生物化學(xué)課件-蛋白質(zhì)及其分離純化

1、第一章蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)1.11.1蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能1.21.2蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類1.31.3蛋白質(zhì)的組成蛋白質(zhì)的組成1.41.4蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)1.51.5蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)1.61.6蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定1.1蛋白質(zhì)的功能1) 催化功能：催化功能：酶蛋白酶蛋白2) 結(jié)構(gòu)功能：結(jié)構(gòu)功能：膠原蛋白、角蛋白膠原蛋白、角蛋白3) 運(yùn)輸功能：運(yùn)輸功能：血紅蛋白、載脂蛋白血紅蛋白、載脂蛋白4) 貯存功能：貯存功能：卵清蛋白卵清蛋白5) 運(yùn)動(dòng)功能：運(yùn)動(dòng)功能：肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、鞭毛蛋白肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、鞭毛蛋白6) 防御功能防御功能7) 調(diào)

2、節(jié)功能：調(diào)節(jié)功能：激素類蛋白激素類蛋白8) 信息傳遞功能：信息傳遞功能：膜蛋白、味覺蛋白膜蛋白、味覺蛋白9) 遺傳調(diào)控功能遺傳調(diào)控功能10)其他功能其他功能1.2蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類P4按分子形狀分類按分子形狀分類球狀蛋白球狀蛋白纖維狀蛋白纖維狀蛋白按分子組成分類按分子組成分類簡單蛋白：簡單蛋白：無非蛋白成分無非蛋白成分結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白：蛋白質(zhì)非蛋白成分蛋白質(zhì)非蛋白成分簡單蛋白質(zhì)按溶解度不同分類：簡單蛋白質(zhì)按溶解度不同分類：結(jié)合蛋白質(zhì)依據(jù)輔基不同分類：結(jié)合蛋白質(zhì)依據(jù)輔基不同分類：1.3蛋白質(zhì)的組成1.3.1蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的元素組成C、H、O、N、（、（S、P及一些金屬元素）及一些

3、金屬元素）特點(diǎn)：特點(diǎn)：蛋白質(zhì)中氮含量較為恒定，約蛋白質(zhì)中氮含量較為恒定，約為為16%16%，且在糖及脂類中不含氮，且在糖及脂類中不含氮?jiǎng)P氏定氮法：蛋白質(zhì)含量含氮量凱氏定氮法：蛋白質(zhì)含量含氮量6.256.251.3.2蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)肽段肽段氨基酸氨基酸 氨基酸的結(jié)構(gòu)氨基酸的結(jié)構(gòu) 氨基酸的分類氨基酸的分類 氨基酸的性質(zhì)氨基酸的性質(zhì) 氨基酸的分離和分析方法氨基酸的分離和分析方法 肽及肽鍵肽及肽鍵1、蛋白質(zhì)的水解酸水解：酸水解：常用常用HCl及及H2SO4水解水解優(yōu)點(diǎn)：水解完全，不引起消旋優(yōu)點(diǎn)：水解完全，不引起消旋缺點(diǎn)：部分氨基酸被破壞缺點(diǎn)：部分

4、氨基酸被破壞堿水解：堿水解：常用常用 NaOH水解水解優(yōu)點(diǎn)：水解完全，色氨酸不被破壞優(yōu)點(diǎn)：水解完全，色氨酸不被破壞缺點(diǎn)：多數(shù)氨基酸被破壞，并產(chǎn)生消旋缺點(diǎn)：多數(shù)氨基酸被破壞，并產(chǎn)生消旋酶水解酶水解優(yōu)點(diǎn)：不破壞氨基酸，不引起消旋優(yōu)點(diǎn)：不破壞氨基酸，不引起消旋缺點(diǎn)：水解時(shí)間長，單一酶水解不完全缺點(diǎn)：水解時(shí)間長，單一酶水解不完全2、基本氨基酸的結(jié)構(gòu) 構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸共構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸共2020種。種。 共同點(diǎn)：除脯氨酸外，均為共同點(diǎn)：除脯氨酸外，均為-氨氨基酸，即同一碳原子上有羧基、氨基酸，即同一碳原子上有羧基、氨基與氫?；c氫。 不同點(diǎn)：側(cè)鏈不同點(diǎn)：側(cè)鏈R R基團(tuán)不同?；鶊F(tuán)不同。3、氨基

5、酸的分類蛋白質(zhì)氨基酸蛋白質(zhì)氨基酸1）20種基本氨基酸種基本氨基酸按側(cè)鏈極性分類按側(cè)鏈極性分類按側(cè)鏈結(jié)構(gòu)分類按側(cè)鏈結(jié)構(gòu)分類 按人體能否合成分類按人體能否合成分類2）稀有氨基酸）稀有氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸按側(cè)鏈結(jié)構(gòu)分類按側(cè)鏈結(jié)構(gòu)分類脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸(15種種)芳香族氨基酸芳香族氨基酸(3種種)雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸(2種種)芳香族氨基酸芳香族氨基酸(3種種)雜環(huán)氨基酸（雜環(huán)氨基酸（2種）種）按側(cè)鏈按側(cè)鏈R基團(tuán)極性分類：基團(tuán)極性分類：非極性非極性(疏水疏水)氨基酸氨基酸(9種種)極性不帶電荷氨基酸極性不帶電荷氨基酸(6種種)極性帶正電荷氨基酸極性帶正電荷氨基酸(堿性氨基酸堿性氨基酸

6、)(3種種)極性帶負(fù)電荷氨基酸極性帶負(fù)電荷氨基酸(酸性氨基酸酸性氨基酸)(2種種)非極性非極性(疏水疏水)氨基酸（氨基酸（9種）種）極性極性不帶不帶電荷電荷氨基氨基酸酸(6(6種種) )極性帶正電荷氨基酸（極性帶正電荷氨基酸（3 3種）種）極性帶負(fù)電荷氨基酸（極性帶負(fù)電荷氨基酸（2 2種）種） 按人體能否合成分類 必需氨基酸：必需氨基酸：機(jī)體不能自身合成，必須機(jī)體不能自身合成，必須由食物供給的氨基酸由食物供給的氨基酸 人體必需氨基酸有八種：人體必需氨基酸有八種： Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr “假假 設(shè)設(shè) 來來 借借 一一 兩兩 本本 書書”半必需氨基酸：半必

7、需氨基酸：人體可合成，但合成量人體可合成，但合成量不足，如精氨酸及組氨酸。不足，如精氨酸及組氨酸。非必需氨基酸：非必需氨基酸：可自身合成且能滿足需可自身合成且能滿足需要的氨基酸（要的氨基酸（10種）種）2）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸由常見氨基酸經(jīng)酶催化，通過化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化而來 非蛋白質(zhì)氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸3、氨基酸的性質(zhì)物理性質(zhì)物理性質(zhì) 吸收光譜性質(zhì)吸收光譜性質(zhì)兩性解離性質(zhì)與等電點(diǎn)兩性解離性質(zhì)與等電點(diǎn)化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng) 物理性質(zhì)-氨基酸為無色晶體，熔點(diǎn)較高。氨基酸為無色晶體，熔點(diǎn)較高。一般情況下，大多數(shù)氨基酸溶解于水而不一般情況下，大多數(shù)氨基酸溶解于水而不溶于有機(jī)溶劑溶于有機(jī)溶劑(

8、 (除半胱氨酸和酪氨酸外，其除半胱氨酸和酪氨酸外，其他氨基酸一般均能溶于水、稀酸、稀堿；除他氨基酸一般均能溶于水、稀酸、稀堿；除脯氨酸外，其他氨基酸一般均不能溶于有機(jī)脯氨酸外，其他氨基酸一般均不能溶于有機(jī)溶劑溶劑) )。紫外吸收光譜性質(zhì)紫外吸收光譜性質(zhì) 構(gòu)成蛋白質(zhì)的構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(220nm)均均有光吸收。有光吸收。 在近紫外區(qū)在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 由于大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有這些氨基酸殘由于大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有這些氨

9、基酸殘基，因此用紫外分光光度法可測定蛋白基，因此用紫外分光光度法可測定蛋白質(zhì)含量。質(zhì)含量。紫外紫外吸收光吸收光譜性質(zhì)譜性質(zhì)補(bǔ)充：補(bǔ)充： 兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)氨基酸的等電點(diǎn)氨基酸的等電點(diǎn)(pI)：氨基酸的凈氨基酸的凈電荷為零時(shí)所處溶液的電荷為零時(shí)所處溶液的pH值。值。意義：意義：氨基酸處于等電點(diǎn)時(shí)，其溶解氨基酸處于等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易沉淀，此性質(zhì)常用于度最小，最易沉淀，此性質(zhì)常用于分離制備特定的氨基酸。分離制備特定的氨基酸。甘甘氨氨酸酸的的解解離離曲曲線線補(bǔ)充：補(bǔ)充：氨基酸氨基酸pI值的計(jì)算值的計(jì)算pKpK值（解離常值（解離常數(shù)）數(shù)）：指某種：指某種解離基團(tuán)有一解離基團(tuán)有一半被解離時(shí)的半

10、被解離時(shí)的pHpH值值pI=(pK1+pK2)/2化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)1）與茚三酮的反應(yīng) -氨基酸氨基酸與水合茚三酮溶液共熱，引與水合茚三酮溶液共熱，引起氨基酸氧化脫氨、脫羧，水合茚三酮與起氨基酸氧化脫氨、脫羧，水合茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物（氨、還原型茚三酮）生成反應(yīng)產(chǎn)物（氨、還原型茚三酮）生成蘭紫蘭紫色產(chǎn)物色產(chǎn)物（脯氨酸脯氨酸Pro和羥脯氨酸和羥脯氨酸Hyp呈呈黃黃色色），色深與溶液中氨基濃度成正比。），色深與溶液中氨基濃度成正比。 還原茚三酮還原茚三酮2）與亞硝酸反應(yīng)）與亞硝酸反應(yīng)脯氨酸不參加此反應(yīng)。應(yīng)用：測定氨基酸含量 測定蛋白質(zhì)的水解程度3）與甲醛反應(yīng)）與甲醛反應(yīng)反應(yīng)：反應(yīng)： 氨基酸與甲醛反應(yīng)生成

11、羥甲基、二氨基酸與甲醛反應(yīng)生成羥甲基、二羥甲基氨基酸，同時(shí)釋放羥甲基氨基酸，同時(shí)釋放H+。應(yīng)用：應(yīng)用： 可以酚酞作指示劑，用可以酚酞作指示劑，用NaOH滴定，滴定，測定氨基酸含量或判斷蛋白質(zhì)水解或合測定氨基酸含量或判斷蛋白質(zhì)水解或合成進(jìn)度，此法稱為成進(jìn)度，此法稱為甲醛滴定法甲醛滴定法。1.4.1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次1. 基本結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)2. 三維結(jié)構(gòu)：高級結(jié)構(gòu)1) 二級結(jié)構(gòu)2) 超二級結(jié)構(gòu)3) 結(jié)構(gòu)域4) 三級結(jié)構(gòu)5) 四級結(jié)構(gòu)3. 一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)決定功能1.4 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)舉例說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次1.4.2 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 1 1、定義：、定義： 指蛋白質(zhì)指蛋白質(zhì)肽鏈肽

12、鏈中氨基酸中氨基酸的組成及排列順序，它是實(shí)現(xiàn)蛋的組成及排列順序，它是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及其功能的基礎(chǔ)，白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及其功能的基礎(chǔ)，又稱為蛋白質(zhì)的又稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu)、共價(jià)共價(jià)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)、初級結(jié)構(gòu)初級結(jié)構(gòu)2 2、蛋白質(zhì)一級、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)舉例結(jié)構(gòu)舉例牛胰核糖核牛胰核糖核酸酶酸酶50年代末年代末Moore等等牛胰島素牛胰島素1953年年sanger等等肽及肽鍵 肽：肽：由一個(gè)氨基酸的由一個(gè)氨基酸的羧基和另一羧基和另一個(gè)氨基酸的個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的氨基脫水縮合而成的化化合物合物。 肽鍵肽鍵（酰胺鍵酰胺鍵） ：由一個(gè)氨基酸的由一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水

13、氨基脫水縮合而成的縮合而成的共價(jià)鍵共價(jià)鍵。 由兩個(gè)氨基酸形成的肽叫由兩個(gè)氨基酸形成的肽叫二肽二肽， 少于少于1010個(gè)氨基酸的肽叫個(gè)氨基酸的肽叫寡肽寡肽， 多于多于1010個(gè)氨基酸的肽叫個(gè)氨基酸的肽叫多肽多肽。 氨基酸脫水縮合形成肽氨基酸脫水縮合形成肽肽及肽鍵肽及肽鍵氨基酸殘基氨基酸殘基1.4.3 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)1、 定義：定義：指蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈的空間指蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈的空間走向（折疊和盤繞方式）走向（折疊和盤繞方式）2 2、四種二級結(jié)構(gòu)單元、四種二級結(jié)構(gòu)單元 -螺旋 -折疊 -轉(zhuǎn)角 不規(guī)則卷曲-螺旋俯視圖俯視圖側(cè)視圖側(cè)視圖-螺旋的特征要點(diǎn)：螺旋的特征要點(diǎn)：有右手螺旋及左手螺旋兩種，天然有

14、右手螺旋及左手螺旋兩種，天然蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中的-螺旋幾乎都是螺旋幾乎都是右手螺旋右手螺旋，右手螺旋比左手的穩(wěn)定右手螺旋比左手的穩(wěn)定穩(wěn)定性是靠穩(wěn)定性是靠鏈內(nèi)氫鍵鏈內(nèi)氫鍵維持的，肽鏈維持的，肽鏈上上C=OC=O氧與它后面第氧與它后面第4 4個(gè)殘基上的個(gè)殘基上的N-HN-H氫氫之間形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中之間形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行心軸平行每圈螺旋高度為每圈螺旋高度為0.540.54nmnm，含，含3.63.6個(gè)個(gè)氨基酸殘基；每個(gè)氨基酸殘基繞軸氨基酸殘基；每個(gè)氨基酸殘基繞軸旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)100100，沿軸上升，沿軸上升0.150.15nmnm氨基酸殘基的氨基酸殘基的R R側(cè)鏈在螺旋的外側(cè)

15、，側(cè)鏈在螺旋的外側(cè)，其形狀、大小及電荷等均影響其形狀、大小及電荷等均影響-螺螺旋的形成旋的形成 -折疊定義：兩條或多兩條或多條幾乎完條幾乎完全伸展的全伸展的多肽鏈側(cè)多肽鏈側(cè)向聚集在向聚集在一起，靠一起，靠鏈間氫鍵鏈間氫鍵聯(lián)結(jié)的片聯(lián)結(jié)的片層結(jié)構(gòu)層結(jié)構(gòu)折疊的特征要點(diǎn)：折疊的特征要點(diǎn)：相鄰肽鏈走向可相鄰肽鏈走向可平行平行也可也可反平行反平行。肽鏈的肽鏈的N-N-端在同側(cè)為平行式，不在同側(cè)端在同側(cè)為平行式，不在同側(cè)為反平行式。從能量角度考慮反平行式為反平行式。從能量角度考慮反平行式更為穩(wěn)定更為穩(wěn)定 穩(wěn)定性是靠穩(wěn)定性是靠鏈間氫鍵鏈間氫鍵維持的，氫鍵是維持的，氫鍵是由相鄰肽鏈主鏈上的由相鄰肽鏈主鏈上的N-

16、HN-H和和C=OC=O之間形成之間形成的的氨基酸殘基的氨基酸殘基的R R側(cè)鏈交替分布在片層側(cè)鏈交替分布在片層的上下兩側(cè)的上下兩側(cè) -轉(zhuǎn)角( (- -回折、回折、- -彎曲、發(fā)夾彎曲、發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) ) )定義：定義：是蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的是蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180180回折?；卣邸?轉(zhuǎn)角的特征要點(diǎn)轉(zhuǎn)角的特征要點(diǎn)：主鏈骨架以主鏈骨架以180180返回折疊返回折疊由多肽鏈上由多肽鏈上4 4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成，個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成，第第1 1個(gè)氨基酸殘基的個(gè)氨基酸殘基的C=OC=O與第與第4 4個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸殘基的殘基的N-HN-H之間生成氫鍵之間生成氫鍵廣泛存在于球狀蛋白質(zhì)中，多數(shù)由親廣泛存

17、在于球狀蛋白質(zhì)中，多數(shù)由親水氨基酸殘基組成水氨基酸殘基組成 無規(guī)則卷曲無規(guī)則卷曲定義：定義：沒有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)沒有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象象此結(jié)構(gòu)看來雜亂無章，但對一種特定此結(jié)構(gòu)看來雜亂無章，但對一種特定蛋白又是確定的，而不是隨意的。蛋白又是確定的，而不是隨意的。酶的活性中心往往在無規(guī)則卷曲中。酶的活性中心往往在無規(guī)則卷曲中。 1.4.4 超二級結(jié)構(gòu)：超二級結(jié)構(gòu)：若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體。1.4.5 結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域：多肽鏈上由相鄰的超多肽鏈上由相鄰的超二級結(jié)構(gòu)單元聯(lián)系而成的局部性區(qū)域二級結(jié)構(gòu)單元聯(lián)系而成的局部性區(qū)域，多肽

18、鏈，多肽鏈折疊成近乎球狀的高級結(jié)構(gòu)。折疊成近乎球狀的高級結(jié)構(gòu)。補(bǔ)充：補(bǔ)充：1.4 .6 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)定義：建立在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)建立在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)乃至結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，乃至結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，一條多肽鏈一條多肽鏈中中所有氨基酸殘基的空間關(guān)系所有氨基酸殘基的空間關(guān)系（構(gòu)（構(gòu)象）象）。 舉例：舉例：肌紅蛋白肌紅蛋白肌紅蛋白肌紅蛋白1 1條多肽條多肽鏈鏈1 1個(gè)血紅素輔基個(gè)血紅素輔基結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)對于小分子蛋白質(zhì)來說，結(jié)構(gòu)域就是對于小分子蛋白質(zhì)來說，結(jié)構(gòu)域就是其三級結(jié)構(gòu)；其三級結(jié)構(gòu)；大分子蛋白質(zhì)則是由兩個(gè)或兩個(gè)以上大分子蛋白質(zhì)則是由兩個(gè)或兩個(gè)以上相對獨(dú)立的三維實(shí)體（結(jié)構(gòu)域）締合相對獨(dú)立的三

19、維實(shí)體（結(jié)構(gòu)域）締合而成的。而成的。典型例子：典型例子：免疫球蛋白免疫球蛋白 木瓜蛋白酶內(nèi)的2個(gè)結(jié)構(gòu)域彼此很不相同彈性蛋白酶的二個(gè)結(jié)構(gòu)域彼此非常相似1.4.7 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 1、定義：由兩條或兩條以上各自獨(dú)立具有由兩條或兩條以上各自獨(dú)立具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過次級鍵通過次級鍵相互締合而相互締合而成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu), ,四級結(jié)構(gòu)只存在于四級結(jié)構(gòu)只存在于具有兩具有兩條或以上肽鏈條或以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)中組成的蛋白質(zhì)中。亞基（亞單位）：亞基（亞單位）：四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每一個(gè)球四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每一個(gè)球狀蛋白。狀蛋白。 單體蛋白質(zhì)：單體蛋白質(zhì)：只有一個(gè)亞基（三級結(jié)構(gòu)）只

20、有一個(gè)亞基（三級結(jié)構(gòu)） 寡聚蛋白質(zhì)：寡聚蛋白質(zhì)：由少量亞基組成的蛋白質(zhì)，如由少量亞基組成的蛋白質(zhì)，如四聚體血紅蛋白四聚體血紅蛋白 多聚蛋白質(zhì)：多聚蛋白質(zhì)：由大量亞基組成的蛋白質(zhì)由大量亞基組成的蛋白質(zhì)舉例：血紅蛋白1.4.8 維系蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的作用力的作用力u共價(jià)鍵：共價(jià)鍵：肽肽鍵、二硫鍵鍵、二硫鍵u非共價(jià)鍵：非共價(jià)鍵：氫鍵、離子鍵、氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德華疏水鍵、范德華力力二硫鍵二硫鍵(二硫橋二硫橋)是由兩個(gè)半胱氨酸側(cè)是由兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈的巰基鏈的巰基SH脫氫脫氫而形成的。而形成的。二硫鍵用于穩(wěn)定蛋白二硫鍵用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三、四級高級構(gòu)質(zhì)的三、四級高級構(gòu)象。象。氫鍵氫鍵

21、多肽鏈中側(cè)鏈間或側(cè)鏈多肽鏈中側(cè)鏈間或側(cè)鏈與主鏈骨架間所生成的氫與主鏈骨架間所生成的氫鍵是維持蛋白質(zhì)三、四級鍵是維持蛋白質(zhì)三、四級結(jié)構(gòu)所需的結(jié)構(gòu)所需的多肽鏈中主鏈骨架中的氫鍵是維多肽鏈中主鏈骨架中的氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要的次級鍵持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要的次級鍵疏水鍵疏水鍵(疏水作用力疏水作用力)蛋白質(zhì)中的疏水氨基酸殘基避開蛋白質(zhì)中的疏水氨基酸殘基避開水分子而聚集在分子內(nèi)部的趨向力。水分子而聚集在分子內(nèi)部的趨向力。它是維持蛋白質(zhì)分子三、四級結(jié)它是維持蛋白質(zhì)分子三、四級結(jié)構(gòu)最主要的作用力。構(gòu)最主要的作用力。離子鍵離子鍵(鹽鍵鹽鍵)正、負(fù)電荷的側(cè)鏈基團(tuán)之間的一正、負(fù)電荷的側(cè)鏈基團(tuán)之間的一種靜電吸引作

22、用。種靜電吸引作用。范德華力范德華力中性分子或中性原子之間弱的作用力，中性分子或中性原子之間弱的作用力，參與維持蛋白質(zhì)分子三、四級結(jié)構(gòu)參與維持蛋白質(zhì)分子三、四級結(jié)構(gòu)1.5 蛋白質(zhì)的性質(zhì)兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)膠體性質(zhì)膠體性質(zhì)沉淀作用沉淀作用顏色反應(yīng)顏色反應(yīng)變性作用變性作用紫外吸收性質(zhì)紫外吸收性質(zhì)1.5.1 蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)所帶蛋白質(zhì)所帶凈電荷凈電荷為零時(shí)，所處溶液的為零時(shí)，所處溶液的pHpH 值即為該蛋白質(zhì)值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的等電點(diǎn)。等電點(diǎn)與等離子點(diǎn)等電點(diǎn)與等離子點(diǎn) 中性鹽的存在常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)發(fā)中性鹽的存在常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)發(fā)

23、生明顯的改變生明顯的改變 實(shí)際測得的等電點(diǎn)與介質(zhì)的離子組成有實(shí)際測得的等電點(diǎn)與介質(zhì)的離子組成有關(guān)關(guān) 在在不含任何鹽的純水不含任何鹽的純水中測得的等電點(diǎn)稱中測得的等電點(diǎn)稱為為蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)，是蛋白質(zhì)的特征，是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)常數(shù)1.5.2蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如不能通過半透膜等。型性質(zhì)，如不能通過半透膜等。 常用常用透析法透析法分離純化蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水膜水膜( (水化層水化層) )將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開，將蛋白質(zhì)

24、顆粒彼此隔開，阻止其相互聚集而沉淀阻止其相互聚集而沉淀蛋白質(zhì)顆粒在非等電狀態(tài)下，帶蛋白質(zhì)顆粒在非等電狀態(tài)下，帶同種電荷同種電荷，互相排斥，不致聚集，互相排斥，不致聚集而沉淀而沉淀1.5.3蛋白質(zhì)的沉淀作用p2761 1、定義：、定義： 蛋白質(zhì)的水膜或電荷一旦除去，蛋白質(zhì)的水膜或電荷一旦除去，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來2 2、分類：、分類：可逆沉淀可逆沉淀：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液。，可以重新溶解形成溶液。不可逆沉淀不可逆沉淀：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)

25、的結(jié)：在沉淀過程中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生了變化，沉淀不可能再重構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生了變化，沉淀不可能再重新溶解于水新溶解于水可逆沉淀蛋白質(zhì)的常用方法： 鹽析法鹽析法( (中性鹽沉淀法中性鹽沉淀法) )鹽析法鹽析法( (中性鹽沉淀法中性鹽沉淀法) )：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽,使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。常用中性鹽有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 鹽溶：鹽溶：向蛋白質(zhì)水溶液中加入少量的中性鹽，增加蛋白質(zhì)表面的電荷，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與水的作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水中的溶解度增大 有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法：常用與水互溶的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等，破壞水膜，使其沉淀。重金屬鹽

26、沉淀法重金屬鹽沉淀法常用重金屬鹽有常用重金屬鹽有HgHg2+2+鹽、鹽、PbPb2+2+鹽、鹽、CuCu2+2+鹽等鹽等生物堿試劑沉淀法生物堿試劑沉淀法常用生物堿試劑如單寧酸、苦味酸、常用生物堿試劑如單寧酸、苦味酸、鎢酸等鎢酸等 不可逆沉淀蛋白質(zhì)的常用方法：1.5.4蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 反應(yīng)反應(yīng) 試劑試劑 顏色顏色 反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)基團(tuán)雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) NaOH,稀稀CuSO4 紫紅紫紅 2個(gè)或個(gè)或2個(gè)以上肽鍵個(gè)以上肽鍵Folin酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng) CuSO4磷鎢酸磷鎢酸-鉬酸鉬酸 蘭色蘭色 酚基酚基茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng) 茚三酮茚三酮 蘭紫色蘭紫色 游離氨基游離氨基 Millon反應(yīng)反應(yīng) Mi

27、llon試劑試劑 紅色紅色 酚基酚基黃色反應(yīng)黃色反應(yīng) HNO3及及NH3 黃、橘黃黃、橘黃 苯環(huán)苯環(huán)乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反應(yīng) 乙醛酸，乙醛酸，H2SO4 紫紅紫紅 色氨酸吲哚基色氨酸吲哚基坂口反應(yīng)坂口反應(yīng) 次氯酸鈉次氯酸鈉,萘酚萘酚,NaOH 紅色精氨酸的胍基紅色精氨酸的胍基 雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)也有類似反應(yīng)蛋白質(zhì)也有類似反應(yīng)紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(堿性溶液堿性溶液)Cu2+1.5.5蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性1 1、蛋白質(zhì)的變性、蛋白質(zhì)的變性1 1、蛋白質(zhì)的變性：、蛋白質(zhì)的變性：天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，次級鍵及影響，次級鍵及( (或或) )二硫鍵斷裂，二硫鍵斷裂

28、，引起天然構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致生引起天然構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致生物活性的喪失以及一些理化性質(zhì)的物活性的喪失以及一些理化性質(zhì)的改變，但不破壞蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變，但不破壞蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象?，F(xiàn)象。實(shí)質(zhì)蛋白質(zhì)的復(fù)性：蛋白質(zhì)的復(fù)性：當(dāng)變性因素除去后，當(dāng)變性因素除去后，某些某些變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)到天然構(gòu)變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)到天然構(gòu)象的現(xiàn)象象的現(xiàn)象2 2、變性蛋白質(zhì)特性變性蛋白質(zhì)特性失去結(jié)晶能力失去結(jié)晶能力及及生物活性的喪失生物活性的喪失是蛋是蛋白質(zhì)變性的主要特征。白質(zhì)變性的主要特征。理化性質(zhì)改變：理化性質(zhì)改變：溶解度顯著降低溶解度顯著降低，粘，粘度增加，分子伸展，分子不稱性增加度增加，分子伸展，分子不稱

29、性增加等。等。生物化學(xué)性質(zhì)改變：分子結(jié)構(gòu)伸展松生物化學(xué)性質(zhì)改變：分子結(jié)構(gòu)伸展松散，一些側(cè)鏈基團(tuán)外露，可發(fā)生反應(yīng)散，一些側(cè)鏈基團(tuán)外露，可發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)增加，易被蛋白酶水解。的基團(tuán)增加，易被蛋白酶水解。沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性，如鹽析沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性，如鹽析作用作用變性的蛋白質(zhì)也不一定沉淀，如牛變性的蛋白質(zhì)也不一定沉淀，如牛奶加熱沸騰奶加熱沸騰思考：蛋白質(zhì)變性與沉淀之間的關(guān)系1.5.6蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有芳香族氨基酸。大部分蛋白質(zhì)均含有芳香族氨基酸。 芳香族氨基酸對紫外光有吸收作用，芳香族氨基酸對紫外光有吸收作用，且在且在280280nm nm 附近有最大吸收。因此，附近有最大

30、吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在大多數(shù)蛋白質(zhì)在280280nm nm 附近顯示強(qiáng)附近顯示強(qiáng)的吸收。的吸收。 利用這個(gè)性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行利用這個(gè)性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量測定。定性及定量測定。補(bǔ)充補(bǔ)充：1.6 蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化 蛋白質(zhì)的分析鑒定蛋白質(zhì)的分析鑒定補(bǔ)充：補(bǔ)充：根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。前處理：前處理：生物組織的機(jī)械破

31、碎生物組織的機(jī)械破碎動(dòng)物材料動(dòng)物材料：除結(jié)締、脂肪組織：除結(jié)締、脂肪組織- - 電動(dòng)搗碎機(jī)、勻電動(dòng)搗碎機(jī)、勻 漿器、超聲波漿器、超聲波植物組織植物組織：去種皮：去種皮- - 石英砂、玻璃粉石英砂、玻璃粉細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞：超聲波震蕩、砂研磨、高壓、溶菌酶：超聲波震蕩、砂研磨、高壓、溶菌酶1.6.1 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化粗分離粗分離(沉淀法沉淀法)細(xì)分細(xì)分離離(電泳法電泳法、層析法層析法、離心法離心法)結(jié)晶結(jié)晶1 1、沉淀法：、沉淀法：鹽析沉淀法鹽析沉淀法等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法低溫有機(jī)溶劑沉淀法低溫有機(jī)溶劑沉淀法2 2、透透析析法法超濾法超濾法3、超超濾濾法法原理：原理：利用具有一定

32、大小孔徑的利用具有一定大小孔徑的微孔濾微孔濾膜膜，對生物大分子溶液進(jìn)行過濾，對生物大分子溶液進(jìn)行過濾，使大分子保留在超濾膜上面的溶液使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從而達(dá)到脫鹽或濃縮的目的。而達(dá)到脫鹽或濃縮的目的。 4、電泳法電泳法 電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反的電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象電極移動(dòng)的現(xiàn)象 不同的蛋白質(zhì)顆粒的大小、形狀、所帶不同的蛋白質(zhì)顆粒的大小、形狀、所帶的電荷、等不同，在電場中的泳動(dòng)速度的電荷、等不同，在電場中的泳動(dòng)速度各異，因而可聚集形成不同的條帶，從各異，因而可聚集形成不同的條帶，從而達(dá)到分

33、離的目的。而達(dá)到分離的目的。 5 5、 層析法：層析法：離子交換層析法離子交換層析法凝膠過濾層析法凝膠過濾層析法親和層析法親和層析法吸附層析法吸附層析法分配層析法分配層析法離子交換層析法離子交換層析法原理原理: :根據(jù)根據(jù)離子交換劑離子交換劑與蛋白質(zhì)進(jìn)行離子與蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換，再利用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，即交換，再利用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，即可達(dá)到分離具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)可達(dá)到分離具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)的目的。的目的。凝膠過凝膠過濾層析法濾層析法(排阻層析，排阻層析，分子篩層分子篩層析析)原理：原理： 混合物流混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆凝膠顆粒內(nèi)部具有大量一定大小的微孔粒內(nèi)部具

34、有大量一定大小的微孔）的層）的層析柱時(shí)，大分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，移析柱時(shí)，大分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，移動(dòng)較快，并最先被洗脫出來；小分子能動(dòng)較快，并最先被洗脫出來；小分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長，移動(dòng)速度較慢，最內(nèi)經(jīng)過的路程較長，移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來。后被洗脫出來。親合層析法親合層析法親和蛋白親和蛋白配基配基原理：原理：利用某種蛋白質(zhì)能與其相應(yīng)的專利用某種蛋白質(zhì)能與其相應(yīng)的專一性配基進(jìn)行特異的可逆結(jié)合的一性配基進(jìn)行特異的可逆結(jié)合的能力能力（親合力）來純化生物大分子。（親合力）來純化生物大分子。6、密度梯度、密度梯度(區(qū)區(qū)帶帶)離

35、心法離心法原理：原理：在密度梯度介質(zhì)（蔗糖或甘油）在密度梯度介質(zhì)（蔗糖或甘油）中進(jìn)行的一種沉降速度離心?；旌衔镏羞M(jìn)行的一種沉降速度離心。混合物加至制備好的密度梯度介質(zhì)中，超速加至制備好的密度梯度介質(zhì)中，超速離心，各種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身離心，各種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停止不前，密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停止不前，最終形成各自獨(dú)立的區(qū)帶。最終形成各自獨(dú)立的區(qū)帶。1.6.2 1.6.2 蛋白質(zhì)的分析鑒定蛋白質(zhì)的分析鑒定蛋白質(zhì)分子量的測定蛋白質(zhì)分子量的測定蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定1、蛋白質(zhì)分子量的測定十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉- -聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳法胺凝膠電泳法（SDSSDSPAGEPAGE法）法）SDS：陰離子表面活性劑，消除電荷因陰離子表面活性劑，消除電荷因素素SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物：全呈長橢圓棒狀，蛋白質(zhì)復(fù)合物：全呈長橢圓棒狀，消除形狀因素。消除形狀因素。遷移率只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小遷移率只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小相對遷移率相對遷移率Rm=樣品移動(dòng)的距離樣品移動(dòng)的距離/指指示染料移動(dòng)的距離示染料移動(dòng)的距離2、蛋白質(zhì)含量的測定 微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法 雙縮脲法雙縮脲法 FolinFolin- -酚法酚法( (LowryLowry法法)