開題報告丁小紅畢業(yè)設(shè)計論文開題報告

1、杭 州 師 范 大 學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文）開題報告題 目 Isl1lacZ/Isl2GFP兩種用于分析Isl1/Isl2基因表達(dá)模型的標(biāo)簽小鼠的基因型鑒定 學(xué) 院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 專業(yè)班級 生技142 學(xué)生姓名 丁小紅 學(xué) 號 2014214138 指導(dǎo)教師 盛東來 職 稱 講師 一、選題背景與意義（說明所選課題的歷史背景、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢） 小鼠作為哺乳動物遺傳研究中首選的模式生物。經(jīng)過過去幾十年的努力，培育基因打靶和轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)變成很平常的工作，以目前的技術(shù)可以獲得在核酸水平上的突變品系?，F(xiàn)在，諸如此種基因組修飾變得越來越精細(xì)，而在基因水平上標(biāo)記不同的細(xì)胞群已成為非常普遍的

2、研究。 Lac Z，即細(xì)菌-半乳糖苷酶基因在許多小鼠研究中作為篩選標(biāo)記，它是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解Beta-gal比較穩(wěn)定，用X-Gal為底物進(jìn)行染色時，呈藍(lán)色，便于檢測和觀察LacZ基因的諸多優(yōu)點使它成為基因工程實驗中的一個常用標(biāo)記基因，比如常用于轉(zhuǎn)化菌株篩選，-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法，即，藍(lán)白篩選例如，基因克隆中常用的質(zhì)粒載體PUC 19及噬菌體載體M13系列均帶有LacZ基因。 GFP,即綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein )其自身的特點，它能夠在體內(nèi)或體外進(jìn)行實時監(jiān)測。GFP還有另一個優(yōu)勢，能采用流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡及熒光計等技術(shù)進(jìn)

3、行定量檢測。目前，人們已經(jīng)改進(jìn)了野生型GFP基因，從中獲得的幾種變體在熱穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度等方面都有所增強(qiáng)。增強(qiáng)型GFP（EGFP）就是其中之一?，F(xiàn)在，它已普遍應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因或基因打靶小鼠。更為重要的是，人們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出多種GFP光譜變體，其中兩種全新顏色的變體增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）和增強(qiáng)型藍(lán)綠色熒光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein, ECFP）已應(yīng)用于小鼠研究中。 由于ECFP和EYFP的譜線輪廓截然不同且沒有重疊，所以這兩種熒光蛋白可同時用作報告基因并共同顯色，這對體內(nèi)雙標(biāo)記或熒光能量轉(zhuǎn)移分析等研究是非常理想的。GFP及其顏色變體作為報告蛋白的

4、應(yīng)用為科學(xué)研究提供了一個空前的高精度檢測方法，代表著小鼠基因組改造技術(shù)的未來發(fā)展方向，并開啟了在同一個動物體內(nèi)應(yīng)用組合無創(chuàng)性報告基因的廣闊前景。 因此本文將通過Isl1lacZ/Isl2GFP兩種用于分析Isl1/Isl2基因表達(dá)模型的標(biāo)簽小鼠的基因型鑒定。 二、研究的基本內(nèi)容和擬解決的主要問題研究基本內(nèi)容： 小鼠解剖、DNA采集與提取、引物設(shè)計、基因片段PCR，瓊脂糖凝膠電泳 擬解決的主要問題： 作為導(dǎo)師研究課題的一部分，完成基因型鑒定后為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。 三、研究方法及措施（擬采取的研究手段及技術(shù)路線、實驗方案等）1、小鼠解剖： （1）準(zhǔn)備實驗工具（PBS緩沖液、培養(yǎng)皿、解剖工具等）；

5、（2）捏住母鼠尾巴中部將母鼠提起，置于鼠籠上，用頸椎脫臼法處死； （3）用75%酒精噴壺噴濕母鼠腹部皮毛，在培養(yǎng)皿中倒入PBS緩沖液； （4）用鑷子提起母鼠腹部皮膚，用剪刀橫向剪一個創(chuàng)口，撕開； （5）用剪刀剪開腹腔膜，用鑷子取出子宮，移至培養(yǎng)皿中； （6）在體視顯微鏡下操作，用鑷子撕開子宮及羊膜，分離胚胎； （7）將胚胎移至干凈PBS緩沖液中，剪尾做DNA提取； 2、DNA采集與提?。?DNA采集 （1）剪取小鼠尾巴約0.3里面置EP管備用； （2）解剖小鼠取視網(wǎng)膜、內(nèi)耳、血液、心肌、皮膚等組織部分置EP管備用。 DNA提取 方法一：堿裂解法 （1）剪取0.3厘米小鼠尾于1.5ml EP管

6、（2）加入100ul 50M NaOH （10ml stock of 50mM NaOH=9.95ml ddH20+50ul 10N NaOH） （3）95加熱10分鐘，渦旋 （4）加入10ul 1M Tris（PH=8.0），渦旋 （5）12000g離心5分鐘 （6）加入100ul TE（PH=8.0） 方法二：蛋白酶消化 （1）剪取0.3厘米小鼠尾于1.5ml EP管 （2）加入400ul Tail digestion buffer及2-5ul 10mg/ml proteinase K （3）60加熱，過夜 （4）加入200l酚氯仿異丙醇溶液，渦旋至乳白色，14000g離心5分鐘 （5）吸

7、取300ul上清液至新EP管，加入900ul 100%乙醇，搖動4-6次， 14000g離心1分鐘 （6）倒去上清液，加入350ul 75%乙醇，14000g離心1分鐘 （7）倒去上清液，自然風(fēng)干 （8）加入50ul TE（PH=8.0） 蛋白酶k是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，是枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。 3、引物設(shè)計： 本次實驗所用引物由美國羅切斯特大學(xué)甘霖教授完成。 4、基因片段PCR： （1）高溫變性（95） （2）低溫退火（60） （3）室溫延伸（72） 5、瓊脂糖

8、凝膠電泳： （1）配制1X TAE緩沖液（附錄） （2）制作瓊脂糖凝膠：根據(jù)引物大小配制（600bp以下2%，600bp以上1.5%） 例：制作2%凝膠100ml 電子天平稱取瓊脂糖2g于錐形瓶中，加入100ml 1X TAE緩沖液（實際多于100ml，以免煮膠時蒸發(fā)升高凝膠濃度），錐形瓶加紙蓋，搖勻，置微波爐中加熱，直到凝膠溶液完全透亮，加入3ul genegreen核酸染料,搖勻。 （3）倒入已插入梳子的膠槽（中孔梳子薄面朝下）冷卻。 （4）10-15分鐘后將凝膠放入電泳槽中。 （5）用移液槍將PCR產(chǎn)物加到對應(yīng)的膠孔中，每孔約7ul。 （6） 再將Marker（DM5000）加入其中一孔

9、，約4ul。 （7）開始電泳，本實驗用恒壓電泳，一般為180V，跑至大約2CM即可停止。 （8）將跑完的凝膠放入凝膠成像儀 LAS-3000進(jìn)行成像分析，使用核酸染料GelGreen程序。 四、研究工作的步驟與進(jìn)度（課題研究在時間和順序上的安排）1 2016.1-2016.2 設(shè)計引物 2 2016.3-2016.4 基因型鑒定 3 2016.4 撰寫論文 五、主要參考文獻(xiàn)（作者、書名、論文題目、出版社或出版號、出版年月或出版期號。文科不得少于15篇，理科不得少于10篇，其中外文文獻(xiàn)應(yīng)不少于2篇）1Ting, D. T., Kyba, M. and Daley, G. Q. (2005). I

10、nducible transgene expression in mouse stem cells. Methods Mol. Med. 105, 23-46. 2Warchol, M. E. (2011). Sensory regeneration in the vertebrate inner ear: differences at the levels of cells and species. Hear. Res. 273, 72-79. 3Zheng, J. L. and Gao, W.-Q. (2000). Overexpression of Math1 induces robus

11、t production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat. Neurosci. 3, 580-586. 4Li, M., Pevny, L., Lovell-Badge, R. and Smith, A. (1998). Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Curr. Biol. 8,971-974. 5Ruben, R. J. (1967). Development of the

12、 inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. 220, 1-44. 6 Luo XJ, Deng M, Xie X, et al. GATA3 controls the specification of prosensory domain and neuronal survival in the mouse cochlea. Hum Mol Genet, 2013(22):36093623. CrossRef Medline 7 Colland, F., Jacq

13、, X., et al. Functional proteomics mapping of a human signaling pathway. Genome Res, 2004(14), 13241332.8Mead PE, Deconinck AK, Huber TL, et al. 8 Primitive erythropoiesis in the Xenopus embryo: the synergistic role of LMO-2, SCL and GATA-blinding proteins. Development, 2001(128):2301-2308 9Min Deng

14、, Xiong-jian Luo, Ling Pan, et al. LMO4 Functions As a Negative Regulator of Sensory Organ Formation in theMammalian Cochlea. The Journal of Neuroscience,2014(30):10072-10077. 10 Ge XM, Liu SHH, Lu Y, et al. Gene expression of Lhx4 during peripheral nerve regenerat ion in adult rats J . Progress in Natural Science, 2002, 12( 6) : 645-647. 葛學(xué)銘, 劉淑