醋酸纖維薄膜

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳n 學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作n 了解電泳技術(shù)的一般原理了解電泳技術(shù)的一般原理二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 任何一種物質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)，由于其本身在溶液中任何一種物質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)，由于其本身在溶液中的解離或由于其表面對其他帶電質(zhì)點(diǎn)的吸附，會(huì)的解離或由于其表面對其他帶電質(zhì)點(diǎn)的吸附，會(huì)在電場中向一定的電極移動(dòng)。在電場中向一定的電極移動(dòng)。 如氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、核酸等及其衍生物如氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、核酸等及其衍生物質(zhì)都具有許多可解離的酸性或堿性基團(tuán)，它們在質(zhì)都具有許多可解離的酸性或堿性基團(tuán)，它們在溶液中會(huì)解離而帶電。溶液中會(huì)解離

2、而帶電。 一般在堿性溶液中（即溶液的一般在堿性溶液中（即溶液的pHpH值大值大于等電點(diǎn)于等電點(diǎn)pIpI），分子帶負(fù)電荷，在電場中），分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。而在酸性溶液中，分子帶正向正極移動(dòng)。而在酸性溶液中，分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。移動(dòng)的速度電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。移動(dòng)的速度取決于帶電的多少和分子的大小。取決于帶電的多少和分子的大小。泳動(dòng)度泳動(dòng)度 不同質(zhì)點(diǎn)在同一電場中的泳動(dòng)速度不同，常用不同質(zhì)點(diǎn)在同一電場中的泳動(dòng)速度不同，常用泳動(dòng)度或遷移率來表示。泳動(dòng)度指泳動(dòng)度或遷移率來表示。泳動(dòng)度指帶電質(zhì)點(diǎn)在單位帶電質(zhì)點(diǎn)在單位電場強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。電場強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。 v d/t d

3、l u = = = （ cm2.V-1.S-1) E V/l Vt 影響泳動(dòng)度因素影響泳動(dòng)度因素l帶電質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì)帶電質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì) 質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小及質(zhì)點(diǎn)質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小及質(zhì)點(diǎn)的形狀。一般說來質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，質(zhì)點(diǎn)的形狀。一般說來質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，質(zhì)點(diǎn)直徑越小，越接近球形，則在電場中的泳動(dòng)速直徑越小，越接近球形，則在電場中的泳動(dòng)速度越快；反之則越慢。度越快；反之則越慢。v溶液的粘度溶液的粘度v電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度v溶液的溶液的pHpH值值v溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度v固體支持物的電滲現(xiàn)象固體支持物的電滲現(xiàn)象v本實(shí)驗(yàn)用醋酸纖維薄膜，是纖維素的羥基乙本實(shí)驗(yàn)用醋酸纖維薄膜，

4、是纖維素的羥基乙酸化所形成的纖維纖維素醋酸酯。具有泡沫酸化所形成的纖維纖維素醋酸酯。具有泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度均為狀的結(jié)構(gòu)，厚度均為120um120um，有很強(qiáng)的滲透性，有很強(qiáng)的滲透性，對分子移動(dòng)阻力很小。對分子移動(dòng)阻力很小。三、器材與試劑三、器材與試劑v醋酸纖維薄膜醋酸纖維薄膜 2*8cm v常壓電泳儀常壓電泳儀v點(diǎn)樣器點(diǎn)樣器：用蓋玻片代替。用蓋玻片代替。v培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿v玻璃板玻璃板v粗濾紙粗濾紙v電泳槽電泳槽v巴比妥緩沖液巴比妥緩沖液：pH8.6pH8.6，離子強(qiáng)度，離子強(qiáng)度0.070.07 巴比妥巴比妥2.76g,2.76g,巴比妥鈉巴比妥鈉15.45g15.45g，加水至，加水至1000m

5、l1000ml。 每個(gè)大組每個(gè)大組500ml500ml v染色液染色液 每個(gè)大組每個(gè)大組200ml200ml 氨基黑氨基黑10B0.25g,10B0.25g,甲醇甲醇50ml,50ml,冰醋酸冰醋酸10ml,10ml,水水40ml40ml（可重復(fù)使用）（可重復(fù)使用）v漂洗液漂洗液 每個(gè)組每個(gè)組100ml100ml 含甲醇或乙醇含甲醇或乙醇45ml45ml、冰醋酸、冰醋酸5ml5ml、水、水50ml50mlv透明液透明液 每個(gè)組每個(gè)組200ml200ml 含無水乙醇：冰醋酸含無水乙醇：冰醋酸7 7：3 3，本實(shí)驗(yàn)不做定，本實(shí)驗(yàn)不做定 量不用配。量不用配。四、操作方法四、操作方法v1 1、薄膜準(zhǔn)備

6、：、薄膜準(zhǔn)備：用鑷子取醋酸薄膜一張，放用鑷子取醋酸薄膜一張，放在綏沖液中浸泡在綏沖液中浸泡2020分鐘。（識(shí)別光澤面與分鐘。（識(shí)別光澤面與無光澤面，并在有光澤面一角做記號）無光澤面，并在有光澤面一角做記號）v2 2、制造濾紙橋：、制造濾紙橋：剪取雙層合適尺寸濾紙橋剪取雙層合適尺寸濾紙橋附在電泳槽支架上，使其一端與支架的前附在電泳槽支架上，使其一端與支架的前沿對齊，另一端浸入電極槽的緩沖液中，沿對齊，另一端浸入電極槽的緩沖液中，用緩沖液潤濕并驅(qū)趕氣泡，使濾紙緊貼在用緩沖液潤濕并驅(qū)趕氣泡，使濾紙緊貼在支架上。如圖支架上。如圖v3 3、點(diǎn)樣、點(diǎn)樣：取出膜條，用雙層濾紙吸干多：取出膜條，用雙層濾紙吸干

7、多余的液體，平鋪在玻璃板上，無光澤面朝余的液體，平鋪在玻璃板上，無光澤面朝上，用點(diǎn)樣器蘸取血清在膜條的一端上，用點(diǎn)樣器蘸取血清在膜條的一端1.5cm1.5cm處，均勻劃一條線。處，均勻劃一條線。v4 4、電泳：、電泳：在兩電極槽內(nèi)加入等高的緩沖在兩電極槽內(nèi)加入等高的緩沖液，將膜條平懸于濾紙橋上（點(diǎn)樣端靠近液，將膜條平懸于濾紙橋上（點(diǎn)樣端靠近負(fù)極），蓋嚴(yán)電泳室通電，電壓負(fù)極），蓋嚴(yán)電泳室通電，電壓120V120V，電，電流流0.4-0.7mA/cm 0.4-0.7mA/cm 膜寬，電泳膜寬，電泳6060分鐘。分鐘。v5 5、染色：、染色：電泳完畢后，取膜條放在染色電泳完畢后，取膜條放在染色液中浸

8、泡液中浸泡1010分鐘左右。分鐘左右。v6 6、漂洗：、漂洗：漂洗數(shù)次至無蛋白區(qū)底色脫凈漂洗數(shù)次至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得色帶清晰的圖譜。保存。為止，可得色帶清晰的圖譜。保存。v7 7、透明、透明：將干燥的電泳圖譜放入透明液：將干燥的電泳圖譜放入透明液中浸泡中浸泡2-32-3分鐘后取出貼于潔凈的玻璃板分鐘后取出貼于潔凈的玻璃板上，干后放在兩層濾紙中保存。上，干后放在兩層濾紙中保存。v8 8、計(jì)算、計(jì)算：計(jì)算出每條蛋白的泳動(dòng)度。：計(jì)算出每條蛋白的泳動(dòng)度。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)v手盡量不要接觸膜條。手盡量不要接觸膜條。v用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣時(shí)不要點(diǎn)的太多，但也不用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣時(shí)不要點(diǎn)的太多，但也不 能太少。線條均勻，用力水平。能太少。線條均勻，用力水平。v電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、結(jié)論與分析六、結(jié)論與分析思考題思考題v1 1、用醋酸纖維薄膜做電泳支持物有什么優(yōu)點(diǎn)？、用醋酸纖維薄膜做電泳支持物有什么優(yōu)點(diǎn)？v2 2、電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確的操作？、電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確的操作？v3