多重不對稱擴增介紹ppt課件

1、多重不對稱PCR 黃桃生生物芯片組）多重不對稱PCR多重PCR(Multiplex PCR)不對稱PCRAsymmetric PCR）獲得大量不同片段的單鏈DNASSDNA）多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同. 1、擴增單一基因中多個片段華法林檢測） 2、擴增不同基因中多個片段HPV分型）多重PCR技術(shù)優(yōu)點高效性：在同一高效性：在同一PCRPCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因

2、進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。系統(tǒng)性：多重系統(tǒng)性：多重PCRPCR很適宜于成組病原體的檢測，很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌等同時檢測。厭氧菌等同時檢測。經(jīng)濟簡便性：多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時經(jīng)濟簡便性：多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。費開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。多重PCR技術(shù)難點反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同.難點主要體

3、現(xiàn)在前期引物設(shè)計過程中反應(yīng)體系的平衡 反應(yīng)體系不平衡反應(yīng)體系的不平衡導(dǎo)致在前期的幾輪反應(yīng)中某些優(yōu)勢引物及其模板迅速擴增，獲得大量的擴增產(chǎn)物，而這些擴增產(chǎn)物同時又是DNA聚合酶的良好抑制劑SantaLucia, 2019）。所以，隨著擴增產(chǎn)物的大量出現(xiàn)，聚合酶的聚合能力被越來越強烈的抑制住了，因此，前期處于劣勢的引物及其模板，這時就更加舉步維艱，最終導(dǎo)致擴增產(chǎn)物量非常之小，以至于無法檢測。正所謂強者更強、弱者更弱。導(dǎo)致不平衡的原因： 1、引物特異性； 2、最佳退火溫度不一致； 3、引物二聚體；4、模板量不同；5、引物擴增效率引物特異性如果引物與體系中其他非目的基因片段結(jié)合能力更強，那么目的基因結(jié)

4、合引物的能力就會受到競爭，從而導(dǎo)致擴增效率下降。嚴(yán)格blast驗證最佳退火溫度不一致將多對引物放置入一個體系中擴增，由于進(jìn)行PCR反應(yīng)的退火溫度相同，所以要求每一對引物的最佳退火溫度接近。前期引物設(shè)計時減少最佳退火溫度的差異，最佳退火溫度的差異不超過35為宜。引物二聚體包括引物間的二聚體以及引物自身所形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，還有一類是第三方DNA介導(dǎo)的二聚體，這些二聚體和非特異引物一樣都會干擾引物與目標(biāo)結(jié)合位點的競爭，影響擴增效率。針對不同對引物之間二聚體，目前可以采用Visual OMP6軟件7天試用版進(jìn)行驗證。引物擴增效率這個因素很重要，但也很籠統(tǒng)，它也許包含了上面提到的幾個因素，但更多的因素還不

5、清楚。引物的擴增效率到目前為止，還沒有一個可以明確的定量計算方法。目前也有文章提出使用統(tǒng)計學(xué)方法，利用qPCR的數(shù)據(jù)建立一個模型，來預(yù)測引物與目標(biāo)序列的擴增效率。 srvgen.upct.es/efficiency.html不對稱PCR用不等量的一對引物進(jìn)行模板的擴增，PCR擴增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這對引物分別稱為非限制性引物和限制性引物。在擴增過程前10-20個循環(huán)，其擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗殆盡，不再引導(dǎo)擴增，而非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR會繼續(xù)進(jìn)行，從而就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。不對稱PCR優(yōu)缺點優(yōu)點優(yōu)點可以獲得大量SSDNA，快速進(jìn)行下游

6、操作。比如直接進(jìn)行測序，或者下游雜交檢測無需經(jīng)過變性這一步驟。缺陷缺陷前期10-20循環(huán)相當(dāng)于對稱擴增，單鏈DNA在此之后才會出現(xiàn)，從而導(dǎo)致PCR擴增循環(huán)數(shù)增加，靈敏度較對稱性擴增低。不對稱擴增對于低拷貝樣本的擴增較難，對于病原體檢測需要更詳盡的PCR設(shè)計和優(yōu)化。不對稱PCR設(shè)計設(shè)計不對稱PCR引物時，限制性引物的Tm值較非限制性引物Tm值高46，擴增效果更佳。不對稱PCR設(shè)計在于控制限制性引物低濃度引物的絕對量，限制性引物過多或過少，均不利于SSDNA的制備。限制性引物量可以考慮設(shè)置在0.8-1.5P之間。設(shè)置限制性引物量后，再通過實驗驗證限制性引物濃度和非限制性引物濃度的比例，目前常用比例

7、1:3、1:5、1:10、1:15、1:20進(jìn)行優(yōu)化，一般情況下，1:10、1:20比例情況下效果可能更佳。增加單鏈的方法1、納米金微粒介導(dǎo)不對稱擴增 納米金顆?？梢栽鰪奝CR擴增效率和特異性，有可能是由于金納米顆粒與單鏈引物之間特異性結(jié)合，類似單鏈結(jié)合蛋白SSB功能，一直PCR非特異性擴增，更重要的可能是，金納米顆粒的熱效率和熱傳導(dǎo)，在液相中，納米顆?？梢钥焖賯鬟f熱量并且與周圍環(huán)境在10200ps內(nèi)形成熱平衡，增強擴增效率。通過金納米顆粒介導(dǎo)進(jìn)行的不對稱PCR，可以獲得與普通不對稱PCR更好的效果。2、LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential PCR)多重不對稱PCR重要影響因素引物二聚體引物特異性 主要是導(dǎo)致不對稱PCR限制性引物和非限制性引物比例的改變，或者限制性引物絕對量的改變，從而導(dǎo)致擴增差異化或者擴增失敗。多重不對稱PCR設(shè)計軟件PrimerPlex付費）一款設(shè)計特征寡核苷酸片斷、用于同時分析100種核酸序列的工具。Mpprimer開放、在線）最多一次可以設(shè)計6對引物、基于PP3內(nèi)核。PP5/Oligo 6+ OMP 6目前芯片組