第十五章 核酸的的研究方法ppt課件

1、第十五章第十五章 核酸的研究方法核酸的研究方法1、核酸的分離、提純和定量測定、核酸的分離、提純和定量測定 DNA的分離 RNA的分離 核酸的定量Isolation of Nucleic AcidsGoals:removal of proteinsDNA vs RNAisolation of a specific type of nucleic acidTypes of Methods:differential solubilityadsorption methodsdensity gradient centrifugationTypes of DNA:genomic (chromosomal)

2、organellar (satellite)plasmid (extra-chromosomal)phage/viral (ds or ss)complementary (mRNA)General Features:denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic) enzyme treatmentsproteaseRNase (DNase-free)DNase (RNase-free)Collection of cellsUse soft brushes to dislodge epithelial cells lining th

3、e mouth. Ample cell collection is very critical for success.Whats in Lysis Buffer?Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stableSDS to dissolve membranes of cell, allowing DNA to be released into solutionSDS also denatures proteins, making them more susceptible to protease cleavageLysi

4、s bufferOSOOO-SDSCH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3-Why add Protease?Protease destroys nuclear proteins that bind DNA, and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA (nucleases)Protease treatment increases the yield of DNA Adding salt (5M NaCl)Na+ binds to phosphate groups of DN

5、A, neutralizing the electric charge of DNANaCl allows DNA molecules aggregate instead of repelling each other, making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is addedAdding ice cold alcoholDNA cannot dissolve in alcoholThe addition of cold alcohol makes the DNA clump together a

6、nd precipitate out of solutionPrecipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strandsMicroscopic oxygen bubbles “aggregate” or “fuse” together, simultaneously with the DNA precipitationThe larger, visible air bubbles act to “l(fā)ift” the DNA out of solution, from the aqueo

7、us into the organic phaseDNA PrecipitationHigh MW Genomic DNA IsolationTypical ProcedureCell Lysis0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)Phenol Extractiongentle rocking several hoursEthanol PrecipitationRNAse followed by proteinase KRepeat phenol extrac-tion and EtOH pptPhenol Extractionmix samp

8、le with equal volume of sat. phenol solnretain aqueous phaseoptional chloroform/isoamyl alcohol extraction(s) aqueous phase (nucleic acids) phenol phase (proteins)High MW Genomic DNA IsolationTypical ProcedureCell Lysis0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)Phenol Extractiongentle rocking severa

9、l hoursEthanol PrecipitationRNAse followed by proteinase KRepeat Phenol Extrac-tion and EtOH pptEtOH Precipitation2-2.5 volumes EtOH, -20ohigh salt, pH 5-5.5centrifuge or spool outIsolation of RNASpecial Considerations RNAse inhibitors! extraction in guanidine salts phenol extractions at pH 5-6 (pH

10、8 for DNA) treatment with RNase-free DNase selective precipitation of high MW forms (rRNA, mRNA) with LiCl oligo-dT column2 2、核酸的沉降特性、核酸的沉降特性 通常很難分離出完整DNA分子，但可得到分子量不太大的環(huán)狀DNA，這類制劑包括：共價閉環(huán)DNA：常呈超螺旋型開環(huán)DNA：雙鏈環(huán)狀DNA的一條鏈斷裂，分子呈松弛態(tài)線型DNA：環(huán)狀DNA的雙鏈斷開 在超速離心機造成的離心力場中，溶液中的核酸下沉在超速離心機造成的離心力場中，溶液中的核酸下沉的速率會大大加快，這是核酸的沉降

11、特性，該技術(shù)可的速率會大大加快，這是核酸的沉降特性，該技術(shù)可研究：研究： 核酸在溶液中的構(gòu)象核酸在溶液中的構(gòu)象 測定核酸的沉降系數(shù)和相對分子量測定核酸的沉降系數(shù)和相對分子量氯化銫密度梯度沉降平衡超離心法 核酸密度測定 測定DNA中G-C之含量 溶液中核酸構(gòu)象的研究 用于核酸的制備Density Gradient Centrifugation rate zonal/sucrose (size fractionation) electrophoresis more common isopycnic/CsCl (density) DNA 1.7 g/cm3 protein 1.3 g/cm3 RNA

12、 DNA ssDNA dsDNA GC content20406080% GC base pairs1.681.701.721.74density (g/cm3)CsCl GradientsApplicationslarge scale preparationshigh puritysatellite DNARNA cushionsCsCl Gradients三、核酸的凝膠電泳三、核酸的凝膠電泳凝膠電泳兼有分子篩和電泳的雙重效果凝膠電泳兼有分子篩和電泳的雙重效果不純核酸樣品：不純核酸樣品：瓊脂糖凝膠電泳分離出區(qū)帶瓊脂糖凝膠電泳分離出區(qū)帶溴化乙錠染色溴化乙錠染色紫外燈下粗略估計含量紫外燈下粗略估

13、計含量電泳遷移率取決于：電泳遷移率取決于： 核酸分子大小 膠濃度 DNA的構(gòu)象 電流 堿基組成 溫度凝膠電泳的樣品可進行回收 聚丙烯酰胺作為支持物 孔徑小于丙烯酰胺 可分析小于1000bp的DNA片斷聚丙烯酰胺凝膠電泳4 4、核酸的核苷酸序列測定、核酸的核苷酸序列測定DNA一級結(jié)構(gòu)的測定 Sanger發(fā)明的末端終止法 M. Maxam和W. Gilbert 發(fā)明的化學(xué)斷裂法 焦磷酸測序 。 前兩種方法一般都會用放射性32P對DNA進行標(biāo)記，需要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對長度不同的核酸片段進行分離，分離以后還需要使用放射自顯影的技術(shù)進行觀察和分析。目前已普遍使用熒光物質(zhì)代替放射性同位素對DN

14、A進行標(biāo)記。焦磷酸測序是新一代DNA序列分析技術(shù)，該項技術(shù)無需電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，操作極為簡便。末端終止法 末端終止法也叫雙脫氧法。要想理解此方法的原理，需要對DNA復(fù)制的過程有所了解。DNA是一種雙螺旋分子，其復(fù)制是在DNA聚合酶催化下，以原來的兩條母鏈上的核苷酸序列為模板，通過互補配對的方式合成新DNA鏈的過程。復(fù)制需要引物和四種dNTPs，總是從5-端向3-端進行。細胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物一般是RNA，但體外DNA復(fù)制的引物可以是人工合成的與模板鏈互補的一段寡聚脫氧核苷酸。復(fù)制開始于引物3-端自由的羥基，依據(jù)堿基互補配對的原則，不斷地形成新的3,5-磷酸二酯鍵，使DNA鏈得到延

15、伸，直到一個新的DNA分子完全被合成。末端終止法? 進行四組平行反應(yīng)? 每一組反應(yīng)混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP，有一種被32P標(biāo)記? 每一組反應(yīng)含有一種少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。? 在多數(shù)情況下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。? 有時，聚合酶使用ddNTP，而導(dǎo)致末端終止。? 每一組反應(yīng)中ddNTP的隨機插入留下一系列長度不等的以該雙脫氧核苷酸結(jié)尾的DNA鏈。? 對每一組反應(yīng)混合物走凝膠電泳。? 片段越短，走的越快，就越靠近凝膠的底部。? 從凝膠的底部向上讀出序列。? 將讀出的序列轉(zhuǎn)化成互補鏈的序列?；瘜W(xué)斷裂法 其基本原理是用特

16、殊的化學(xué)試劑，處理待測的具有末端放射性同位素32P標(biāo)記的單鏈DNA或者只有一條鏈的末端被放射性同位素標(biāo)記的雙鏈DNA片段，造成特定堿基的修飾、脫落和戊糖-磷酸骨架被特異性切割，從而產(chǎn)生一組長度不同的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。化學(xué)斷裂法 進行四組平行的反應(yīng)： G特異性剪切 在堿性條件下，先用硫酸二甲酯（ DMS ）處置，然后再使用哌啶處理。 嘌呤堿基特異性剪切DNA先進行酸處理，然后再加DMS。 嘧啶堿基特異性剪切先用肼處理，然后用哌啶處理。 C特異性剪切在高鹽濃度下，先用肼處理，然后用哌啶處理。 即進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射

17、自顯影。比較G、AG、CT和C各個泳道，自下而上從自顯影片上就可讀出DNA序列。焦磷酸測序 焦磷酸測序需要在同一反應(yīng)體系中發(fā)生由4種特異性酶催化的級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈的3-端并釋放出等量的焦磷酸基團PPi）。PPi可轉(zhuǎn)化為可見光信號，并最終轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第一輪反應(yīng)結(jié)束后，再加入下一種dNTP，繼續(xù)下一輪DNA鏈的合成。DNA自動分析儀的組成自動分析儀的組成RNA一級結(jié)構(gòu)的測定 目前用來測定RNA一級結(jié)構(gòu)的方法主要有：（1先使用逆轉(zhuǎn)錄酶將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cD

18、NA，然后再使用Sanger的末端終止法進行測定；（2用化學(xué)或/和酶學(xué)方法對放射性同位素標(biāo)記的RNA進行部分消化后，再進行聚丙烯酰胺電泳分析；（3質(zhì)譜法DNA Sequencing Analysis Sanger dideoxynucleotide chain termination analysis Procedure for the Sanger dideoxy chain termination technique DNA to be sequenced is cloned into a vector, adjacent to a primer site Four reactions a

19、re set up - each containing one of four ddNTPs DNA is synthesized in the presence of the ddNTPs, giving rise to sets of DNA products representing all of the possible size fragments for the unknown sequence The fragments are resolved by gel electrophoresis and the sequenceis read up from the bottom o

20、f the gel by identifying the lane givingthe next larger size fragment DNA to be sequenced is cloned into the EcoRI site immediately adjacent to the primer binding siteEcoRISal I gene for ampicillinresistancegene for tetracycline resistancePst Ioriprimer binding sitepBR32253|3 For sequencing the DNA

21、is denatured into single strands the primer is hybridized to the template strand DNA is synthesized using DNA polymerase structure of a dNTP structure of a ddNTP (dideoxynucleotide)OBASE (A, T, G, C)HOOPOPOPCOOOO-O-O-O-OHOOOOBASE (A, T, G, C)OPOPOPCO-O-O-O-OH53|ddATPDNAdNTPsddTTPDNAdNTPsddGTPDNAdNTP

22、sddCTPDNAdNTPsA T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C T AT A G T AT A G T A C AT A G T A C A G T AT A G T A C A G T A G T T C AT A G T A C A G T A G T T C A G A All possible products of the reactioncontaining ddATP Each fragment is terminated by a ddA53|A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A

23、C ATGCTAGTACAGTAGTTCAGATCGTG Longer fragmentsShorter fragmentsSequenceof thestrandthat wassynthesized5 5、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCRPCRPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction即聚合即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNADNA聚合酶催化下，以母聚合酶催化下，以母鏈鏈DNADNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母變性、退火、延伸等步驟，體外

24、復(fù)制出與母鏈模板鏈模板DNADNA互補的子鏈互補的子鏈DNADNA的過程。是一項的過程。是一項DNADNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的增任何目的DNADNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。多方面。PCR技術(shù)的基本原理 PCR反應(yīng)成分： 1.模板DNA；2.引物；3.四種脫氧核糖核苷酸； 4.DNA聚合酶；5.反應(yīng)緩沖液、Mg2+等。 PCR反應(yīng)基本步驟： 1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈94，30s）。 2.退火：低溫下，引物與

25、模板DNA互補區(qū)結(jié)合55，30s）。 3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)7072，3060s）5GGATCTAGCGTATGCTTGAAA33CCTAGATCGCATACGAACTTT5模板DNA3 GAACTTT 5引物15GGATCTA 3引物2圖1 PCR引物與模板結(jié)合示意圖1.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。2.退火(annealling)：當(dāng)溫度降低時，引物與模板DNA中互補區(qū)域結(jié)合成雜交分子。3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶

26、催化引物按53方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈。 以上述三個步驟為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。模板DNA55退火70延伸2530 次循環(huán)目的片段擴增2n倍94變性PCR原理示意圖PCR反應(yīng)產(chǎn)物積累規(guī)律示意圖平臺期產(chǎn)物量時間6、DNA的化學(xué)合成 寡核苷酸的化學(xué)合成起步于寡核苷酸的化學(xué)合成起步于2020世紀(jì)四十年代末世紀(jì)四十年代末 19551955年，劍橋大學(xué)的年，劍橋大學(xué)的ToddTodd實驗室成功合成了具有磷酸二酯實驗室成功合成了具有磷酸二酯鍵結(jié)構(gòu)的鍵結(jié)構(gòu)的TpT,TpT,并獲得并獲得19571957年諾貝爾獎年諾

27、貝爾獎 19651965年，年，KhoranaKhorana等利用化學(xué)方法大量合成脫氧核苷的單一等利用化學(xué)方法大量合成脫氧核苷的單一聚合物或二種、三種脫氧核苷的重復(fù)序列，人工合成的六十聚合物或二種、三種脫氧核苷的重復(fù)序列，人工合成的六十四種核糖三糖苷，研究蛋白質(zhì)的生物合成過程，從而確定了四種核糖三糖苷，研究蛋白質(zhì)的生物合成過程，從而確定了氨基酸的三聯(lián)密碼子，因此而獲得氨基酸的三聯(lián)密碼子，因此而獲得19681968年諾貝爾獎年諾貝爾獎 六十至七十年代，寡核苷酸的化學(xué)合成方法不斷完善，逐漸六十至七十年代，寡核苷酸的化學(xué)合成方法不斷完善，逐漸形成了今天被廣泛應(yīng)用的固相亞磷酸三酯法并實現(xiàn)了合成的形成了

28、今天被廣泛應(yīng)用的固相亞磷酸三酯法并實現(xiàn)了合成的自動化自動化 固相合成寡核苷酸 Routine process Microprocessor-controlled instrument Synthesis on a solid support First base(3) attached to solid support Synthesis direction is 35DNADNA的合成有磷酸三酯法、亞磷酰胺法、氫磷酸的合成有磷酸三酯法、亞磷酰胺法、氫磷酸法等，現(xiàn)在常用的是固相亞磷酰胺法法等，現(xiàn)在常用的是固相亞磷酰胺法 合成時所用單體不是脫氧核苷三磷酸，而是核苷合成時所用單體不是脫氧核苷三磷酸

29、，而是核苷酸的亞磷酰胺衍生物酸的亞磷酰胺衍生物二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基DMTDMT） 經(jīng)過化學(xué)修飾的核苷酸 33位位P P上二異丙胺基，縮合所用的功能基上二異丙胺基，縮合所用的功能基 33位位P P上腈乙基，保護基，合成完畢后脫去。上腈乙基，保護基，合成完畢后脫去。 5-DMT5-DMT，保護基，縮合前脫去。，保護基，縮合前脫去。 A A和和C C的雜環(huán)氨基上的苯甲酸保護基，合成完畢的雜環(huán)氨基上的苯甲酸保護基，合成完畢后脫去。后脫去。 G G上嘌呤環(huán)氨基上的異丙酰保護基，合成完畢上嘌呤環(huán)氨基上的異丙酰保護基，合成完畢后脫去。后脫去。固相支持物 最常用的固相載體為可控微孔玻璃珠最常用的固

30、相載體為可控微孔玻璃珠CPGCPG，controlled pore glasscontrolled pore glass），），CPGCPG的孔徑根據(jù)所合的孔徑根據(jù)所合成的寡核苷酸的長度而定，一般合成鏈長小于成的寡核苷酸的長度而定，一般合成鏈長小于60nt60nt時，選擇孔徑時，選擇孔徑500500埃，鏈長大于埃，鏈長大于60nt60nt時，時，使用使用10001000埃埃CPGCPG，使用，使用CPGCPG的縮合效率高達的縮合效率高達98%-99.9%98%-99.9%，可以滿足合成長達，可以滿足合成長達175nt175nt的寡核的寡核苷酸的條件。苷酸的條件。CPGCPG通過連接化合物與初始

31、核苷通過連接化合物與初始核苷酸的羥基共價結(jié)合，核苷酸的酸的羥基共價結(jié)合，核苷酸的55羥基用二甲羥基用二甲氧基三苯甲基氧基三苯甲基DMTDMT維護。維護。 合成過程中的第一個寡核苷酸合成的具體步驟 去封閉去封閉, ,用三氯乙酸去除用三氯乙酸去除CPGCPG所連核苷上的所連核苷上的DMT,DMT,以暴露以暴露55羥基，羥基，供下一步縮合。供下一步縮合。 活化活化, ,在縮合之前，單體與四唑混合并進入合成柱，此時四唑提在縮合之前，單體與四唑混合并進入合成柱，此時四唑提供一個質(zhì)子給供一個質(zhì)子給33磷酸上二異丙胺基的磷酸上二異丙胺基的NN原子，質(zhì)子化的二異丙原子，質(zhì)子化的二異丙胺是一個良好的游離基團，與四唑形成亞磷酰胺四唑這種活性中胺是一個良好的游離基團，與四唑形成亞