SDS實(shí)時熒光定量PCR操作指南

1、Real Time PCR System安裝培訓(xùn)安裝培訓(xùn)Sequence Detection Systems Product LineService Department, China2olymerasehaineaction4 傳統(tǒng)傳統(tǒng)PCR具有以下基本要素具有以下基本要素dsDNA（DNA模版）, Primers（引物）, dNTPs（核苷酸）, PCR buffer（緩沖液）, Taq polymerase（DNA聚合酶）等等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCT

2、AATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA5 在控溫模在控溫模塊塊（Temperature Block）上上實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)循循環(huán)環(huán)反反應(yīng)應(yīng) Denaturating of template（模板（模板變變性性） ） Annealing of oligos（引物（引物退火退火） ） Extension of primers to make new products （序列（序列延伸延伸） ）N個個Cycles6 所需的片斷會逐所需的片斷會逐漸漸增多增多5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTA3TGCAAACAGATTAG

3、ACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA3ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT ATTAGATGACTTAGATGTTTGGCA5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT 3TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT 3TGCAAACAGATTAGACA

4、TAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA3TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT7Xn = X0 ( 1 + Ex )n n = PCR循環(huán)數(shù) Ex = PCR擴(kuò)增效率 X0 = 起始目標(biāo)DNA分子數(shù) Xn = 第n個循環(huán)后的目標(biāo)DNA分子數(shù)理想情況下，Ex = 100%，Xn = X0 2n8 PCR 對數(shù)圖譜對數(shù)圖譜 指數(shù)指數(shù)/對對數(shù)數(shù)擴(kuò)擴(kuò)增期增期Xn = X0 2n（理想狀態(tài)）Ex不

5、變 線線性性擴(kuò)擴(kuò)增期增期Ex逐漸變小 平臺期平臺期Ex = 010實(shí)時監(jiān)控特定核酸目標(biāo)序列PCR擴(kuò)增的技術(shù)Technology to monitor, in real-time, the PCR amplification of specific nucleic acid targets 11在PCR混合液中含有12隨著擴(kuò)增的進(jìn)行, 會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加PCRPCRLots of PCRPCR product13Real Time PCR儀包括Thermal Block控溫模塊, Light Resource 激發(fā)光源, Light Splitter分光系統(tǒng), 和 CCD Camera

6、信號采集四大部分Thermal cycling blockLight ResourceCCD CameraEmission SplitterExcitation Splitter14Real-time PCR儀會紀(jì)錄每個循環(huán)的變化Cycle 3Filter ASample 1Bin N15最后，Real Time軟件會對采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析16是怎樣隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加的呢？TaqMan 化學(xué)原理化學(xué)原理 (又稱又稱 5-Nuclease )18 TaqMan 中會使用到兩段短片段序列，稱為19 TaqMan 中第三段短片段序列稱為，結(jié)合到序列中間20 探針標(biāo)記兩種報告染料報告染料Rep

7、orter dye淬滅染料淬滅染料Quencher dye21 完整的探針報告染料報告染料Reporter dye淬滅染料淬滅染料Quencher dye22 完整的探針光 (激發(fā))能量沒有熒光信號23 如果探針斷裂了光 (激發(fā))TaqMan 放映開始放映開始25262728293031323334?35具有核酸外切核酸外切酶酶活性活性，可以“吃掉”結(jié)合到模板上的DNA片段3637383940414243444546474849505152嗝!53SYBR Green I 化學(xué)原理化學(xué)原理55565758非特異結(jié)合非特異結(jié)合任意任意 雙鏈雙鏈DNA定量結(jié)果不準(zhǔn)確定量結(jié)果不準(zhǔn)確可能產(chǎn)生可能產(chǎn)生非

8、特異性非特異性PCR產(chǎn)物信號產(chǎn)物信號59 使用使用 Melt curve (Dissociation Curve) 檢查檢查PCR反反應(yīng)產(chǎn)應(yīng)產(chǎn)物的特異性物的特異性Temperature Fluorescence 原始圖譜60 使用使用 Melt curve (Dissociation Curve) 檢查檢查PCR反反應(yīng)產(chǎn)應(yīng)產(chǎn)物的特異性物的特異性Temperature Fluorescence 導(dǎo)數(shù)圖譜61 每個循每個循環(huán)環(huán)之后之后理論上，反應(yīng)管里的目標(biāo)片斷數(shù)會加倍。熒光信號相應(yīng)成比例增長。62 優(yōu)點(diǎn)更高的特異性 不會有引物二聚體干擾支持多重?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法易于優(yōu)化 缺點(diǎn) 價格稍貴 優(yōu)點(diǎn)價格

9、便宜大部分基因以及少量樣品均適用 缺點(diǎn)特異性稍差必須要做 Melt curves 不支持多重?zé)晒庠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法通常需要優(yōu)化64Xn = X0 2n6566 Baseline 基基線線定義背景區(qū)域: cycle-to-cycle 的范圍67 Threshold 閾值閾值在擴(kuò)增曲線上，可以調(diào)節(jié)的一條水平線告訴軟件到哪里獲得分析數(shù)據(jù) 68 Cycle threshold （又稱又稱 Ct值）擴(kuò)增曲線與閾值的焦點(diǎn)，對應(yīng)的帶小數(shù)點(diǎn)的循環(huán)數(shù)This curve crosses the threshold at cycle 23.169 Xn = X01 2Ct1 = X02 2Ct2 nlgXnX01X02

10、lgXnCt1Ct270X01 / X02 = 2 - Ct7172 通常基通?；€線起點(diǎn)起點(diǎn)為為 Cycle 3 73 通?；ǔ；€線終終點(diǎn)點(diǎn)設(shè)設(shè)置在置在實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)信號脫離噪音信號上升前信號脫離噪音信號上升前74 軟軟件自件自動設(shè)動設(shè)置基置基線線軟件自動為您選定基線區(qū)域75 軟軟件自件自動設(shè)動設(shè)置基置基線線每個樣品單獨(dú)設(shè)置基線。 可以使每個樣品擁有 “完美” 基線?？梢哉疹櫟郊扔懈邼舛葮悠芬灿械蜐舛葮悠返膶?shí)驗(yàn)。76 自自動設(shè)動設(shè)置基置基線線失失敗敗某些樣品的Baseline會很短，出現(xiàn)S型彎曲解決辦法: 使用 Manual Baseline設(shè)置基線77 最佳位置最佳位置: Xn = X0 2

11、n 成立（指數(shù)成立（指數(shù)/對對數(shù)數(shù)擴(kuò)擴(kuò)增期）增期）78 軟軟件自件自動設(shè)動設(shè)定定閾值閾值79 軟軟件自件自動設(shè)動設(shè)定定閾值閾值對對于不同的批次的于不同的批次的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，需要，需要單單獨(dú)獨(dú)設(shè)設(shè)置置閾值閾值因因?yàn)闉椴煌蔚牟煌蔚膶?shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，會有不同的指數(shù)，會有不同的指數(shù)/對對數(shù)數(shù)擴(kuò)擴(kuò)增期增期80 自自動動分析分析 手手動動分析分析基基線線決定決定閾值閾值閾值閾值決定決定Ct值值81 基基線線決定決定閾值閾值Linear圖圖里找基里找基線線， ，基基線線 對應(yīng)對應(yīng) 曲曲線線形狀形狀82 閾值閾值決定決定Ct值值Log圖圖里找里找閾值閾值， ，指數(shù)期指數(shù)期 對應(yīng)對應(yīng) 閾值閾值83Question:

12、就定量而言，Ct有什么意義?Answer . . .沒有意義。需要把需要把Ct轉(zhuǎn)化為有意義的數(shù)值轉(zhuǎn)化為有意義的數(shù)值8485Presence/AbsenceAllelic DiscriminationEnd-point終點(diǎn)檢測終點(diǎn)檢測Quantitative PCRReal-time實(shí)時檢測實(shí)時檢測86 End-point 方法方法不需要不需要實(shí)時實(shí)時數(shù)據(jù)收集數(shù)據(jù)收集 只需要只需要2分分鐘樣鐘樣品品掃掃描。描。不是定量不是定量實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，是定性，是定性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。 。可以在普通可以在普通PCR儀儀上完成上完成擴(kuò)擴(kuò)增。增。定性定性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)不需要不需要檢測檢測Ct值值。 。 Real-time 方法方法

13、使用使用實(shí)時實(shí)時定量定量PCR儀儀，在每個循，在每個循環(huán)環(huán)后采集數(shù)據(jù)。后采集數(shù)據(jù)。定量定量實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)必必須檢測須檢測Ct值值。 。87如何把如何把Ct轉(zhuǎn)化為有意義的數(shù)值轉(zhuǎn)化為有意義的數(shù)值88107106105104103倍比稀釋89 實(shí)驗(yàn)結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)未知束后，根據(jù)未知樣樣品的品的Ct讀讀取未知取未知樣樣品品濃濃度度Standard /dilution amt.Cycle (Ct)Qty = 2,50010100,00010,0001000100Unknown Ct90 不不僅絕對僅絕對定量，相定量，相對對定量也可以使用定量也可以使用Standard /dilution amt.Cycle (Ct)Qty = 250aa10,000a1,000a100a10aUnknown Ct91 理理論論基基礎(chǔ)礎(chǔ): X01 /