酵母RNA的提取

1、酵母RNA的提取1 1、實驗?zāi)康摹嶒災(zāi)康?1 1、掌握稀堿法提取、掌握稀堿法提取RNARNA的原理和方的原理和方法法 2 2、學(xué)習(xí)和了解其它提取、學(xué)習(xí)和了解其它提取RNARNA的方法的方法和原理和原理2、實驗重點(diǎn)和難點(diǎn) 離心機(jī)的使用 提取RNA的實驗原理3 3、實驗原理、實驗原理 一般的生物細(xì)胞中同時含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多， RNA（10.0%），DNA則少于2)，在實驗室常用酵母作為RNA提取的材料。若要制備具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；若對生物活性沒有要求，則可使用濃鹽法，稀堿法等。工業(yè)中用稀堿法或濃

2、鹽法，主要用于制備核苷酸的原料. 苯酚法：組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。 濃鹽法：在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細(xì)胞膜的透性，使RNA 釋放出來，再利用等電點(diǎn)（pH為）沉淀。此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。鹽濃度需要控制，太低，RNA不易從細(xì)胞中釋放出來，太高，細(xì)胞急劇收縮不利于抽提。一般80120g/L為宜。 稀堿法：稀堿法：利用細(xì)胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA釋放出來，這種方法提取時間短，但RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解； 本實驗采用的稀堿，既可

3、加速細(xì)胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。當(dāng)堿被中和后，可用乙醇(或者異丙醇）將RNA沉淀，或用等電點(diǎn)沉淀RNA(應(yīng)嚴(yán)格控制pH,緩慢調(diào)),此為 RNA的粗品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的解，從水解液中可以測出上述組分的存在。存在。核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖堿基堿基水水解解 （1 1）嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌）嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。呤銀化合物沉淀。 （2 2）磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的）磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生

4、黃色的磷鉬酸銨沉淀磷鉬酸銨沉淀(NH(NH4 4) )3 3POPO4 412MoO12MoO3 3,有還有還原劑存在時，形成藍(lán)色鉬藍(lán)。原劑存在時，形成藍(lán)色鉬藍(lán)。 (NH(NH4 4)MoO)MoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4) ) 2 2SOSO4 4 H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010) ) 4 4+12H+12H2 2O O H H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010) ) 4 4 MoMo2 2O O3 3 MoOMoO3 3（鉬藍(lán)）（鉬藍(lán)

5、） 還原產(chǎn)物鉬藍(lán)在波長還原產(chǎn)物鉬藍(lán)在波長660nm660nm測定吸光值，當(dāng)測定吸光值，當(dāng)無機(jī)磷含量在無機(jī)磷含量在125g 125g 范圍內(nèi)，光吸收和范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。含磷量成正比。 RNARNA的含磷量為的含磷量為9.5%9.5%，即，即1g RNA1g RNA磷磷相當(dāng)于相當(dāng)于10.5 g RNA10.5 g RNA。DNADNA的含磷量平均為的含磷量平均為9.9%9.9%。Vit C （3 3）地衣酚）地衣酚( (苔黑酚）顯色法：苔黑酚）顯色法：RNARNA與酸共與酸共熱時降解，形成戊糖，繼而形成糠醛（熱時降解，形成戊糖，繼而形成糠醛（-呋喃甲醛），糠醛與地衣酚（呋喃甲醛），糠醛

6、與地衣酚（3 3，5-5-二羥基二羥基甲苯）反應(yīng)，形成鮮綠色復(fù)合物，可用比甲苯）反應(yīng)，形成鮮綠色復(fù)合物，可用比色法測定。當(dāng)色法測定。當(dāng) 核糖核酸濃度在核糖核酸濃度在 1010100g/ml 100g/ml 范圍內(nèi)，其濃度與吸光度成線范圍內(nèi)，其濃度與吸光度成線性關(guān)系需要性關(guān)系需要FeClFeCl3 3或或CuCu2+2+作催化劑。作催化劑。4、實驗操作( (一一)RNA)RNA的提取的提?。? 1）稱）稱5g5g干酵母粉于干酵母粉于150 ml150 ml三角燒瓶中，加的三角燒瓶中，加的 NaOHNaOH，沸水，沸水浴中攪拌提取浴中攪拌提取20 min20 min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性，。

7、冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性，pHpH約約5-5-6 6，目的是去除蛋白質(zhì)。，目的是去除蛋白質(zhì)。（2 2）離心）離心(4000 r(4000 rminmin，13 min)13 min)，去除沉淀。上清液冰浴。，去除沉淀。上清液冰浴。（3 3）向上清液中加入）向上清液中加入20 ml20 ml（約上清液的兩倍體積）（約上清液的兩倍體積）9595乙醇，乙醇，稍攪拌后靜置（冰浴約稍攪拌后靜置（冰浴約10min10min）。待完全沉淀后離心）。待完全沉淀后離心(4000 r(4000 rminmin，15 min) 15 min) ，去上清液。，去上清液。（4 4）沉淀用）沉淀用9595乙醇洗兩次（如

8、沉淀浮起需再次離心），每乙醇洗兩次（如沉淀浮起需再次離心），每次約次約10mL;10mL;用乙醚洗兩次，每次用乙醚洗兩次，每次10mL10mL。目的是去除脂溶性物質(zhì)。目的是去除脂溶性物質(zhì)和水，乙醚的沸點(diǎn)比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的和水，乙醚的沸點(diǎn)比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥。干燥。( (二二)RNA)RNA的鑒定的鑒定 取沉淀約1g，加10 ml 10H2SO4沸水浴中加熱30 min。 （5 5）嘌呤堿）嘌呤堿 取水解液取水解液2mL2mL加入加入2mL2mL濃氨水，濃氨水，然后加入約然后加入約1mL 5%1mL 5%硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿

9、的銀化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤堿時，沉堿的銀化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤堿時，沉淀上浮，搖勻，沉淀下沉）淀上浮，搖勻，沉淀下沉） （6 6）核糖）核糖 取取1 1支試管加入水解液、支試管加入水解液、1mL1mL苔黑苔黑酚三氯化鐵濃鹽酸溶液。放沸水浴中酚三氯化鐵濃鹽酸溶液。放沸水浴中2 2分鐘。注分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。時間意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。時間久了會有黑色沉淀，是濃度高，產(chǎn)物結(jié)晶出來久了會有黑色沉淀，是濃度高，產(chǎn)物結(jié)晶出來了。了。5 5、注意事項、注意事項 避開磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍避開磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍20207070，防止

10、，防止RNA RNA 降解。在降解。在9090100100條件下加條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于酶，有利于RNA RNA 的提取。的提取。 在調(diào)在調(diào)pH pH 值時，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)值時，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)行。行。 在洗滌時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則在洗滌時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導(dǎo)致將導(dǎo)致RNA RNA 部分溶解而造成損失，降低部分溶解而造成損失，降低RNA RNA 提取提取率。率。 提取提取 RNA RNA 時必須用沸水浴，并經(jīng)常攪拌，時必須用沸水浴，并經(jīng)常攪拌，NaOH NaOH 必須實現(xiàn)預(yù)熱。必須實現(xiàn)預(yù)熱。 用乙酸調(diào)用乙酸調(diào) pH5pH56 6 必須有，目的可以除去一些必須有，目的可以除去一些雜質(zhì)。雜質(zhì)。 最后過濾前必須將乙醇瀝干，不能帶水，否則最后過濾前必