功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

1、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁(yè)，共34頁(yè) 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)是指對(duì)蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與DNA/RNA 間的相互作用的研究。以細(xì)胞內(nèi)與某個(gè)功能有關(guān)或某種條件下的一群蛋白質(zhì)為主要研究?jī)?nèi)容， 由此建立細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁(yè)，共34頁(yè) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 噬菌體展示技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁(yè)，共34頁(yè) 蛋白質(zhì)芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面，形成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁(yè)，共34頁(yè) 依據(jù)被檢測(cè)蛋白樣品的標(biāo)記種類(lèi)來(lái)選擇不同的檢測(cè)設(shè)備對(duì)蛋白質(zhì)芯片

2、反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)。熒光標(biāo)記是芯片息采集中使用最多也是最成功的報(bào)告標(biāo)志。雜交反后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過(guò)芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以進(jìn)行分析，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)成數(shù)據(jù)，即可獲得有關(guān)生物信息?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁(yè)，共34頁(yè)根據(jù)固定介質(zhì)的不同,可以分為兩大類(lèi): 化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片（SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片） 生物型蛋白質(zhì)芯片（如抗體、受體、配體等）；根據(jù)片基材料的不同可以分為： 膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁(yè)，共34頁(yè)目前常用蛋白質(zhì)芯片有： 1. SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片 2. 抗體芯片 3. 靶蛋白質(zhì)芯片 4. 液相蛋白質(zhì)芯片現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁(yè)，共34頁(yè)

3、表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption /ionization time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS ）蛋白質(zhì)芯片由部分組成：蛋白質(zhì)芯片、閱讀器和分析軟件。 蛋白質(zhì)芯片是核心部分，芯片上固定的介質(zhì)可以是陰離子、陽(yáng)離子、疏水性、親水性、金屬等，根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)特性而有選擇性地捕獲特異的蛋白質(zhì)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁(yè)，共34頁(yè) 技術(shù)的基本原理: 將待測(cè)樣品(血清、尿液、分泌液、細(xì)胞裂解液等)滴到芯片表面，通過(guò)親合作用樣品中的某些蛋白質(zhì)被吸附到芯片的固相基質(zhì)表面上，用緩沖液洗去芯片上的

4、雜質(zhì)蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（energy absorbing molecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轟擊，蛋白質(zhì)在吸收能量后被解析發(fā)生離子化， 在電場(chǎng)力作用下脫離芯片表面， 被離子檢測(cè)器所檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)軟件分析處理后， 可繪制出質(zhì)譜圖，顯示相關(guān)蛋白質(zhì)的分子量、含量等信息?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁(yè)，共34頁(yè) 抗體芯片主要研究在不同生理或病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)水平的量變。微型化、集成化、高通量化是抗體芯片重要特點(diǎn)。 芯片上排列了許多已知蛋白質(zhì)的單克隆抗體，這些單克隆抗體對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)（抗原）都是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上十分重要的蛋白，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞

5、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡等廣泛的領(lǐng)域。 抗體芯片檢測(cè)的結(jié)果不是蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量而是目的蛋白質(zhì)在兩個(gè)樣品之間的相對(duì)峰度。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁(yè)，共34頁(yè) 主要用于蛋白質(zhì)相互作用研究、蛋白表達(dá)研究和小分子蛋白結(jié)合研究。 靶蛋白質(zhì)的獲得：1.化學(xué)合成；2.基因工程表達(dá)蛋白質(zhì)并進(jìn)行純化、點(diǎn)樣制作芯片； 3.將活的生物體(如細(xì)菌、酵母等)在芯片上原位表 達(dá)蛋白質(zhì)（living芯片） 。4.將核酸固定在芯片介質(zhì)中，然后利用不依賴(lài)細(xì)胞 的體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)，在原位合成靶蛋白?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁(yè)，共34頁(yè) 是一種新型的、高度靈活的多元蛋白質(zhì)研究平臺(tái)。 液相芯片體系由許多不同的小球體為主要基質(zhì)，每種小球體上固定有不同的探針

6、分子，將這些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)。在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，在球形基質(zhì)的制造過(guò)程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分類(lèi)熒光，根據(jù)這兩種紅色分類(lèi)熒光的比例不同(色彩編號(hào))，區(qū)分不同的探針。 可同時(shí)固定各種蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物分子，可以對(duì)同一個(gè)樣品中的多個(gè)不同的分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁(yè)，共34頁(yè)自1985年Smith G P等創(chuàng)建噬菌體展示技術(shù)，其原理是：以經(jīng)過(guò)改建的噬菌體為載體，把外源基因插入噬菌體外殼蛋白基因P區(qū)或P區(qū)，從而使表達(dá)的外源肽或蛋白質(zhì)展示在噬菌體的表面，并使表達(dá)產(chǎn)物保持良好的空間構(gòu)象。進(jìn)而通過(guò)親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白

7、質(zhì)的噬菌體，最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁(yè)，共34頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁(yè)，共34頁(yè) 這一技術(shù)有效地實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的體外轉(zhuǎn)換，即在二者之間架起了聯(lián)結(jié)的橋梁，使得研究者完全可以在分子克隆的基礎(chǔ)上，有效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)象的體外控制，從而可以在體外獲得具有良好生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁(yè)，共34頁(yè) Navagen公司用T7噬菌體構(gòu)建的各種cDNA表達(dá)文庫(kù)，將外源基因序列插入到編碼T7噬菌體包膜蛋白基因中所表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)以與噬菌體包膜蛋白融合的形式展示在噬菌體表面。 T7噬菌體展示文庫(kù)可以展示相當(dāng)部分表達(dá)的蛋白質(zhì)，甚至可以保持蛋白的一定構(gòu)象。因此，該系統(tǒng)

8、最大程度地再現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況，所篩選出的結(jié)合蛋白與自然狀態(tài)較為接近。目前已被成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、抗原-抗體以及DNA-蛋白質(zhì)之間作用的研究，為功能基因組學(xué)的研究提供了一種新的方法。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁(yè)，共34頁(yè) cDNA庫(kù)是在噬菌體衣殼蛋白的基因中插入從某些組織或細(xì)胞中抽提出來(lái)的mRNA的互補(bǔ)DNA片段，從而表達(dá)該組織或細(xì)胞的各種蛋白于噬菌體的表面。 如：抗體庫(kù)的構(gòu)建如：抗體庫(kù)的構(gòu)建 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁(yè)，共34頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁(yè)，共34頁(yè) 1. 與蛋白質(zhì)相互作用的研究 有研究利用T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)，以絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p38作為靶蛋白，篩選了與其

9、有結(jié)合關(guān)系的多肽或蛋白，得到了46個(gè)編碼蛋白的序列，在這些蛋白中有激酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和離子通道相關(guān)蛋白等。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁(yè)，共34頁(yè)2. 在篩選和制備多肽藥物方面的研究及應(yīng)用 隨機(jī)噬菌體展示多肽文庫(kù)：一組隨機(jī)編碼序列或基因群插入噬菌體載體進(jìn)行表達(dá)及展示時(shí),就形成噬菌體展示文庫(kù)，在文庫(kù)中,每個(gè)噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈,不同噬菌體粒子展示不同序列的外源肽鏈。用一定功能的靶分子篩選，可以簡(jiǎn)便快速地獲得與靶分子具有強(qiáng)親和力和特異性的小肽或新型蛋白，這些肽段可以作為侯選藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁(yè)，共34頁(yè) 3 在疾病的治療和致病機(jī)理方面的研究 有研究以HCV非結(jié)構(gòu)蛋

10、白NS4A作為固相靶分子，用T7噬菌體表面展示的人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行5輪篩選后，確定了與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A結(jié)合的是肝細(xì)胞蛋白絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活蛋白激酶5（MAPKAPK5），為進(jìn)一步研究HCV的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁(yè)，共34頁(yè) 酵母雙雜交技術(shù)由Fields等人于1989年提出。 該技術(shù)利用了酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)，GAL4包括兩個(gè)彼此分離但功能上必需的結(jié)構(gòu)域,一個(gè)是位于N端1-174位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結(jié)合(DNA binding domain,DNA-BD),另一個(gè)是位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activation

11、 domain, AD）?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁(yè)，共34頁(yè) DNA-BD能夠識(shí)別GAL4效應(yīng)基因的上游激活序列 (Up stream activating sequence, UAS),并與之結(jié)合，而AD則通過(guò)與轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的其他成分之間的作用,啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD單獨(dú)作用均不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng),只有當(dāng)二者在空間上充分接近并呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性時(shí),方可激活UAS下游啟動(dòng)。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁(yè)，共34頁(yè) 該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄激活的條件是蛋白質(zhì)作為一個(gè)整體起作用。 分別經(jīng)分子克隆技術(shù)在同一細(xì)胞中表達(dá)的BD和AD多肽不會(huì)彼此間發(fā)生作用，BD和AD分別可以同其他蛋白質(zhì)X或Y結(jié)

12、合形成融合蛋白,如果X，Y之間可以形成蛋白-蛋白復(fù)合物,使GAL4兩個(gè)結(jié)構(gòu)域重新構(gòu)成AD和BD成為一體,就可以啟動(dòng)特異基因序列的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁(yè)，共34頁(yè)BDADX YUAS報(bào)告基因（LacZ）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁(yè)，共34頁(yè) 一般地,將BD-X的融合蛋白稱(chēng)作誘餌(bait), X往往是已知蛋白,AD-Y稱(chēng)作獵物(prey),能顯示誘餌和獵物相互作用的基因稱(chēng)報(bào)告基因,通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的檢測(cè),反過(guò)來(lái)可判斷誘餌和獵物之間是否存在相互作用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁(yè)，共34頁(yè) 作為一種分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的簡(jiǎn)便而有效的研究體系,酵母雙雜交的最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要分離、純化蛋白質(zhì),整個(gè)過(guò)程

13、只是對(duì)核酸進(jìn)行操作?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁(yè)，共34頁(yè) 它主要應(yīng)用在以下幾個(gè)方面: 1.用于驗(yàn)證通過(guò)其他方法發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)之間是否有相互作用; 2.確定已知有生理作用的蛋白間的作用位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域; 3.篩選文庫(kù)以得到與已知蛋白質(zhì)存在特異相互作用的候選蛋白質(zhì)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁(yè)，共34頁(yè)1.并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工,如糖基化,二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。另外,有些蛋白的正確折疊和功能有賴(lài)于其它非酵母蛋白的輔助,這限制了某些細(xì)胞核外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁(yè)，共34頁(yè)2.假陽(yáng)性的發(fā)生

14、 假陽(yáng)性分為兩類(lèi)：一類(lèi)是生物學(xué)上的假陽(yáng)性 即蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用在酵母細(xì)胞中發(fā)生,但是在其生物體細(xì)胞內(nèi)并不發(fā)生相互作用，這主要是因?yàn)閮煞N蛋白不同時(shí)表達(dá)或者二者根本不在同一組織中，這種假陽(yáng)性,我們?nèi)绻麑?duì)所研究的蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性沒(méi)有深入了解的話,是很難排除的?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁(yè)，共34頁(yè)另一類(lèi)是技術(shù)上的假陽(yáng)性 即由于雙雜交技術(shù)上的局限而鑒定出的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。 包括篩庫(kù)過(guò)程中自發(fā)升高的BD-x融合蛋白自我激活導(dǎo)致的假陽(yáng)性，在BD-x融合蛋白不存在的情況下AD-Y融合蛋白單獨(dú)激活報(bào)告基因，導(dǎo)致的假陽(yáng)性,以及酵母中其他蛋白質(zhì)作用引起的假陽(yáng)性等?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十一頁(yè)，共34頁(yè) 因此，雖然雙雜交系統(tǒng)可篩選出大量蛋白質(zhì)相互作用,但其中部分蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)下可能不發(fā)生相互作用,