免疫印跡介紹及試驗過程

1、免疫印跡免疫印跡免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）,是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。免疫印跡法的基本原理將混合抗原樣品在凝膠板上進(jìn)彳 t 單向或雙向電泳分離，然后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場力

2、或其它外力作用下，使凝膠中的單一抗原組份轉(zhuǎn)移到印跡紙上，并且固相化。最后應(yīng)用免疫覆蓋液技術(shù)如免疫同位素探針或免疫酶探針等，對抗原固定化基質(zhì)膜進(jìn)行檢測和分析。免疫印跡法的基本步驟免疫印跡法（以抗原分析為例）基本上可分為抗原分離、抗原印跡和抗原檢定三個步驟。在每一步中因采用的具體實驗方法不同，可構(gòu)成多種免疫印跡分析系統(tǒng)。免疫印跡法的優(yōu)點免疫印跡法是一項分析抗原、抗體的技術(shù)。它具有下列優(yōu)點：1、濕的固定化基質(zhì)膜柔韌，易于操作；2、固定化的生物大分子可均一的與各種免疫探針接近，不會象凝膠那樣受孔徑阻隔；3、免疫印跡分析只需少量試劑；4、孵育、洗滌的時間明顯減短；5、可同時制作多個拷貝，用于多種分析和鑒

3、定；6、結(jié)果以圖譜形式可長期保存；7、免疫探針可通過降低 PH 值等方法，象抹去錄音磁帶一樣將探針抹掉，再換用第二探針進(jìn)行分析檢測。免疫印跡法的應(yīng)用范圍及優(yōu)點不僅局限于此，它必將隨著這一方法的深入研究而不斷發(fā)展和完善。免疫印跡免疫印跡又常稱 Westernblot,是一綜合性的免疫學(xué)檢測技術(shù)。 它利用 SDS-PAGE 技術(shù)將生物樣品中的蛋白質(zhì)分子按分子量的大小在凝膠上分離開，然后用電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到固相膜上（NC、尼龍或 PVDF 膜），最后進(jìn)行免疫學(xué)檢測。由于免疫學(xué)檢測敏感性高，并且通過SDS-PAGE 樣品中的待檢蛋白得到了濃縮，因此，Westernblot 的靈敏度特別高，可達(dá)到

4、放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫學(xué)檢測技術(shù)（如 ELISA、放射免疫沉淀）檢測時，由于要求被檢測蛋白可溶、要求抗體效價高、親和力高和特異性強(qiáng)，往往并不容易達(dá)到目的。而 Westernblot 卻沒有這些缺點。因此，Westernblot 廣泛應(yīng)用于生物樣品中是否存在某一蛋白質(zhì)（抗原）的檢測。也可用于粗略測定抗原蛋白的相對含量和抗原多肽鏈的相對分子量。一、原理是 SDS-PAGE 電泳與免疫檢測相結(jié)合的一種蛋白質(zhì)檢測方法。強(qiáng)陰離子去污劑 SDS 與還原劑并用，通過加熱使蛋白質(zhì)解離，大量的 SDS 結(jié)合蛋白質(zhì)，使其帶相同密度的負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）時，不同蛋白質(zhì)的遷移率僅取決

5、于分子量。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，繼而用抗體進(jìn)行檢測。經(jīng)過 PAGE 分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。二、實驗材料誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的帶有口蹄疫病毒保護(hù)性抗原 VP1 與 LTB 融合蛋白基因的工程菌。三、儀器、耗材與試劑（一）儀器、耗材DYY6C 電泳儀、DYCZ24D 垂直板電泳槽、封口機(jī)、DYCP40C 半干式轉(zhuǎn)移電泳槽、5m

6、l、1ml、200“、506、10。移液器及相應(yīng)的 Tip、50ml 燒杯。新華濾紙、PVDF 膜。剪刀、刀片，直尺、鉛筆、一次性手套。（二）試劑1.30%儲備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g,亞甲雙丙烯酰胺（Bis）1.0g,混勻后加 ddH2。，37OC溶解,定容至 100ml,棕色瓶存于 4OC。2.1.5MTris-HCl（pH8.8）:Tris18.17g 力口 ddH2O 溶解,濃鹽酸調(diào) pH 至 8.8,定容至 100ml。3.1MTris-HCl（pH6.8）:Tris12.11g 加 ddH2O 溶解，濃鹽酸調(diào) pH 至 6.8,定容至 100ml。4.10%SDS:電泳

7、級 SDS10.0g 力口 ddH2O68c 助溶，濃鹽酸調(diào)至 pH7.2,定容至 100ml。5.10M 電泳緩沖液（pH8.3） :Tris3.02g,甘氨酸 18.8g,10%SDS10ml 力口 ddHzO 溶解， 定容至 100ml。6.10%過硫酸?。ˋP）：1gAP 加 ddH2O 至 10ml。7.14.4-97.4kDa 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（Marker）8.2MSDS 電泳上樣緩沖液： 1MTris-HCl （pH6.8） 2.5ml,B-疏基乙醇 1.0ml,SDS0.6g,甘油 2.0ml,0.1%澳酚蘭 1.0ml,ddH2O3.5ml。9.考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮

8、蘭 0.25g,甲醇 225ml,冰醋酸 46ml,ddH2O225ml。10. 脫色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O 以 3：1：6 配制而成。11. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：48mMTris-Cl,39mM 甘氨酸、0.037%SDS、20%的甲醇，pH8.3。甘氨酸 2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇 200ml;力口 dd&O 定容至 1000ml。12. 0.01MPBS0.01MPBS(pH7.4):NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g;力口 ddH2O 至 1000ml13. 顯色液：DAB6.0mg;0.01MPBS10.0ml;硫

9、酸饃胺 0.1ml;d021.06。或增強(qiáng)型 HRP-DAB 底物顯色劑盒14. FMDV 陽性豬血清15. 兔抗豬 IgG-HRP 酶酶結(jié)合物(俗稱酶標(biāo)抗體)，購自 Sigma 公司，產(chǎn)品編號 A5670四、操作步驟（一）SDS-PAGE先安裝好 DYCZ24D 垂直板電泳槽，然后如下操作1、聚丙烯酰胺凝膠的配制分離膠（15%）的配制：ddH2O2.3ml10%SDS0.1ml30%儲備膠 5.0ml10%AP0.1ml1.5MTris-HCl2.5mlTEMED4l小心將上述溶液混勻，注意搖起氣泡。迅速將丙烯酰胺溶液灌注到的兩玻璃板的間隙中，留出灌注積層膠所需的空間（梳子的齒長再加烯酰胺溶

10、液上小心要覆蓋一層水（可灌滿）。將電泳槽垂直放置于室溫下。分離膠聚合完全（約 30 分鐘），將分離膠上的水倒去，并將殘存的水珠用濾紙條吸去。積層膠（5%）的配制：ddH2O1.4ml10%SDS0.02ml30%儲備膠 0.33ml10%AP0.02ml1MTris-HCl0.25mlTEMED2l將上述混合液灌注到分離膠上面的兩玻璃板的間隙中，并立即將梳子插入玻璃板間,完全聚合需 30min。2、樣品處理：將樣品加入等量的 2XSDS 上樣緩沖液，100c 加熱 3-5min,離心 12000gx1min,取上清作 SDS-PAGE 分析，同時將 SDS 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。3、上

11、樣：取 1010 科 l l 誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的處理后的樣品加入樣品池中，并加入 206 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作對照。4、電泳:在電泳槽中加入 1 父電泳緩沖液，連接電源，電泳時，積層膠電壓 60V,分離膠電壓100V,電泳至澳酚蘭行至電泳槽下端停止（約需 3hr）。DYCZ-24D 電泳槽1cm）。然后，再在丙5、染色：將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫 4hr。6、脫色：將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。7、凝膠攝像和保存：在圖像處理系統(tǒng)下將脫色好的凝膠攝像，結(jié)果存于軟盤中，凝膠可保存于雙蒸水中或 7%乙酸溶液中。SDS-PAGESDS-PAGE 注意事項1、實

12、驗樣品孔與各對照孔所加總蛋白含量要相等：。2、為達(dá)到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的 pH 值要準(zhǔn)確，10%APS 在一周內(nèi)使用。室溫較低時，TEMED 的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應(yīng)注意防護(hù)。（二）電轉(zhuǎn)移1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minX3 次。2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的 6 張濾紙和 PVDF 膜，將膜在甲醇中浸泡 15 秒，然后再在蒸儲水中浸泡 2min,最后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中最少平衡 5min。3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陰極碳板、3 3 層濾紙、凝膠、PVDFPVDF 膜、3 3 層濾紙、陽極

13、碳板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF 膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓 500g 重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源，恒流 1mA/cm2,轉(zhuǎn)移 1.0hr 或 3mA/cm2,轉(zhuǎn)移 30min。（三）免疫反應(yīng)：1、用 0.01MPBST 洗膜（pH7.4,0.02%吐溫 20）,5minX3 次。2、封閉：將纖維素膜置于一塑料袋中，加封閉液（1%BSA 于 PBS（pH7.4）中，0.02%吐溫 20）,室溫下輕輕振蕩 2-3 小時或 4c 過夜。3、封閉液，用 0.01MPBS 洗膜，5minX3 次。4,加 FMDV 陽性豬血清，用 PBS 稀釋 50 倍，37c 作用 2hr。4、加入抗豬酶標(biāo)抗體（按合適稀釋比例用 0.01MPBS 稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4C放置 12hr 或 37C,1hr。5、將膜從酶標(biāo)抗體液中取出，用 0.01MPBST 洗膜，5minX3 次。6、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)?；虬丛噭┖姓f明書進(jìn)行注意事項1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入 H2O2。3、DAB 有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。A:未誘導(dǎo)的工程菌（對照）B:誘導(dǎo)的