70%70%130%130%，根據(jù)劑型特點，如氣霧劑、噴霧劑，范圍可適當放寬；溶出度根據(jù)劑型特點，如氣霧劑、噴霧劑，范圍可適當放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍應(yīng)為限度的或釋放度中的溶出量測定，范圍應(yīng)為限度的20%20%1 1、定義：、定義：在規(guī)定的測試條件下在規(guī)定的測試條件下, ,同一個均勻樣品同一個均勻樣品經(jīng)多次測定所得結(jié)果彼此符合程度。經(jīng)多次測定所得結(jié)果彼此符合程度。三、精密度三、精密度2 2、表示方法、表示方法： 偏差（偏差（d d）：）：

25、 標準偏差標準偏差(SD):(SD): 相對標準偏差相對標準偏差(RSD):(RSD):idxx=2ixxSn1=SRSD100%x=重復性重復性: : 同一實驗室同一實驗室, ,同一人多次測定的精密度同一人多次測定的精密度至少用至少用9次測定結(jié)果評價：制備三個不同濃度樣品，每一濃度次測定結(jié)果評價：制備三個不同濃度樣品，每一濃度樣品測三次。樣品測三次。中間精密度中間精密度: : 同一實驗室，不同人，不同儀器測定的精密度同一實驗室，不同人，不同儀器測定的精密度目的：考察隨機變動因素的影響，如日期、分析人員目的：考察隨機變動因素的影響，如日期、分析人員重現(xiàn)性重現(xiàn)性: : 不同實驗室，不同人測定的精密度不同實驗室，不同人測定的精密度當分析方法將被法定標準采用時，應(yīng)進