動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課件12免疫組化生長(zhǎng)抑素

1、動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課件動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課件1212免疫組化生長(zhǎng)抑素免疫組化生長(zhǎng)抑素免疫組織化學(xué)的方法（一）酶標(biāo)記抗體組化法（一）酶標(biāo)記抗體組化法 1、基本原理：通過(guò)共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成、基本原理：通過(guò)共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位。種抗原成分的定位。根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為：根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為： 直接法（一步法）直接法（

2、一步法） 間接法（二步法）間接法（二步法） 橋聯(lián)法（多步法）橋聯(lián)法（多步法）根據(jù)的方式：根據(jù)的方式： 抗原抗原-抗體連接：過(guò)氧化物酶抗體連接：過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（抗過(guò)氧化物酶（PAP) 親和連接：卵白素親和連接：卵白素-生物素生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC) 鏈霉菌抗生物素蛋白鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接（過(guò)氧化物酶連接（SP) 2、標(biāo)記酶：、標(biāo)記酶： 辣根過(guò)氧化物酶（辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（）、堿性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（）和葡萄糖氧化酶（GOD）3、底物顯色劑、底物顯色劑 ： DAB （3，3-二氨基聯(lián)苯胺）：顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色

3、。二氨基聯(lián)苯胺）：顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。 AEC （3，氨基，氨基-9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色乙基卡巴唑）：顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色。 （二）葡萄球菌蛋白二）葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測(cè)技術(shù)）免疫檢測(cè)技術(shù) 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A（SPA）是一種從金黃色葡萄球菌）是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它的一些免疫學(xué)特性，細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它的一些免疫學(xué)特性，使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)它能）免疫檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)它能與多種動(dòng)物與多種動(dòng)物IgG

4、的的Fc 端結(jié)合的原理，用端結(jié)合的原理，用SPA標(biāo)記標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)的目的熟悉冰凍切片機(jī)的使用；熟悉冰凍切片機(jī)的使用；掌握免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般流程；掌握免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般流程；了解生長(zhǎng)抑素在小鼠腦組織的一般分布了解生長(zhǎng)抑素在小鼠腦組織的一般分布。 本實(shí)驗(yàn)程序本實(shí)驗(yàn)程序1、取材并制備冰凍切片、取材并制備冰凍切片 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以腹腔注射麻醉20%氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯（1mg/g體重）體重） 0.05ml /10g； 開(kāi)胸，經(jīng)左心室向

5、升主動(dòng)脈快速灌注開(kāi)胸，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈快速灌注37 生理鹽生理鹽水，繼之灌注水，繼之灌注4 40 g/L多聚甲醛，先快后慢，多聚甲醛，先快后慢，于于30 min內(nèi)灌注完；灌注壓力內(nèi)灌注完；灌注壓力18-20.5kPa，灌注，灌注流量流量10-11ml/min。生理鹽水的時(shí)間約。生理鹽水的時(shí)間約2分鐘，多分鐘，多聚甲醛的約聚甲醛的約10-15分鐘。分鐘。 開(kāi)顱取腦，置于多聚甲醛固定液中固定開(kāi)顱取腦，置于多聚甲醛固定液中固定24h； 移入含移入含30%蔗糖的磷酸緩沖液（蔗糖的磷酸緩沖液（pH7.2, 0.01 mol/L）中，中，4冰箱中放置過(guò)夜至組織塊沉底；？天冰箱中放置過(guò)夜至組織塊沉底；？天

6、 -20 冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片（額斷切片）（額斷切片），片厚，片厚20m。 切片機(jī)的調(diào)試：開(kāi)機(jī)預(yù)冷至切片機(jī)的調(diào)試：開(kāi)機(jī)預(yù)冷至-20 組織塊的固定組織塊的固定 2、免疫、免疫細(xì)胞細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng) 切片室溫下復(fù)溫切片室溫下復(fù)溫45-60分鐘分鐘（2）ddw沖洗沖洗5分鐘分鐘（3） 0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3 次次（4）3%過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫-甲醇洗甲醇洗10分鐘分鐘（5）0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3（6）0.5%Triton X-100洗洗10分鐘分鐘（7）0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3（8）即用型酶消化液）即用型酶消化液4 1

7、5-20分鐘分鐘（9）0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3（10）10%山羊血清封閉液室溫孵育山羊血清封閉液室溫孵育15-20分鐘，傾去勿分鐘，傾去勿洗洗（11） 滴加一抗滴加一抗4過(guò)夜，過(guò)夜，24小時(shí)小時(shí)（12）復(fù)溫）復(fù)溫30分鐘分鐘（13）0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3（14）滴加二抗室溫或）滴加二抗室溫或37濕盒孵育濕盒孵育30分鐘分鐘（15）0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3（16）滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫或）滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫或37濕盒孵育濕盒孵育30分鐘分鐘（17）0.01M PBS洗洗5分鐘分鐘X3（18）滴加）滴加DAB室溫避光

8、顯色室溫避光顯色3-5分鐘至顯色，自來(lái)水洗終止反應(yīng)分鐘至顯色，自來(lái)水洗終止反應(yīng)（19）蘇木素復(fù)染）蘇木素復(fù)染2-3分鐘，水洗終止反應(yīng)，分化液（分鐘，水洗終止反應(yīng)，分化液（0.5%鹽鹽 酸酸-75%酒酒精）分化，自來(lái)水反藍(lán)精）分化，自來(lái)水反藍(lán)（20）脫水（）脫水（70%-85%-90%-95%-100%酒精各酒精各5分鐘，透明（二甲苯分鐘，透明（二甲苯5分分鐘），中性樹(shù)膠封片鐘），中性樹(shù)膠封片3、觀察結(jié)果：光鏡下觀察，照相、觀察結(jié)果：光鏡下觀察，照相免疫組化實(shí)驗(yàn)需要配制的試劑：免疫組化實(shí)驗(yàn)需要配制的試劑： 1、 0.1 M PB (PH7.2-7.4)0.2Mol/L：Na2HPO42 H2O溶

9、液溶液35.61g/L或或Na2HPO412 H2O溶液含溶液含71.64g/L0.2Mol/L：NaH2PO4H2O溶液含溶液含27.60g/L或或NaH2PO42 H2O溶液含溶液含31.21g/L0.2 Mol/L Na2HPO4 750ml +0.2Mol/L NaH2PO4 250ml+1000 ml雙蒸餾水雙蒸餾水=0.1 M PB (PH7.2-7.4)2 、 0.01M PBS (PH 7.2-7.4)：0.1 M PB 100ml 加加NaCL: 8.5g和和KCL: 0.2g加雙蒸餾加雙蒸餾水至水至1000 ml 3、30%蔗糖溶液：蔗糖溶液：30g的蔗糖加的蔗糖加0.1

10、M PB(PH 7.2-7.4)至至100ml4、0.5% TritonX100：99% TritonX100 0.5ml 加加0.01M PBS 99.5ml5、 4%多聚甲醛固定液：多聚甲醛多聚甲醛固定液：多聚甲醛20g加加 0.1M PB至至500ml6、DAB-的配置（現(xiàn)配現(xiàn)用）：的配置（現(xiàn)配現(xiàn)用）：6mg DAB溶于溶于10ml TBS (0.5M PH7.6); 再加入再加入0.1ml濃度為濃度為3%的的H2O27、3%的的H2O2 8、TBS （0.5M PH7.6）：）：Tris-Cl 緩沖液緩沖液 （0.5M PH7.6:100ml加加NaCl 8.5-9g加雙蒸加雙蒸水至水至1000ml9、0.5M（ PH7.6）Tris-Cl 緩沖液：緩沖液：Tris 60.57g 加加1M HCl 約約420ml加雙蒸水至加雙蒸水至1000ml10、1M HCl11、5%戊巴比妥鈉（巴比妥鈉）：戊巴比妥鈉（巴比妥鈉）：2.5g 戊巴比妥鈉（巴比妥鈉）加戊巴比妥鈉（巴比妥鈉）加50ml生理鹽水生理鹽水（0.2 ml/10g，小鼠用量