第十章核酸分子雜交技術(shù)ppt課件

1、第十章第十章 核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理 具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。 雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，知雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，知 核酸序列稱探針。核酸序列稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。雜交有固一液相雜交和液相雜交。 DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子 一、一、DNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性 （一DNA變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱

2、DNA變性2、變性的方法：、變性的方法：（1熱變性：溫度升高到熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核酸時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2酸堿變性：酸堿變性：pH值低于值低于3或高于或高于10時，雙鏈核時，雙鏈核 酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。 （3化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性質(zhì)變化：、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加4、DNA變性曲線變性曲線 AT區(qū)先解鏈區(qū)先解鏈 G

3、C區(qū)后解鏈區(qū)后解鏈 階梯式曲線階梯式曲線5、GC含量與含量與Tm值之間的關(guān)系值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3（二復(fù)性（二復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2、復(fù)性過程、復(fù)性過程（1單鏈分

4、子間碰撞形成局部雙鏈單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4形成完整的雙鏈分子形成完整的雙鏈分子3、復(fù)性的速率方程服從二級反應(yīng)動力學(xué)）、復(fù)性的速率方程服從二級反應(yīng)動力學(xué)）dC dt=K2C2（1）將1積分C Co 1 1+K2Cot=（2）一半單鏈一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（分子復(fù)性時，（2式中的式中的 為為1 21 2 1 1+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢C Co（3）1 K2Cot1/2= 二、影響雜交的因素二、影

5、響雜交的因素 1、核酸分子的濃度和長度：、核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜濃度過高影響雜 交效率交效率2、溫度：、溫度： （1DNA/DNA雜交，適宜溫度較雜交，適宜溫度較Tm值低值低2025 （2RNA/DNA或或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低雜交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低值低5 3、離子強度：、離子強

6、度： （1低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加交率增加 （2高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 4、甲酰胺：、甲酰胺： （1甲酰胺能降低核酸雜交的甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加測核酸與探針同

7、源性不高時，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 雜交雜交 （2如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在液在68雜交雜交 5、核酸分子的復(fù)雜性：、核酸分子的復(fù)雜性： （1核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度的總長度 （2Cot與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比 （3兩個兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性的相對復(fù)雜性 6、非特異性雜交反應(yīng)：、非特異性雜交反應(yīng)： （1雜交前封閉非特異性雜交位點，減

8、少其對探針雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附的非特異性吸附 （2常用的封閉物有兩類：即非特異性常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分和高分子化合物。如鮭精子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉溶液或脫脂奶粉 第二節(jié) 核酸分子雜交的方法按待測核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 液相雜交 RNA酶保護分析法 核酸酶S1保護分析法 一、一、Southern印跡雜交印跡雜交（一待測核酸樣品的制備（一待測核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細胞、裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組、抽取純化基因組DNA 3、限制

9、酶消化、限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段（二待測（二待測DNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢泳動慢,小分子小分子DNA泳動快，泳動快， 大小大小 相同的分子處于同一條帶相同的分子處于同一條帶 3、分子量標準：經(jīng)、分子量標準：經(jīng)Hind消化的消化的DNA，雜交，雜交 所用分子量標準可用核素標記所用分子量標準可用核素標記 （三凝膠中核酸的變性堿變化）（三凝膠中核酸的變性堿變

10、化） 凝膠置于凝膠置于NaOH溶液中使溶液中使DNA變性斷裂為較短的變性斷裂為較短的 單鏈單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 （四（四Southern印跡印跡 指將電泳分離的指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程相支持物上的過程1、固相支持物的選擇、固相支持物的選擇（1理想的固相支持物應(yīng)具備的特性理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強結(jié)合核酸分子的能力具有較強結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng)不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機械性能具有良好的機械性能 非特異吸附少非特

11、異吸附少（2常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纖維素膜強；缺陷：雜交信號本底高纖維素膜強；缺陷：雜交信號本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點：化學(xué)活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同與膜共價結(jié)合；對不同 大小的大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺陷：結(jié)合能片段有同等結(jié)合能力；缺陷：結(jié)合能 力較上述兩種膜低力較上述兩種膜低2、Southern印跡的常用方法印跡的常用方法 （1

12、毛細管虹吸印跡法毛細管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝片段垂直向上運動，凝膠中的膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上片段移出凝膠而滯留在膜上（2電轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)法利用電

13、場的電泳作用將凝膠中的利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相轉(zhuǎn)移到固相支持物上。支持物上。（3真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。 （五（五Southern雜交雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液探針的雜交液 2、雜交：液相中的、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測探針與膜上的待測DNA雜交雜交 雙鏈雙鏈DNA

14、探針需加熱變性為單鏈，再雜交探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA （六雜交結(jié)果檢測（六雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針（七（七Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量、特定基因定性和定量 3、基因突變分析、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析、限制性片段長度多態(tài)性的分析二、二、Nor

15、thern印跡雜交印跡雜交 1、基本原理和基本過程與、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同基本相同 2、鑒別、鑒別RNA 3、探針可用、探針可用DNA或或RNA片段片段 4、待測樣品為總、待測樣品為總RNA或或mRNANorthern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點印跡的不同點 1、變性：、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持持RNA處于變性狀態(tài)，處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳電泳前和電泳 中不變性中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，印跡時，DNA

16、轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為、靶核酸為RNA三、斑點及狹縫印跡雜交三、斑點及狹縫印跡雜交 1、斑點印跡為圓形、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀、狹縫印跡為線狀 3、鑒別、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交四、原位雜交 1、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原

17、位雜交；根據(jù)探針細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交雜交 保持組織細胞的形態(tài)保持組織細胞的形態(tài) 對核酸無抽提，修飾與降解作用對核酸無抽提，修飾與降解作用 不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用對雜交信號無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定理化性質(zhì)穩(wěn)定 2、雜交過程：、雜交過程：（1組織或細胞的固定組織或細胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：理想固定液應(yīng)具備：（2組織細胞雜交前的預(yù)處理組織細胞雜交前的預(yù)處理 去垢劑如去垢劑如Triton

18、 x-100和和SDS和蛋白酶和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì)去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載?？刂葡瘯r間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落片上脫落（3探針的選擇與標記探針的選擇與標記 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長度一般為探針的長度一般為50300bp ,有時達有時達1.5kb 放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時

19、間長 非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察于觀察（4雜交雜交 雜交液體積小：雜交液體積?。?020l cDNA和和RNA探針雜交溫度約為探針雜交溫度約為50 雜交時間雜交時間:DNA探針雜交為探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜探針雜交過夜 雜交前一般將組織切片置雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使分鐘使DNA變性變性 沖洗溫度一般沖洗溫度一般 不超過不超過50 （5雜交結(jié)果檢測雜交結(jié)果檢測 所用探針為核素標記所用探針為核素標記,放射自顯影檢測放射自顯影檢測 所用探針為非核素標記所用探針為非核素標記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測比色或化學(xué)發(fā)光檢測五

20、、液相雜交五、液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。（一（一RNA酶保護分析法酶保護分析法1、RNA酶保護分析法原理酶保護分析法原理 RNaseA和和RNaseT1專一水解雜交體系中的單專一水解雜交體系中的單鏈鏈RNA，不水解探針，不水解探針RNA與待測與待測RNA互補形成互補形成的雙鏈的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護，稱，使雜交分子得到保護，稱RNA酶酶保護分析法。保護分析法。2、雜交過程、雜交過程 制備待測制備待測RNA RNA探針的制備與標記

21、：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標探針的制備與標記：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標 記記RNA探針探針 雜交：待測雜交：待測RNA與與RNA探針在液相中雜交探針在液相中雜交 RNaseA和和RNaseTI除去單鏈除去單鏈RNA 電泳分離電泳分離RNA 放射自顯性檢測雜交結(jié)果放射自顯性檢測雜交結(jié)果（二核酸酶（二核酸酶S1保護分析法保護分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定條件下專一水解雜交體系中在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈的單鏈DNA和單鏈和單鏈RNA，不水解，不水解DNA探針與待測探針與待測RNA雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護，雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護，稱核酸酶稱核酸酶S1保護分析法保

22、護分析法2、雜交過程、雜交過程 制備待測制備待測RNA：總：總RNA或或mRNA均可均可 單鏈單鏈DNA探針的制備與標記探針的制備與標記 雜交：單鏈雜交：單鏈DNA探針與待測探針與待測RNA在液相中雜交在液相中雜交 核酸酶核酸酶S1除去單鏈除去單鏈DNA和單鏈和單鏈RNA 電泳分離電泳分離DNA/RNA雜交體分子雜交體分子 放射自顯影檢測雜交結(jié)果放射自顯影檢測雜交結(jié)果第三節(jié)第三節(jié) 探針的標記探針的標記一、探針的種類一、探針的種類 基因組基因組DNA探針探針 cDNA探針探針 RNA探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針二、標記物二、標記物 （一理想標記物應(yīng)具備的特性：（一理想標記物應(yīng)具備的特性：

23、高度靈敏性高度靈敏性 不影響堿基配對的特異性不影響堿基配對的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì)不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性(二二) 標記物種類標記物種類 核素標記物：核素標記物：32p、35s、3H 非核素標記物非核素標記物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光探針：標記物與某種底物反應(yīng)

24、發(fā)光， 如生物素?；膲A性磷酸酶如生物素酰化的堿性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光可使發(fā)光底物發(fā)光 三、標記方法三、標記方法 體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使代謝的底物，在細胞合成代謝時使 核素摻入到新核素摻入到新合成的核酸分子中，如合成的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到胸苷可摻入到DNA中，中， 3H-尿苷可摻入到尿苷可摻入到RNA中中 體外標記法：體外標記法： 化學(xué)標記法：標記物分子上的活性基因與化學(xué)標記法：標記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)，探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標記物直接結(jié)合到探針分子上標記物直接結(jié)

25、合到探針分子上 酶促標記法：標記物預(yù)先標記核苷酸，然酶促標記法：標記物預(yù)先標記核苷酸，然 后利用酶促法將標記的核苷酸后利用酶促法將標記的核苷酸 摻入到探針上摻入到探針上 酶促標記法酶促標記法（一切口平移法（一切口平移法nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA雙鏈上造成單鏈切口雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌、利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的53核核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步末端逐步切除切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53聚合酶催化下，聚合酶催化下，以互補的以互補的DNA單鏈為模板依次將單鏈為模板依次將dNTP連接到連接到切口的切口的3末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA鏈，同鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的時將標記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中鏈中（二隨機引物法（二隨機引物法 其原理是隨機引物能與各種單鏈其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，模板結(jié)合，