菌種測(cè)定方法

1、附錄A（規(guī)范性附錄）枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、植物乳桿菌的計(jì)數(shù)和雜菌率的測(cè)定A.1 原理每個(gè)活菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下，經(jīng)過(guò)合適的培養(yǎng)時(shí)間可繁殖成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，通過(guò)對(duì)菌落數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，便可計(jì)算出相應(yīng)樣品的單位活菌數(shù)。A.2 培養(yǎng)基除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和符合GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水或相當(dāng)純度的水。按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法配制培養(yǎng)基或購(gòu)買商品化的產(chǎn)品。A.2.1 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基A.2.1.1 成分營(yíng)養(yǎng)瓊脂 33g；蒸餾水 1000mL。A.2.1.2 制法將33g營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶解于蒸餾水中，定容至1000mL；121滅菌20min。A.2.2 釀酒酵母菌培養(yǎng)

2、基A.2.2.1 成分孟加拉紅培養(yǎng)基 36.6g；蒸餾水 1000mL。A.2.2.2 制法將36.6g孟加拉紅培養(yǎng)基溶解于蒸餾水中，定容至1000mL；121滅菌20min。A.2.3 植物乳桿菌培養(yǎng)基A.2.3.1 成分蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氫二鉀 2g；檸檬酸三銨 2g；乙酸鈉 5g；葡萄糖 20g；吐溫-80 1mL；七水硫酸鎂 0.58g；四水硫酸錳 0.25g；瓊脂粉 20g；滅菌碳酸鈣 3g；蒸餾水 1000mL。 A.2.3.2 制法將上述試劑依次溶解于蒸餾水中，七水硫酸鎂和四水硫酸錳單獨(dú)用蒸餾水溶解后混入前述溶液中，最后加入瓊脂粉，定容至100

3、0mL；121滅菌20min。A.2.4 麥康凱培養(yǎng)基 A.2.4.1 成分蛋白胨 17g；脙胨 3g；豬膽鹽（或牛、羊膽鹽） 5g；氯化鈉 5g；瓊脂 17g；蒸餾水 1000mL；0.01%結(jié)晶紫水溶液 10mL；0.5%中性紅水溶液 5mL。A.2.4.2 制法A.將蛋白胨、脙胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400mL蒸餾水中，校正pH7.2。將瓊脂加入600mL蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，121高壓滅菌15min備用。 B.臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至5055時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后 傾注平板。（注：結(jié)晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌）A.3 儀器與設(shè)

4、備A.3.1 超凈工作臺(tái)。A.3.2 天平：感量：0.01g。A.3.3 震蕩器。A.3.4 高壓滅菌器：121。A.3.5 生化培養(yǎng)箱：±1。A.3.6 玻璃培養(yǎng)皿。A.3.7 移液器：精度為1L。A.3.8 顯微鏡：1000倍。A.3.9 玻璃或塑料涂布棒。A.4 樣品制備按GB/T 14699.1的規(guī)定，采取有代表性的樣品200g，按GB/T20195制備試樣，裝入樣品瓶中做好標(biāo)記后備用。A.5 測(cè)定步驟A.5.1 樣品稀釋準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品10g，放入裝有90mL無(wú)菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成10-1稀釋液；再用

5、1mL無(wú)菌吸管，吸取10-1稀釋液1mL移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，充分混勻即成10-2稀釋液；再換一支無(wú)菌吸管吸取10-2菌液1mL移入裝有9mL無(wú)菌水試管中，即成10-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋度菌液，供平板接種用。 A.5.2 涂布枯草芽孢桿菌用涂布法：每個(gè)樣品根據(jù)菌量不同取兩個(gè)相鄰合適稀釋梯度，用1mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至直徑為9cm的培養(yǎng)基平皿的瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃涂布棒將菌懸液均勻涂于瓊脂表面。每個(gè)稀釋梯度做三個(gè)平行，同時(shí)用無(wú)菌水作為空白對(duì)照。釀酒酵母菌用混勻法：每個(gè)樣品根據(jù)菌量

6、不同取兩個(gè)相鄰合適稀釋梯度，用1mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液1mL，加至直徑為9cm平皿中，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至45左右(實(shí)驗(yàn)中用手觸摸溫?zé)峒纯?，在每個(gè)培養(yǎng)皿中各倒入約15mL培養(yǎng)基，然后迅速旋動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌懸液與培養(yǎng)基充分混勻，置水平位置靜止后使之凝固。每個(gè)梯度做三個(gè)平行，同時(shí)用無(wú)菌水作為空白對(duì)照。植物乳桿菌用混勻法：每個(gè)樣品根據(jù)菌量不同取兩個(gè)相鄰合適稀釋梯度，用1mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液1mL，加至直徑為9cm平皿中，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至45左右(實(shí)驗(yàn)中用手觸摸溫?zé)峒纯?，在每個(gè)培養(yǎng)皿中各倒入約15mL培養(yǎng)基，然后迅速旋動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌懸液與培養(yǎng)基充分混勻，置水平位置靜止后使之凝固

7、。每個(gè)梯度做三個(gè)平行，同時(shí)用無(wú)菌水作為空白對(duì)照。A.5.3 培養(yǎng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基平皿置培養(yǎng)箱內(nèi)37倒置培養(yǎng)17-22h；釀酒酵母菌培養(yǎng)基平皿冷凝后置培養(yǎng)箱內(nèi)28倒置培養(yǎng)48h；植物乳桿菌培養(yǎng)基平皿冷凝后37培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h，分別觀察菌落形態(tài)，鑒別后計(jì)數(shù)。A.5.4 菌落特征A.5.4.1 枯草芽孢桿菌：培養(yǎng)基平皿置培養(yǎng)箱內(nèi)37倒置培養(yǎng)24h后，菌落不規(guī)則，粗糙，不透明，不閃光，蔓延，污白色。A.5.4.2 釀酒酵母菌：培養(yǎng)基平皿置培養(yǎng)箱內(nèi)28倒置培養(yǎng)48h后，菌落散布在培養(yǎng)基內(nèi)部，特征為中間粉紅色邊緣半透明的凸起實(shí)心菌落，邊緣較整齊。A.5.4.3 糞腸球菌：平板培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)，表

8、面菌落約3毫米寬，凸起，圓，光滑，細(xì)密，白色，偶爾淺黃或深黃色；培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈乳白色不規(guī)則散布，邊緣不整齊，稍成半球狀凸起的實(shí)心菌落。A.5.5 菌落計(jì)數(shù)A.5.5.1 結(jié)果計(jì)算枯草芽孢桿菌計(jì)數(shù)：每克樣品的活菌數(shù)（CFU/g）=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。釀酒酵母菌計(jì)數(shù)：每克樣品的活菌數(shù)（CFU/g）=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。糞腸球菌計(jì)數(shù)：每克樣品的活菌數(shù)（CFU/g）=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。A.5.5.2 菌落計(jì)數(shù)辦法只計(jì)算枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和糞腸球菌（特征）的菌落。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其菌落數(shù)在30300之間時(shí)，則以該菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。若有兩個(gè)

9、稀釋度，其菌落數(shù)均在30300之間，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，計(jì)算兩者的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；若大于2則計(jì)數(shù)其中較小的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。結(jié)果表示：每克樣品中的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和糞腸球菌菌數(shù)，單位為CFU/g,保留三位有效數(shù)字。A.6 雜菌率A.6.1 雜菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)取10-1、10-2、10-3三個(gè)稀釋度的樣品液1mL于麥康凱培養(yǎng)基上，充分涂布，待液體完全吸收后倒置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，計(jì)數(shù)，參照計(jì)算雜菌數(shù)。A.6.2 結(jié)果計(jì)算雜菌率（%）=（雜菌數(shù)/釀酒酵母菌活菌數(shù)）×100附錄B（規(guī)范性附錄）嗜酸乳桿菌的計(jì)數(shù)和雜菌率的測(cè)定B.1 原理每個(gè)活

10、菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下，經(jīng)過(guò)合適的培養(yǎng)時(shí)間可繁殖成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，通過(guò)對(duì)菌落數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，便可計(jì)算出相應(yīng)樣品的單位活菌數(shù)。B.2 培養(yǎng)基和稀釋液除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和符合GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水或相當(dāng)純度的水。按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法配制培養(yǎng)基或購(gòu)買商品化的產(chǎn)品。B.2.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基B.2.1.1 成分蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氫二鉀 2g；檸檬酸三銨 2g；乙酸鈉 5g；葡萄糖 20g；吐溫-80 1mL；七水硫酸鎂 0.58g；四水硫酸錳 0.25g；瓊脂粉 20g；碳酸鈣 3g；蒸餾水 1000mL。B.2.1.

11、2 制法將上述試劑依次溶解于蒸餾水中，七水硫酸鎂和四水硫酸錳單獨(dú)用蒸餾水溶解后混入前述溶液中，最后加入瓊脂粉，定容至1000mL；121滅菌20min。B.3 儀器與設(shè)備B.3.1 超凈工作臺(tái)。B.3.2 天平：感量：0.01g。B.3.3 震蕩器。B.3.4 高壓滅菌器：121。B.3.5 生化培養(yǎng)箱：±1。B.3.6 玻璃培養(yǎng)皿。B.3.7 移液器：精度為1L。B.3.8 顯微鏡：1000倍。B.3.9 玻璃或塑料涂布棒。B.4 樣品制備按GB/T 14699.1的規(guī)定，采取有代表性的樣品200g，按GB/T20195制備試樣，裝入樣品瓶中做好標(biāo)記后備用。B.5 測(cè)定步驟B.5.

12、1 樣品稀釋準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品10g，放入裝有90mL無(wú)菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成10-1稀釋液；再用1mL無(wú)菌吸管，吸取10-1稀釋液1mL移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中，充分混勻即成10-2稀釋液；再換一支無(wú)菌吸管吸取10-2菌液1mL移入裝有9mL無(wú)菌水試管中，即成10-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋度菌液，供平板接種用。B.5.2 涂布每個(gè)樣品根據(jù)菌量不同取兩個(gè)相鄰合適稀釋梯度，用1mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液1mL，加至直徑為9cm平皿中，當(dāng)培養(yǎng)基冷

13、卻至45左右(實(shí)驗(yàn)中用手觸摸溫?zé)峒纯?，在每個(gè)培養(yǎng)皿中各倒入約15mL培養(yǎng)基，然后迅速旋動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌懸液與培養(yǎng)基充分混勻，置水平位置靜止后使之凝固。每個(gè)梯度做三個(gè)平行，同時(shí)用無(wú)菌水作為空白對(duì)照。B.5.3 培養(yǎng)嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基平皿冷凝后37培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h，分別觀察菌落形態(tài)后計(jì)數(shù)。B.5.4 菌落特征平板培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)，表面菌落約3毫米寬，凸起，圓，光滑，細(xì)密，白色，偶爾淺黃或深黃色；培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈乳白色不規(guī)則散布，邊緣不整齊，稍成半球狀凸起的實(shí)心菌落。B.5.5 菌落計(jì)數(shù)B.5.5.1 結(jié)果計(jì)算嗜酸乳桿菌計(jì)數(shù)：每克樣品的活菌數(shù)（CFU/g）=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。B.

14、5.5.2 菌落計(jì)數(shù)辦法只計(jì)算嗜酸乳桿菌（特征）的菌落。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其菌落數(shù)在30300之間時(shí)，則以該菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。若有兩個(gè)稀釋度，其菌落數(shù)均在30300之間，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，計(jì)算兩者的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；若大于2則計(jì)數(shù)其中較小的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。結(jié)果表示：每克樣品中的嗜酸乳桿菌菌數(shù)，單位為CFU/g,保留三位有效數(shù)字。B.6 雜菌率B.6.1 雜菌計(jì)數(shù)目標(biāo)菌以外的菌均視為雜菌，對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的同時(shí)對(duì)雜菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。B.6.2 結(jié)果計(jì)算雜菌率(%)（雜菌數(shù)/嗜酸乳桿菌活菌數(shù)）×100芽孢桿菌檢測(cè)流程（丁酸梭菌）1、此檢測(cè)方法用來(lái)計(jì)算每克

15、芽孢桿菌粉劑的活芽孢數(shù)量。2、儀器、設(shè)備分析天平（0.0001g）、超凈工作臺(tái)、渦旋振蕩器、恒溫振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、三角瓶、玻璃珠、試管、量筒，1000L移液槍、100L移液槍，涂布棒，培養(yǎng)皿。3、無(wú)菌器材、溶液無(wú)菌蒸餾水、滅菌后的GAM瓊脂培養(yǎng)基、已滅過(guò)菌的移液管、涂布棒、試管、培養(yǎng)皿等。4、測(cè)定步驟 樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取1.0000g固體樣品于已滅菌并烘干的玻璃珠三角瓶中，加入100ml蒸餾水，于搖床上20以下?lián)u勻30min。 樣品的稀釋：1)取6只無(wú)菌試管分別加入9ml無(wú)菌水，試管上標(biāo)記樣品號(hào)和稀釋倍數(shù)。操作在超凈臺(tái)中進(jìn)行。2）吸取1ml已處理好的試樣溶液于第一支試管中，于渦旋振蕩器上混勻1min左右，再?gòu)牡谝恢г嚬苤形?ml試樣溶液于第二支試管中，依次進(jìn)行到第6只試管，混勻備用。稀釋樣品的平板培養(yǎng)準(zhǔn)確移取1ml第6只試管試樣到已滅菌的空平板中（共6個(gè)平板）各個(gè)平板均標(biāo)記菌批號(hào)、日期、稀釋度。向已加入試樣液的空平板中傾入30ml左右的GAM固體培養(yǎng)基，輕輕旋轉(zhuǎn)使之混勻。混勻完成后，倒置放于厭氧培養(yǎng)罐內(nèi)，并放入三菱牌厭氧產(chǎn)氣袋一袋，擰緊罐