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1、動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課件動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課件1212免疫組化生長(zhǎng)抑素免疫組化生長(zhǎng)抑素免疫組織化學(xué)的方法(一)酶標(biāo)記抗體組化法(一)酶標(biāo)記抗體組化法 1、基本原理:通過(guò)共價(jià)鍵將酶連接在抗體上,制成酶標(biāo)抗體,再借酶對(duì)底物的特異催化作用,生成、基本原理:通過(guò)共價(jià)鍵將酶連接在抗體上,制成酶標(biāo)抗體,再借酶對(duì)底物的特異催化作用,生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位。種抗原成分的定位。根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為:根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為: 直接法(一步法)直接法(

2、一步法) 間接法(二步法)間接法(二步法) 橋聯(lián)法(多步法)橋聯(lián)法(多步法)根據(jù)的方式:根據(jù)的方式: 抗原抗原-抗體連接:過(guò)氧化物酶抗體連接:過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶(抗過(guò)氧化物酶(PAP) 親和連接:卵白素親和連接:卵白素-生物素生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC) 鏈霉菌抗生物素蛋白鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(過(guò)氧化物酶連接(SP) 2、標(biāo)記酶:、標(biāo)記酶: 辣根過(guò)氧化物酶(辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶()、堿性磷酸酶(ALP)和葡萄糖氧化酶()和葡萄糖氧化酶(GOD)3、底物顯色劑、底物顯色劑 : DAB (3,3-二氨基聯(lián)苯胺):顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色

3、。二氨基聯(lián)苯胺):顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。 AEC (3,氨基,氨基-9- 乙基卡巴唑):顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色乙基卡巴唑):顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色。 (二)葡萄球菌蛋白二)葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫檢測(cè)技術(shù))免疫檢測(cè)技術(shù) 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)是一種從金黃色葡萄球菌)是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì),由于它的一些免疫學(xué)特性,細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì),由于它的一些免疫學(xué)特性,使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)它能)免疫檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)它能與多種動(dòng)物與多種動(dòng)物IgG

4、的的Fc 端結(jié)合的原理,用端結(jié)合的原理,用SPA標(biāo)記標(biāo)記物(酶、熒光素、放射性物質(zhì)等)顯示抗原與抗物(酶、熒光素、放射性物質(zhì)等)顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)的目的熟悉冰凍切片機(jī)的使用;熟悉冰凍切片機(jī)的使用;掌握免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般流程;掌握免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般流程;了解生長(zhǎng)抑素在小鼠腦組織的一般分布了解生長(zhǎng)抑素在小鼠腦組織的一般分布。 本實(shí)驗(yàn)程序本實(shí)驗(yàn)程序1、取材并制備冰凍切片、取材并制備冰凍切片 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以腹腔注射麻醉20%氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯(1mg/g體重)體重) 0.05ml /10g; 開(kāi)胸,經(jīng)左心室向

5、升主動(dòng)脈快速灌注開(kāi)胸,經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈快速灌注37 生理鹽生理鹽水,繼之灌注水,繼之灌注4 40 g/L多聚甲醛,先快后慢,多聚甲醛,先快后慢,于于30 min內(nèi)灌注完;灌注壓力內(nèi)灌注完;灌注壓力18-20.5kPa,灌注,灌注流量流量10-11ml/min。生理鹽水的時(shí)間約。生理鹽水的時(shí)間約2分鐘,多分鐘,多聚甲醛的約聚甲醛的約10-15分鐘。分鐘。 開(kāi)顱取腦,置于多聚甲醛固定液中固定開(kāi)顱取腦,置于多聚甲醛固定液中固定24h; 移入含移入含30%蔗糖的磷酸緩沖液(蔗糖的磷酸緩沖液(pH7.2, 0.01 mol/L)中,中,4冰箱中放置過(guò)夜至組織塊沉底;?天冰箱中放置過(guò)夜至組織塊沉底;?天

6、 -20 冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片(額斷切片)(額斷切片),片厚,片厚20m。 切片機(jī)的調(diào)試:開(kāi)機(jī)預(yù)冷至切片機(jī)的調(diào)試:開(kāi)機(jī)預(yù)冷至-20 組織塊的固定組織塊的固定 2、免疫、免疫細(xì)胞細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng) 切片室溫下復(fù)溫切片室溫下復(fù)溫45-60分鐘分鐘(2)ddw沖洗沖洗5分鐘分鐘(3) 0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3 次次(4)3%過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫-甲醇洗甲醇洗10分鐘分鐘(5)0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3(6)0.5%Triton X-100洗洗10分鐘分鐘(7)0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3(8)即用型酶消化液)即用型酶消化液4 1

7、5-20分鐘分鐘(9)0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3(10)10%山羊血清封閉液室溫孵育山羊血清封閉液室溫孵育15-20分鐘,傾去勿分鐘,傾去勿洗洗(11) 滴加一抗滴加一抗4過(guò)夜,過(guò)夜,24小時(shí)小時(shí)(12)復(fù)溫)復(fù)溫30分鐘分鐘(13)0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3(14)滴加二抗室溫或)滴加二抗室溫或37濕盒孵育濕盒孵育30分鐘分鐘(15)0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3(16)滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫或)滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫或37濕盒孵育濕盒孵育30分鐘分鐘(17)0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3(18)滴加)滴加DAB室溫避光

8、顯色室溫避光顯色3-5分鐘至顯色,自來(lái)水洗終止反應(yīng)分鐘至顯色,自來(lái)水洗終止反應(yīng)(19)蘇木素復(fù)染)蘇木素復(fù)染2-3分鐘,水洗終止反應(yīng),分化液(分鐘,水洗終止反應(yīng),分化液(0.5%鹽鹽 酸酸-75%酒酒精)分化,自來(lái)水反藍(lán)精)分化,自來(lái)水反藍(lán)(20)脫水()脫水(70%-85%-90%-95%-100%酒精各酒精各5分鐘,透明(二甲苯分鐘,透明(二甲苯5分分鐘),中性樹(shù)膠封片鐘),中性樹(shù)膠封片3、觀察結(jié)果:光鏡下觀察,照相、觀察結(jié)果:光鏡下觀察,照相免疫組化實(shí)驗(yàn)需要配制的試劑:免疫組化實(shí)驗(yàn)需要配制的試劑: 1、 0.1 M PB (PH7.2-7.4)0.2Mol/L:Na2HPO42 H2O溶

9、液溶液35.61g/L或或Na2HPO412 H2O溶液含溶液含71.64g/L0.2Mol/L:NaH2PO4H2O溶液含溶液含27.60g/L或或NaH2PO42 H2O溶液含溶液含31.21g/L0.2 Mol/L Na2HPO4 750ml +0.2Mol/L NaH2PO4 250ml+1000 ml雙蒸餾水雙蒸餾水=0.1 M PB (PH7.2-7.4)2 、 0.01M PBS (PH 7.2-7.4):0.1 M PB 100ml 加加NaCL: 8.5g和和KCL: 0.2g加雙蒸餾加雙蒸餾水至水至1000 ml 3、30%蔗糖溶液:蔗糖溶液:30g的蔗糖加的蔗糖加0.1

10、M PB(PH 7.2-7.4)至至100ml4、0.5% TritonX100:99% TritonX100 0.5ml 加加0.01M PBS 99.5ml5、 4%多聚甲醛固定液:多聚甲醛多聚甲醛固定液:多聚甲醛20g加加 0.1M PB至至500ml6、DAB-的配置(現(xiàn)配現(xiàn)用):的配置(現(xiàn)配現(xiàn)用):6mg DAB溶于溶于10ml TBS (0.5M PH7.6); 再加入再加入0.1ml濃度為濃度為3%的的H2O27、3%的的H2O2 8、TBS (0.5M PH7.6):):Tris-Cl 緩沖液緩沖液 (0.5M PH7.6:100ml加加NaCl 8.5-9g加雙蒸加雙蒸水至水至1000ml9、0.5M( PH7.6)Tris-Cl 緩沖液:緩沖液:Tris 60.57g 加加1M HCl 約約420ml加雙蒸水至加雙蒸水至1000ml10、1M HCl11、5%戊巴比妥鈉(巴比妥鈉):戊巴比妥鈉(巴比妥鈉):2.5g 戊巴比妥鈉(巴比妥鈉)加戊巴比妥鈉(巴比妥鈉)加50ml生理鹽水生理鹽水(0.2 ml/10g,小鼠用量

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