實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和細(xì)菌培養(yǎng)

1、基因工程原理與方法基因工程原理與方法任課老師：劉振蘭（實(shí)驗(yàn)部分）辦公地點(diǎn)：生科院北樓607辦公電話：85280200672473）郵 箱：zhenlan_公共郵箱：（密碼：genetics）11）概述5%2）基因克隆的工具酶15%3）基因克隆的載體15%4）基因操作的基本技術(shù)15%5）基因工程實(shí)驗(yàn)原理與方法50%1）填空題25%2）名詞解釋15%3）判斷題15%4）簡答題25%5）分析題20%期末期末考試考試范圍與題型范圍與題型2實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 堿裂解法抽提質(zhì)粒堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的電泳檢測的電泳檢測實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的濃度測定和

2、酶切的濃度測定和酶切實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 酶切產(chǎn)物的電泳和目的片段的回收酶切產(chǎn)物的電泳和目的片段的回收實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 DNA的體外連接的體外連接實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 重組重組DNA的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 重組轉(zhuǎn)化子的快速鑒定重組轉(zhuǎn)化子的快速鑒定實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 植物基因組植物基因組DNA的提取的提取實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十 基因組基因組DNA的的Southern雜交分析雜交分析實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3微型離心管（微型離心管（eppendorf管）管）96孔孔PCR板和板和96孔培養(yǎng)板孔培養(yǎng)板12 ml 細(xì)菌培養(yǎng)管細(xì)菌培養(yǎng)管PCR管和管和PCR八連管八連管吸頭（吸頭（tip

3、頭）頭）常常用用實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)耗耗材材吸頭盒吸頭盒100 l -1 ml1 l -200 l 0.1 l -10 l 4吸頭吸頭套筒套筒容量顯示窗容量顯示窗吸頭脫卸按鈕吸頭脫卸按鈕體積調(diào)節(jié)旋鈕體積調(diào)節(jié)旋鈕移液器移液器（Pipettor）的基本結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)移液器容量移液器容量0.1-2.5 l 1- 10 l 2- 20 l 10 -100 l 20-200 l 100 -1000 l 200 -1000 l 5000 l 與 10 mLTip coneTip ejector collarDisplay coverTip ejectorPush button5移液器的使用移液器的使用移液器規(guī)范操作步

4、驟：移液器規(guī)范操作步驟：第一步第一步 設(shè)定移液體積設(shè)定移液體積 (Volume setting)從大體積調(diào)節(jié)至小體積時(shí)，為正常調(diào)節(jié)方法，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度即可，從小 體積調(diào)節(jié)至大體積時(shí)，可先順時(shí)針調(diào)至超過設(shè)定體積的刻度，再回調(diào)至設(shè) 定體積，可保證最佳的精確度。第二步第二步 裝配移液器吸頭裝配移液器吸頭 (Sealing and ejecting tips)對(duì)于單道移液器，將移液器端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)，上緊即可。第三步第三步 吸液和放液吸液和放液 (pipetting techniques) 垂直吸液 吸頭尖端需浸入液面以下 慢吸慢放，控制好彈簧的伸縮速度 放液時(shí)吸頭尖端靠在容器內(nèi)壁移液器容

5、量移液器容量 入液深度入液深度 2 10 l 1 mm 20 100 l 2-3 mm 200 1000 l 3-6 mm 5000 l 10 ml 6-10 mm61、如如長時(shí)間不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧長時(shí)間不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧；處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧；2、定期定期清潔移液清潔移液器器外壁，可以用外壁，可以用95%乙醇乙醇或或60%的異丙醇，再用蒸餾的異丙醇，再用蒸餾水擦拭，自然晾干；水擦拭，自然晾干；3、使用使用時(shí)要檢查是否有漏液時(shí)要檢查是否有漏液現(xiàn)象現(xiàn)象：方法方法是吸取液體后懸空垂直是吸取液體后懸空垂直放置放置15

6、秒秒，看看液面是否下降。如果漏液，則檢查吸液嘴是否匹配和看看液面是否下降。如果漏液，則檢查吸液嘴是否匹配和彈簧活塞是否正常；彈簧活塞是否正常；4、當(dāng)當(dāng)移液器吸嘴內(nèi)有液體時(shí)，嚴(yán)禁將移液器水平或倒置放置，以防移液器吸嘴內(nèi)有液體時(shí)，嚴(yán)禁將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞；液體流入活塞室腐蝕移液器活塞；5、使用、使用正確的方法安裝正確的方法安裝吸頭吸頭，切記用力不能過猛，更不能采取剁吸切記用力不能過猛，更不能采取剁吸頭的方法來進(jìn)行頭的方法來進(jìn)行安裝安裝。移液器的日常維護(hù)保養(yǎng)移液器的日常維護(hù)保養(yǎng)7移液器的檢測和校準(zhǔn)移液器的檢測和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)容量標(biāo)準(zhǔn)容量 最大允許誤差最大允許誤差 5 l

7、 0.3 l 10 l 0.3 l 20 l 0.4 l 100 l 1.5 l 200 l 2 l 500 l 5 l 1000 l 10 l 5000 l 50 l8標(biāo)準(zhǔn)容量標(biāo)準(zhǔn)容量 最大允許誤差最大允許誤差 5 l 0.3 l 10 l 0.3 l 20 l 0.4 l 100 l 1.5 l 200 l 2 l 500 l 5 l 1000 l 10 l 5000 l 50 l9超凈工作臺(tái)的使用超凈工作臺(tái)的使用1. 操作區(qū)內(nèi)不允許存放不必要的物品，保持工作區(qū)的潔凈氣流流型不受干擾。操作區(qū)內(nèi)不允許存放不必要的物品，保持工作區(qū)的潔凈氣流流型不受干擾。2. 使用前打開超凈工作臺(tái)的玻璃板，正確

8、的方法是，兩手均勻用力托起玻璃板使用前打開超凈工作臺(tái)的玻璃板，正確的方法是，兩手均勻用力托起玻璃板兩端的把手到適當(dāng)位置。兩端的把手到適當(dāng)位置。3. 用用75%乙醇對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔后關(guān)閉玻璃板。乙醇對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔后關(guān)閉玻璃板。4. 打開紫外燈，同時(shí)關(guān)閉日光燈進(jìn)行紫外殺菌處理，一般處理打開紫外燈，同時(shí)關(guān)閉日光燈進(jìn)行紫外殺菌處理，一般處理20分鐘以上。分鐘以上。5. 關(guān)閉紫外燈關(guān)閉紫外燈20分鐘。分鐘。6. 打開玻璃板和日光燈，調(diào)整風(fēng)機(jī)到適當(dāng)?shù)乃俣冗M(jìn)行無菌操作。打開玻璃板和日光燈，調(diào)整風(fēng)機(jī)到適當(dāng)?shù)乃俣冗M(jìn)行無菌操作。7. 操作完畢用操作完畢用75%乙醇對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔，必要時(shí)打開紫外燈進(jìn)行殺菌處理后再乙醇

9、對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔，必要時(shí)打開紫外燈進(jìn)行殺菌處理后再關(guān)閉電源。關(guān)閉電源。10大腸桿菌的液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)大腸桿菌的液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)液體細(xì)菌培養(yǎng)液體細(xì)菌培養(yǎng)小量培養(yǎng)小量培養(yǎng)：l 準(zhǔn)備培養(yǎng)管：清洗管子和蓋子后，放入500 ml或1 L的玻璃燒杯中，燒杯中加入約1/3體積的水，蓋上保鮮膜微波加熱至沸騰，約5-10 min）；l超凈工作臺(tái)操作：取滅菌 的12 ml細(xì)菌培養(yǎng)管，加 3 ml 液體LB 培養(yǎng)基，再加 100 mg/ml 氨芐青霉素 3 l；l 用鑷子夾取無菌牙簽挑取單菌落，送入培養(yǎng)基中；或取菌液 5 l ，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中，封好管口（牙簽可去除或者保留）；l傾斜培養(yǎng)管放入 37搖床培養(yǎng) 200

10、rpm/min 震蕩培養(yǎng)過夜，約 12 小時(shí)；l待菌液生長至飽和時(shí)取出抽提質(zhì)粒，若暫時(shí)不用，可放入4冰箱保存。大量培養(yǎng)大量培養(yǎng)：取 500 ml 培養(yǎng)瓶內(nèi)裝培養(yǎng)基 100-200 ml，及相應(yīng)抗生素。以 0.5-1 %濃度接種菌液，37 度搖床培養(yǎng)200 rpm/min至OD600值0.6-0.8。固體細(xì)菌培養(yǎng)固體細(xì)菌培養(yǎng)用于單一菌落的挑選，轉(zhuǎn)化后抗性菌落的篩選。11LB培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：一般被解釋為Luria-Bertani培養(yǎng)基，這個(gè)名字來源於英語的lysogeny broth，即溶菌肉湯。生化分子實(shí)驗(yàn)中一般用該培養(yǎng)基來預(yù)培養(yǎng)菌種，使菌種成倍擴(kuò)增，達(dá)到使用要求。（圖片引自：http:/zh.

11、/wiki/File:LBmedium.JPG）液體液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基固體固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基一瓶LB液體培養(yǎng)基和一塊含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)平板12菌種活化：甘油法保存的含有質(zhì)粒的菌種菌種活化：甘油法保存的含有質(zhì)粒的菌種13劃板后標(biāo)識(shí)清楚，于37度恒溫箱中將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)過夜，待菌落長至合適大小時(shí)倒置放入4度冰箱保存（可放置一個(gè)月左右）。14培養(yǎng)皿上標(biāo)識(shí)一般寫底部邊緣。培養(yǎng)皿上標(biāo)識(shí)一般寫底部邊緣。15含質(zhì)粒的大腸桿菌菌種的保存含質(zhì)粒的大腸桿菌菌種的保存細(xì)菌保存于含有甘油的培養(yǎng)物中：細(xì)菌保存于含有甘油的培養(yǎng)物中：在液體培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌培養(yǎng)物：取在液體培養(yǎng)基中生長的細(xì)

12、菌培養(yǎng)物：取0.5 ml細(xì)菌培養(yǎng)物放入細(xì)菌培養(yǎng)物放入1.5 ml滅菌滅菌的離心管內(nèi)，加入的離心管內(nèi)，加入0.5 ml高壓滅菌高壓滅菌30%甘油（甘油（W/V），振蕩培養(yǎng)物使甘），振蕩培養(yǎng)物使甘油分布均勻，然后轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的保存管內(nèi)，密封，在乙醇干冰或液油分布均勻，然后轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的保存管內(nèi)，密封，在乙醇干冰或液氮中凍結(jié)后再轉(zhuǎn)至氮中凍結(jié)后再轉(zhuǎn)至70度長期保存。在復(fù)蘇時(shí)，用滅菌接種針刮取凍結(jié)度長期保存。在復(fù)蘇時(shí)，用滅菌接種針刮取凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，然后立即把黏附于接種針上的細(xì)菌劃于含適當(dāng)抗生素的的培養(yǎng)物表面，然后立即把黏附于接種針上的細(xì)菌劃于含適當(dāng)抗生素的LB瓊脂平板表面，于瓊脂平板表面，于37度倒

13、置培養(yǎng)過夜。度倒置培養(yǎng)過夜。100 ml 30%甘油的配制：甘油的配制：稱量稱量30克甘油，然后用克甘油，然后用ddH2O定容到定容到100 ml，高壓滅菌后保存于高壓滅菌后保存于4度冰箱。度冰箱。16細(xì)菌培養(yǎng)注意事項(xiàng)細(xì)菌培養(yǎng)注意事項(xiàng)要保持培養(yǎng)物通氣良好：要保持培養(yǎng)物通氣良好：1、試管的體積應(yīng)該至少比細(xì)菌培養(yǎng)物的體積大4倍；2、試管不宜蓋緊；斜面培養(yǎng)用以增大培養(yǎng)基與空氣的接觸面積；3、培養(yǎng)物應(yīng)在劇烈震搖下培養(yǎng)。大腸桿菌的菌落特征大腸桿菌的菌落特征：乳白色、圓形、菌落邊緣整齊、表面光滑、表面和背面顏色一致。細(xì)菌培養(yǎng)物的處理：細(xì)菌培養(yǎng)物的處理：滅菌后丟棄。17細(xì)菌生長的典型曲線細(xì)菌生長的典型曲線(

14、.延遲期， .對(duì)數(shù)期， .穩(wěn)定期， .衰亡期)18(1) 延遲期：少量細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基后，一般不立即進(jìn)行繁殖，生長速度近于零。因此在開始一段時(shí)間，細(xì)菌數(shù)幾乎保持不變，甚至稍有減少。這段時(shí)間被稱為延遲期，又稱為遲緩期、調(diào)整期或滯留適應(yīng)期。處于延遲期細(xì)菌細(xì)胞的特點(diǎn)是分裂遲緩、代謝活躍。延遲期的長短與菌種、種齡、接種量和培養(yǎng)基成分有關(guān)。(2) 對(duì)數(shù)期：對(duì)數(shù)期又稱指數(shù)期。這一階段突出特點(diǎn)是細(xì)菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增加，代時(shí)穩(wěn)定，細(xì)菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增加，與菌液混濁度的增加均呈正相關(guān)性。(3) 穩(wěn)定期：又稱恒定期或最高生長期。處于穩(wěn)定期的微生物，新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，整個(gè)培養(yǎng)物中二

15、者處于動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)生長速度又逐漸趨向零。穩(wěn)定期的細(xì)胞內(nèi)開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數(shù)芽孢細(xì)菌也在此階段形成芽孢。如果為了獲得大量菌體，就應(yīng)在此階段收獲，因這時(shí)細(xì)胞總數(shù)最高；這一時(shí)期也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也在此時(shí)期。(4) 衰亡期：穩(wěn)定期后如再繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負(fù)生長”，此階段叫衰亡期。19分光光度計(jì)法測定大腸桿菌液體培養(yǎng)物的分光光度計(jì)法測定大腸桿菌液體培養(yǎng)物的OD600值值細(xì)菌細(xì)菌OD的測定原理是細(xì)菌顆粒的遮光，可以用來檢測細(xì)胞數(shù)量，而通過數(shù)量能反映的測定原理是細(xì)

16、菌顆粒的遮光，可以用來檢測細(xì)胞數(shù)量，而通過數(shù)量能反映出細(xì)胞生長的狀態(tài)。菌液濃度太高，用培養(yǎng)基稀釋可以降低出細(xì)胞生長的狀態(tài)。菌液濃度太高，用培養(yǎng)基稀釋可以降低OD值，但是太高濃度值，但是太高濃度OD值的菌液可能細(xì)菌的生長狀態(tài)不符合要求，比如死的菌體會(huì)比較多等。值的菌液可能細(xì)菌的生長狀態(tài)不符合要求，比如死的菌體會(huì)比較多等。1、在使用分光光度計(jì)時(shí)，測得的、在使用分光光度計(jì)時(shí)，測得的OD值在值在0 .1-0.4這個(gè)區(qū)間內(nèi)最可靠，最好不要超過這個(gè)區(qū)間內(nèi)最可靠，最好不要超過1.0。因此。因此OD盡量控制在盡量控制在0.1-1之間，最多不要超過之間，最多不要超過2.0。取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，。取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)重復(fù)3次的數(shù)最好。次的數(shù)最好。2、空白用不接種的培養(yǎng)基，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)，以求條件一、空白用不接種的培養(yǎng)基，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)，以求條件一致。致。3、OD與體積或者說稀釋倍數(shù)不一定成正比，如果與體