二輪——PCR技術(shù)

1、PCRPCR技術(shù)技術(shù)多聚酶鏈式反應(yīng)多聚酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Polymerase Chain ReactionReaction），是一種體外迅），是一種體外迅速擴增速擴增DNADNA片段的技術(shù)。片段的技術(shù)。19881988年美國穆里斯年美國穆里斯（K.MullisK.Mullis）等人）等人發(fā)明，發(fā)明，榮榮獲獲19931993年諾貝爾化學(xué)獎。年諾貝爾化學(xué)獎。PCRPCR【基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA復(fù)制：復(fù)制：半保留復(fù)制；半保留復(fù)制；v需要提供合成模板；需要提供合成模板；v不能起始新的不能起始新的DNADNA鏈，必須要有引物提供鏈，必須

2、要有引物提供3 3-OH-OH；v合成的方向都是合成的方向都是5 533。 DNADNA聚合酶聚合酶【基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】一、一、PCRPCR原理：原理：DNADNA復(fù)制：復(fù)制：半保留復(fù)制；半保留復(fù)制；DNADNA的熱變性原理。的熱變性原理。TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶v耐高溫。耐高溫?！净A(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】二、二、PCRPCR條件：條件：胞內(nèi)胞內(nèi)DNADNA復(fù)制與復(fù)制與PCRPCR技術(shù)的比較：技術(shù)的比較：胞內(nèi)胞內(nèi)DNADNA復(fù)制復(fù)制PCRPCR解旋解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制解旋酶，邊解旋邊復(fù)制酶酶解旋酶解旋酶/DNA/DNA聚合酶聚合酶/DNA/DNA連接酶連接酶/ /引物酶引物酶模板模

3、板DNADNA母鏈母鏈引物引物RNARNA能量能量+ +原料原料dNTPdNTP溫度溫度最適溫度最適溫度緩沖液緩沖液MgMg2+2+, ,緩沖對緩沖對子鏈合成子鏈合成半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制變性變性Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA母鏈母鏈dNTPdNTP3 3個溫度個溫度MgMg2+2+, ,緩沖對緩沖對連續(xù)復(fù)制連續(xù)復(fù)制DNADNA【基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】二、二、PCRPCR條件：條件：引物：引物：v利用軟件設(shè)計。利用軟件設(shè)計。v引物設(shè)計的原則：引物設(shè)計的原則：決定決定PCRPCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度。擴增產(chǎn)物的特異性和長度。1.1.引物長度：引物長度： 通常為通常為2020

4、30bp30bp，盡量，盡量降低引物與非擴降低引物與非擴增區(qū)的同源性；增區(qū)的同源性；2.2.引物內(nèi)部不能存在部分互補序列；引物內(nèi)部不能存在部分互補序列；3.3.兩個引物之間不能存在部分互補序列；兩個引物之間不能存在部分互補序列；4.4.引物的引物的5 5端可以修飾，但端可以修飾，但3 3端不可以修飾：端不可以修飾：如探針標記。如探針標記。例題例題 1 1【20112011年安徽年安徽】家蠶細胞具有高效表達外源基因能力。將人干擾素家蠶細胞具有高效表達外源基因能力。將人干擾素基因?qū)爰倚Q細胞并大規(guī)模培養(yǎng)，可以提取干擾素用于制藥?；?qū)爰倚Q細胞并大規(guī)模培養(yǎng)，可以提取干擾素用于制藥。 采用采用PCR

5、PCR技術(shù)可技術(shù)可驗證干擾素基因是否已經(jīng)導(dǎo)入家蠶細胞驗證干擾素基因是否已經(jīng)導(dǎo)入家蠶細胞。該。該PCRPCR反應(yīng)體系的主要成分應(yīng)該包含：擴增緩沖液（含反應(yīng)體系的主要成分應(yīng)該包含：擴增緩沖液（含MgMg2+2+）、水、）、水、4 4種脫種脫氧核糖核苷酸、模板氧核糖核苷酸、模板DNADNA、 和和 。對干擾素基因特異的對干擾素基因特異的DNADNA引物對引物對TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶例題例題 2 2【20112011年江蘇年江蘇】請回答基因工程方面的有關(guān)問題：請回答基因工程方面的有關(guān)問題： （1 1）設(shè)計引物是）設(shè)計引物是PCRPCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物（技術(shù)關(guān)鍵步

6、驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理（如下圖），請分別說明理由。只標注了部分堿基序列）都不合理（如下圖），請分別說明理由。第一組：第一組： ； 第二組：第二組： 。引物引物和引物和引物局部發(fā)生堿基互補配對而失效局部發(fā)生堿基互補配對而失效引物引物 自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效（2 2）PCRPCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶，下面的表達式不能正聚合酶，下面的表達式不能正確反映確反映DNADNA聚合酶的功能，這是因為聚合酶的功能，這是因為 。 DNA DNA聚合酶只能將單個脫氧核聚合酶只能將單個脫

7、氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNADNA片段的引物鏈上片段的引物鏈上 【基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】二、二、PCRPCR條件：條件：溫度：溫度：v70707575：v90909595：v55556060：變性；變性；復(fù)性；復(fù)性； 延伸。延伸。 【注意注意】 具體溫度與具體溫度與DNADNA母鏈母鏈及引物中的及引物中的G G、C C含量有關(guān)。含量有關(guān)。例題例題 3 3【20082008年江蘇年江蘇】回答下列問題?；卮鹣铝袉栴}。（1 1）在采用）在采用常規(guī)常規(guī)PCRPCR方法擴增目的基因方法擴增目的基因的過程中，使用的的過程中，使用的DNADNA聚合聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的酶不同于一般生物體內(nèi)

8、的DNADNA聚合酶，其最主要的特點是聚合酶，其最主要的特點是 。（2 2）PCRPCR過程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種過程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定。表類來設(shè)定。表1 1為根據(jù)模板設(shè)計的兩對引物序列，圖為根據(jù)模板設(shè)計的兩對引物序列，圖2 2為引物對與為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？ 。耐高溫耐高溫 引物對引物對B B 【基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識】三、三、PCRPCR過程：過程：預(yù)變性；預(yù)變性；復(fù)性；復(fù)性；延伸；延伸；循環(huán)。循環(huán)。變性；變性；【20112011年江蘇年江蘇】利

9、用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNADNA復(fù)制類似（如下圖所示）。圖中引物中為單鏈復(fù)制類似（如下圖所示）。圖中引物中為單鏈DNADNA片段，它片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。（1 1）從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物）從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A A的的DNADNA片段所片段所占比例為占比例為 。（2 2）在第）在第 輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNADNA片段。片段。15/1615/16三三例題例題 4 4【拓展視野拓展視野】人教版選修人教版選修3

10、 3“利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因的前提，技術(shù)擴增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。這一序列合成引物?！?，怎樣理解？，怎樣理解？基因工程的第四步基因工程的第四步“目的基因檢測與鑒定目的基因檢測與鑒定”中的基中的基因探針如何獲??？因探針如何獲?。俊?0112011年北京年北京】根據(jù)根據(jù)T-DNAT-DNA的已知序列，利用的已知序列，利用PCRPCR技術(shù)可以擴增出技術(shù)可以擴增出被插入的基因片段。如下圖，從圖中被插入的基因片段。如下圖，從圖中A A、B B、C C、D D四種單鏈四種單鏈DNADNA片段片

11、段中選取中選取 作為引物進行擴增，作為引物進行擴增，得到的片段將用于獲取該基因得到的片段將用于獲取該基因的全序列信息的全序列信息。B B、C C例題例題 5 5【拓展視野拓展視野】反向反向PCRPCR：【拓展視野拓展視野】不對稱不對稱PCRPCR： 用不等量的一對引物進行用不等量的一對引物進行PCRPCR擴增，擴增，產(chǎn)生大量特異長度的單鏈產(chǎn)生大量特異長度的單鏈DNADNA。 制備基因探針。制備基因探針?！緦嶒灢僮鲗嶒灢僮鳌繉嶒瀮x器：實驗儀器：藥品藥品: 小麥DNA，隨機引物， Taq酶，10反應(yīng)緩沖液（50mMKCl，100mMTris.HCl，pH9.0），2.5mMdNTPs混合物（dAT

12、P、dGTP、dCTP、dTTP等量混合），PCR分子量標準marker，無菌超純水等成分用量用量無菌雙蒸水12L補至終體積10反應(yīng)緩沖液(TaKaRa) 2.5L1/10體積dNTP混合液(2.5mM)2.0L各200mol/LDNA(20ng/L)5.0L50100ng上游引物(25mol) 1.0L1mol/L下游引物(25mol) 1.0L1mol/LTaq酶(TaKaRa) (5U)0.5L15U總體積25L1.PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系【實驗操作實驗操作】微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌；必須進行高壓滅菌； 微量離心管在每吸取一種試劑都必須更換槍頭；微量離心管在每吸取一種試劑都必須更換槍頭； 所有的成分加入離心管后，蓋嚴蓋子，用手指輕輕所有的成分加入離心管后，蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，離心彈擊管的側(cè)壁，離心10s1