藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證

1、藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證及檢驗知識培訓(xùn)1、分析方法的驗證2、分析方法的確認(rèn)3、分析方法的轉(zhuǎn)移4、方法驗證、方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移的文件管理第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證主要包括以下內(nèi)容：主要包括以下內(nèi)容：l第十二條 質(zhì)量控制的基本要求：（四）檢驗方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗證或確認(rèn)；l第一百三十九條 企業(yè)的廠房、設(shè)施、設(shè)備和檢驗儀器應(yīng)當(dāng)經(jīng)過確認(rèn)，應(yīng)當(dāng)采用經(jīng)過驗證的生產(chǎn)工藝、操作規(guī)程和檢驗方法進行生產(chǎn)、操作和檢驗，并保持持續(xù)的驗證狀態(tài)。l第一百四十二條 當(dāng)影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素，如原輔料、與藥品直接接觸的包裝材料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境（或廠房）、生產(chǎn)工藝、檢驗方法等發(fā)生變更時，

2、應(yīng)當(dāng)進行確認(rèn)或驗證。必要時，還應(yīng)當(dāng)經(jīng)藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。l第一百四十三條 清潔方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗證，證實其清潔的效果，以有效防止污染和交叉污染。清潔驗證應(yīng)當(dāng)綜合考慮設(shè)備使用情況、所使用的清潔劑和消毒劑、取樣方法和位置以及相應(yīng)的取樣回收率、殘留物的性質(zhì)和限度、殘留物檢驗方法的靈敏度等因素。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證法規(guī)要求：藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范法規(guī)要求：藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范l第一百四十七條 應(yīng)當(dāng)根據(jù)確認(rèn)或驗證的對象制定確認(rèn)或驗證方案，并經(jīng)審核、批準(zhǔn)。確認(rèn)或驗證方案應(yīng)當(dāng)明確職責(zé)。l第一百四十八條 確認(rèn)或驗證應(yīng)當(dāng)按照預(yù)先確定和批準(zhǔn)的方案實施，并有記錄。確認(rèn)或驗

3、證工作完成后，應(yīng)當(dāng)寫出報告，并經(jīng)審核、批準(zhǔn)。確認(rèn)或驗證的結(jié)果和結(jié)論（包括評價和建議）應(yīng)當(dāng)有記錄并存檔。l第一百四十九條 應(yīng)當(dāng)根據(jù)驗證的結(jié)果確認(rèn)工藝規(guī)程和操作規(guī)程。l第一百六十二條 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、工藝規(guī)程、操作規(guī)程、穩(wěn)定性考察、確認(rèn)、驗證、變更等其他重要文件應(yīng)當(dāng)長期保存。l第二百二十三條 物料和不同生產(chǎn)階段產(chǎn)品的檢驗應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：l（一）企業(yè)應(yīng)當(dāng)確保藥品按照注冊批準(zhǔn)的方法進行全項檢驗；l（二）符合下列情形之一的，應(yīng)當(dāng)對檢驗方法進行驗證：第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證法規(guī)要求：藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范法規(guī)要求：藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范l1.采用新的檢驗方法；l2.

4、檢驗方法需變更的；l3.采用中華人民共和國藥典及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗方法；l4.法規(guī)規(guī)定的其他需要驗證的檢驗方法。l（三） 對不需要進行驗證的檢驗方法，企業(yè)應(yīng)當(dāng)對檢驗方法進行確認(rèn)，以確保檢驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠；l（ 四）檢驗應(yīng)當(dāng)有書面操作規(guī)程，規(guī)定所用方法、儀器和設(shè)備，檢驗操作規(guī)程的內(nèi)容應(yīng)當(dāng)與經(jīng)確認(rèn)或驗證的檢驗方法一致；l第二百三十條 產(chǎn)品的放行應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：l（一）在批準(zhǔn)放行前，應(yīng)當(dāng)對每批藥品進行質(zhì)量評價，保證藥品及其生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)符合注冊和本規(guī)范要求，并確認(rèn)以下各項內(nèi)容：l1.主要生產(chǎn)工藝和檢驗方法經(jīng)過驗證；第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證法規(guī)要求：藥

5、品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范法規(guī)要求：藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范l方法驗證就是根據(jù)檢驗項目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容和驗證標(biāo)準(zhǔn)要求，并通過設(shè)計合理的實驗來驗證所采用分析方法是否符合檢驗項目的要求。 建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)對分析方法中的各檢驗項目進行完整的驗證； 當(dāng)藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法修訂時，可根據(jù)變更的內(nèi)容決定對分析方法進行部分驗證還是完整的驗證； 當(dāng)原料藥合成工藝發(fā)生變更時，可能引人新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢査方法和含量測定方法的專屬性就需要進行驗證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成分的含量測定應(yīng)無干擾； 當(dāng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中某一項目分析方法發(fā)生部分改變時，如采用高效液

6、相色譜法測定含量時，檢測波長發(fā)生改變，則需要重新進行檢測限、定量限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，證明修訂后的分析方法的合理可行； 當(dāng)變更達到一定程度時，則需要完整的驗證。如分析方法完全改變，則應(yīng)按新方法進行完整的驗證。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l方法驗證的一般原則：方法驗證的一般原則：l通常情況下，分析方法需進行方法驗證。對于僅需按照實驗室日常測試操作步驟即可測定的檢驗項目不需要進行驗證，如外觀、崩解時限、密度、重量、pH值、灰分、裝量等。l方法驗證的內(nèi)容應(yīng)根據(jù)檢驗項目的要求，結(jié)合所采用分析方法的特點確定。l同一分析方法用

7、于不同的檢驗項目會有不同的驗證要求。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l需要驗證的檢驗項目需要驗證的檢驗項目l檢驗項目是為控制藥品質(zhì)量，保證藥品安全有效而設(shè)定的測試項目。根據(jù)檢驗項目的設(shè)定目的和驗證內(nèi)容的不同要求，將需驗證的檢驗項目分為四類： 鑒別試驗； 雜質(zhì)的限度檢查； 雜質(zhì)的定量測定； 含量測定，包括原料藥或制劑中有效成分的含量，制劑中其他成分（如防腐劑等）的含量，溶出度與釋放度等檢查中的溶出量，以及含量均勻度。l除此之外還有一些物理項目的檢測如粒徑分布、旋光度、熔點和硬度，其要求與其他檢驗項目有所不同，通常其分析方法驗證應(yīng)有不同的要求。l

8、鑒別的目的在于判定被分析物是目標(biāo)化合物，而非其他物質(zhì)。用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性和耐用性。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l雜質(zhì)檢査主要用于控制主成分以外的雜質(zhì)，如無機雜質(zhì)、有機雜質(zhì)等。雜質(zhì)檢查分為限度檢査和定量測定兩部分。用于限度檢査的分析方法驗證側(cè)重專屬性、檢測限和耐用性。用于定量測定的分析方法驗證強調(diào)專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、范圍、定量限和耐用性。l含量測定對準(zhǔn)確度要求較高，因此所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準(zhǔn)確度和線性等要求。l中國藥典2010年版中規(guī)定了不同的檢驗項目需要驗證不同的內(nèi)容，詳見下表：第一部分：藥

9、品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l檢驗項目和驗證內(nèi)容第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證驗證內(nèi)容檢驗項目鑒別雜質(zhì)測定含量測定定量限度準(zhǔn)確度否是否是精密度重復(fù)性否是否是中間精密度否是*否是*專屬性*是是是是檢測限否是*是否定量限否是否否線性否是否是范圍否是否是耐用性是是是是備注：1. * : 已有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度；2. * ：如一種方法不夠?qū)?，可由其他分析方法予以補充；3. * ：視具體情況予以驗證；4. “是” 代表該項內(nèi)容需要驗證，“否” 代表該項內(nèi)容不需要驗證。l方法驗證內(nèi)容（本次主要介

10、紹方法驗證內(nèi)容（本次主要介紹HPLCHPLC法含量測定方法的驗證過程）法含量測定方法的驗證過程）l1 1、色譜方法開發(fā)流程主要包括以下步驟：、色譜方法開發(fā)流程主要包括以下步驟：l選擇分離模式l選擇色譜柱和填料規(guī)格l選擇流動相溶劑l如果分離模式需要，調(diào)節(jié)流動相的pH值l進行等度或梯度初步實驗，以確定邊界條件l優(yōu)化實驗條件第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l模式選擇模式選擇l通常分離模式是由以上因素決定：目標(biāo)物的類型和溶解度、目標(biāo)物分子量（MW）、樣品基質(zhì)以及可使用的固定相和色譜柱。l如：分子量2000在有機相中選擇正相、反相，在水相中選擇反相、離

11、子對試劑反相或離子交換；分子量2000在有機相中可選擇凝膠滲透，在水相中選擇凝膠過濾、大孔填料的離子交換或大孔填料的反相色譜。l又如：在水相/有機相中單糖和二糖可采用正相氨基、離子交換，多環(huán)芳烴采用反相C18，有機酸采用配位相互作用反相離子對，堿性、極性化合物采用極性反相C8、C18或反相C18離子抑制，位置異構(gòu)體采用反相C8，強極性化合物采用HILIC模式；在有機相非極性化合物采用正相Si，極性化合物采用正相氨基、氰基。在水相中合成的多分散性聚合物并限定分子量范圍采用體積排阻，合成多肽采用反相，聚合物采用水相GPC，重組多肽和Pr采用反相、陰離子或陽離子交換；在有機相中合成的多分散性聚合物和

12、其它可溶于有機溶劑的聚合物采用凝膠滲透，低聚物采用反相。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l選擇色譜柱和填料規(guī)格選擇色譜柱和填料規(guī)格l通常我們需考慮色譜柱固定相孔徑、填料的粒徑、長度和內(nèi)徑。l要進行高通量分析可采用小粒徑短柱（如亞2m）l若對包括多種組分的樣品進行復(fù)雜的分離，可以選擇小顆粒長柱。l若要進行高靈敏度分析可采用2.1mm內(nèi)徑的色譜柱。l填料的孔徑非常用重要，因為待測分子必須與多孔結(jié)構(gòu)“相匹配”，才能與固定相發(fā)生相互作用。較小孔徑的填料（孔徑80到120）適合分離分子量2000以下的小分子，對于分子量超過2000的較大分子，需要使用較

13、大孔填料；例如：分離Pr的?？讖绞?00。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l選擇流動相溶劑（介紹反相）選擇流動相溶劑（介紹反相）l流動相主要由兩部分組成：l1、水：可含緩沖液，或用酸或堿調(diào)節(jié)pH值l2、可與水混溶的有機溶劑l反相色譜有多種用途，有時在同一色譜分析中就可以分離非極性、極性、可離子化的和離子型分子。一般來說，對于可離子化的化合物，為了增加保留和改善峰形，我們會在流動相中加入改性劑，以抑制離子化，減弱其極性，使其保留更強。l一般來說，反相 LC 的流動相包括水（190nm）和作為改性劑的乙腈（190nm）或甲醇（205nm）,不太常

14、用的改性劑還有四氫呋喃（THF 212nm ）和異丙醇（205nm） 。l選擇性差異和樣品的保留都會因流動相不同而明顯改變。樣品溶解度也很可能不同，需要使用特殊的溶劑或多種溶劑。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l在反相色譜中，流動相中水相的pH和離子強度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化。在這類反相系統(tǒng)中，控制pH對于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l用流動相改性劑控制用流動相改性劑控制pHpHl流

15、動相pH對色譜分離的影響有多種方式。根據(jù)所分析的化合物，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是非極性較強或中性的化合物，pH對分離度和保留的影響一般不明顯。l如果是酸性分析物，應(yīng)選擇低pH緩沖液流動相，以防止分析物離子化。了解分析物的pKa，才能夠有效地選擇流動相pH。緩沖范圍應(yīng)在其緩沖液離子pK值的 +/-1 pH單位，使流動相的優(yōu)化具有一定的靈活性。例如，醋酸鹽的pKa為4.8，緩沖范圍從pH3.8-5.8。甲酸鹽的酸性較大，緩沖范圍為pH2.8-4.8。l對于堿性化合物而言，在高pH條件下才能得到其非離子化形態(tài)，但這對色譜柱不利。但許多堿性化合物在低pH條件下的保留就已經(jīng)足夠了。因此，雖

16、然非離子化形態(tài)能得到更高的保留，但這對與所有的堿性化合物并不是實用和必要的。lUV 檢測器常用的緩沖液：磷酸及其鹽類具有良好的低UV透光率（200nm），和乙腈（190nm）一起，成為許多方法開發(fā)工作者的首選。對堿的分離，可以選擇 TEA（200nm）-磷酸鹽。磷酸鹽在有機相比例高的溶劑中溶解度較低，針對這一缺陷，建議磷酸鹽緩沖液與有機溶劑混合時，有機相不要超過70%。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l優(yōu)化反相色譜條件優(yōu)化反相色譜條件l在確定了色譜柱規(guī)格、合適的固定相柱填料、流動相溶劑和改性劑后，即可開始優(yōu)化方法。方法的優(yōu)化是根據(jù)最終目標(biāo)決定

17、的。如果要開發(fā)質(zhì)量控制方法，您可能會需要像等度分離這種可變因素較少的方法。如果目標(biāo)是得到最高分離度，節(jié)省分析時間并不是首要問題，可以選擇長柱使所有組分都得到最大分離度。如果分離速度很重要，則應(yīng)使用短柱和高流速。對于含許多保留不同的目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，用等度分離可能不能解決問題，應(yīng)開發(fā)并優(yōu)化梯度方法。l等度優(yōu)化的一般方法是不斷改變流動相強度（%B），直到獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ舴秶?。這種方法有時也稱為“溶劑篩查”。對于簡單的分離，k 值應(yīng)在 1 到 10 之間。如果 k 值太低（比如， 10），分析時間將變得過長，檢測限會因峰展寬而提高。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗

18、證方法驗證方法驗證l對于反相色譜中的等度方法開發(fā)是從流動相有機改性劑最高比例開始，然后逐漸降低。在降低流動相強度之前，先要確定所有組分都已從柱中洗出。如果組分保留在色譜柱中，以后可能在B相比例較低的流動相中洗脫，成為無法解釋的“鬼峰”。通常，流動相以+/-10%（如，90%B、80%B、70%B等）或 +/-20%的幅度改變。l一旦建立優(yōu)化條件，如果目標(biāo)還沒有得到完全分離，則需繼續(xù)提高選擇性 ()。如需分離兩個相鄰的色譜峰會涉及到許多實驗參數(shù)的調(diào)節(jié)。溫度可以作為一個變量。大多數(shù)現(xiàn)代儀器都具有某種類型的柱溫控制器，大部分反相柱可以承受高達60的溫度，有些甚至更高。一般來說，升高溫度可以縮短所有峰

19、的保留時間，但對有些峰的影響可能與對其它峰不同，從而導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化。l其它用于改變選擇性的變量如下：l1. pH（對于可離子化的化合物）l2. 緩沖液（離子）強度l3. 緩沖液類型（比如，磷酸鹽、醋酸鹽或甲酸鹽，取決于需要的pH范圍）l4. 流動相有機改性劑（比如，從乙腈變?yōu)榧状蓟騼烧叩幕旌弦海﹍5. 流速（一般而言，較低的流速可能對分離略有改善）l6. 離子對試劑濃度（如果使用離子對 RPC）第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l如果調(diào)節(jié)這些參數(shù)還不能改善分離，那么最好的解決辦法就是改變色譜柱或固定相。更長的色譜柱具有更多塔板數(shù)，因此有助于

20、分離，但切記，分離度只能增加長度的平方根。柱長加倍使分析時間和溶劑消耗加倍，而靈敏度降低，但只能使分離度提高約40%。l梯度優(yōu)化 對于含各種組分的樣品混合物來說，選擇單一流動相組分可能得不到滿意的解決方案。例如，某些樣品組分，如強極性分析物，可能很快從反相柱上被洗脫下來，而疏水性組分可能在疏水性的C8或C18上吸附非常強，洗脫不下來。對這一問題的解決方案是隨時間改變流動相組成（梯度洗脫）。在絕大多數(shù)例子中，初始流動相非常弱（比如，含水量高），隨時間的推移，有機溶劑的百分比通常是以線性形式增加。如使用了寬范圍的快速梯度（比如，10分鐘內(nèi)B由5%變到95%），確定目標(biāo)化合物的最佳梯度范圍。找到目標(biāo)

21、峰洗脫的流動相比例，然后通過下一次梯度，調(diào)節(jié)k*范圍，讓梯度分離在合理的時間內(nèi)完成。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l方法開發(fā)過程需滿足條件： 理論板數(shù)：一般要求3000或4000 分離度：一般要求1.8，實際研究盡量2.0 托尾因子：一般要求0.951.05之間 待測物保留時間：最好調(diào)至20分鐘左右（根據(jù)分離度）第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l2 2、供試品溶液制備：、供試品溶液制備：化藥一般直接用水、相應(yīng)的溶劑或流動相溶解即可；而中藥一般過程相對復(fù)雜，現(xiàn)以中藥的制備進行說明，包括以下過

22、程。l提取溶劑選擇l提取方式l提取時間第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l提取溶劑選擇提取溶劑選擇l一般選擇80%甲醇、50%甲醇、乙醇等（注意100%強溶劑的色譜峰過早洗脫現(xiàn)象）；l選擇溶劑時，固定提取方式和提取時間（一般超聲30分鐘），看哪種溶劑提取含量高，證明效果好，為最佳提取溶劑。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l提取方式選擇提取方式選擇l一般回流提取1小時、超聲30分鐘、冷浸8小時等（各條件需驗證）；l如：提取溶劑為80%甲醇，在以上三條件下確定最佳提取方式；l經(jīng)驗：一般回流提取1小

23、時與超聲30分鐘比較接近，由于超聲比較方便，故一般選擇超聲提?。ㄗ⒁獬曁崛」β?、頻率、時間的選擇）；l有些較堅硬的樣品，如三七、郁金、莪術(shù)粉等，一般選擇回流提??；l有些較難提取的樣品可能需回流和超聲提取配合使用；l有些化學(xué)藥品超聲后含量會降低（破壞分子結(jié)構(gòu)）；l通常冷浸效果不好（現(xiàn)藥典很少單獨采用此法），有些樣品需冷浸同超聲或回流配合應(yīng)用，以達到良好的提取效果；有些樣品如母丁香等含易揮發(fā)的成分冷浸效果好，另外揮發(fā)油一般用冷浸。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l提取時間選擇提取時間選擇l在確定提取溶劑及提取方式后，通過實驗確定提取時間；l如實

24、驗設(shè)定：分別提取20分鐘、30分鐘、40分鐘甚至50分鐘，測定含量，通過含量多少確定最佳提取時間；l下圖：提取20分鐘與30分鐘樣品含量無較大差異，為了確保提取完全，選擇30分鐘（需考慮天氣、制粒等因素的差異，故選擇30分鐘）。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l提取容器選擇提取容器選擇l一般選擇用錐形瓶或容量瓶l錐形瓶：樣品不完全溶解于提取溶劑l方法：取一定量樣品，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量提取溶劑，稱定重量，超聲（或回流）提取一定時間，取出，放冷，再稱定重量，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。l容量瓶：樣品

25、全部溶解于提取溶劑l方法：取一定量樣品，精密稱定，置量瓶中，加入提取溶劑適量，超聲（或回流）提取一定時間使樣品溶解，放冷，用提取溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。l注意：若不完全溶解于提取溶劑的樣品采用容量瓶法，則檢測結(jié)果可能會偏高。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l3 3、方法驗證內(nèi)容、方法驗證內(nèi)容l專屬性l檢測限（LOD）與定量限（LOQ）：含量測定不用做此項，雜質(zhì)定量需做此項；l線性l精密度：包括重復(fù)性試驗及中間精密度試驗，已有重現(xiàn)性不需再驗證中間精密度；l準(zhǔn)確度l范圍l耐用性l含量測定第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部

26、分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l專屬性專屬性l專屬性系指在其他成分（如：雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。通常，鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定均應(yīng)考察其專屬性。l方法1：在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向試樣中加人雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測定結(jié)果。l方法2：在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，專屬性可通過測定含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，與另一個已驗證的方法或藥典方法比較結(jié)果?；?qū)υ嚇佑脧姽庹丈?、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，用兩種方法進行含量測定，比較測定結(jié)果。必要時可采用二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢

27、測進行峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l專屬性專屬性l中藥復(fù)方可做陰性對照樣品：陰性對照色譜圖中，在與對照品相應(yīng)位置無色譜峰，則無干擾。l中藥復(fù)方有陰性干擾是很常見的事，含測是只要陰性干擾不大于5的話，是可以接受的。具體做法是：將那個“小包”也通過積分，計算其峰面積，再根據(jù)你樣品和陰性樣品的取樣量分別計算該成分的含量，陰性中該成分含量應(yīng)低于樣品含量的5；如果大于5說明專屬性不強，實在沒辦法以別的成分定量的話，就只能做雙陰性了，但法規(guī)上有一些矛盾。l色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說

28、明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置，色譜法的分離度應(yīng)符合要求。代表性圖譜包括：陰性對照色譜圖、對照品色譜圖、供試品DAD圖、對照品DAD圖、質(zhì)譜圖及各條件下的破壞性實驗圖譜等。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l檢測限（檢測限（LODLOD或或DLDL ）：含量測定可不驗證）：含量測定可不驗證l檢測限系指試樣中的被測物能夠被檢測出的最低量。l藥品的雜質(zhì)測定，應(yīng)通過測試確定方法的檢測限。l方法1：非儀器分析目視法l用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。l方法2 :信噪比法l用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試

29、樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較（現(xiàn)儀器一般不需做空白樣品，可直接計算出信噪比），計算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。l數(shù)據(jù)要求：應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結(jié)果。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l定量限（定量限（LOQLOQ或或QLQL）：含量測定可不驗證）：含量測定可不驗證l定量限系指試樣中的被測物能夠被定定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。l雜質(zhì)和降解產(chǎn)物用定量測定方法研究時，應(yīng)確定方法的定量限。l信噪比法：一般以信噪比為10:1時相應(yīng)濃

30、度或注人儀器的量確定定量限。l數(shù)據(jù)要求：應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和定量限結(jié)果。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l線性線性l線性系指在設(shè)計的測定范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與試樣中被測物的濃度直接呈正比關(guān)系的程度。l線性是定量測定的基礎(chǔ)，涉及定量測定的項目，如雜質(zhì)定量測定和含量測定均需驗證線性。l驗證方法l應(yīng)在規(guī)定的測定范圍內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進行測定，至少制備5 個濃度的供試樣品，每個濃度各一份，每份供試樣品檢測3 次，以測得的響應(yīng)信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行

31、線性回歸。必要時，響應(yīng)信號可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進行線性回歸計算。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l線性線性l通常做法l（1）如上：取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（不少于5個濃度），分別進樣相同體積，然后計算進樣量與峰面積之間的線性關(guān)系；l（2）取同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進樣不同體積（不少于5個體積），然后計算進樣量與峰面積之間的線性關(guān)系。l個人認(rèn)為：第（2）種更科學(xué)，包括樣品量的變化，進樣體積的變化，但從藥審角度來看，更青睞于第一法 ，因為第一法是單因子考察。l一般情況：直線40%設(shè)為常量，最高量為常量的2.5倍，最低量為常的1/4倍，點數(shù)一般57個。

32、l如：分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml置10ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，混勻l其中4ml配制的濃度為常量濃度第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l線性線性l通常做法l若為新藥，常量濃度如何確定？l可通過3根不同填料色譜柱，確定尖峰（非平頭）最大濃度，同時需綜合考慮樣品制備過程。l常量為最大濃度的40%l最小量為確定常量的1/4l進樣量l常量：20ll故一般體積進樣：則為5l、10l、20l、30l、40l、50ll常量：10ll故一般體積進樣：則為2.5l、5l、10l、15l、20l、25l第一部分：藥

33、品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l線性線性l線性范圍要足夠?qū)?，含量測測至少80%120%，但藥材有時特別低，所以藥材要保證最低點在線性范圍內(nèi)。l不同分析方法的線性驗證和準(zhǔn)確度驗證需涵蓋的最低濃度范圍l 第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l線性線性l數(shù)據(jù)要求l應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：r值在0.9995以上，Y軸截距應(yīng)在100響應(yīng)值的2以內(nèi)。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l精密度精密度l精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均勻供試品，

34、經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。l精密度與準(zhǔn)確度不同，下圖形象地描繪了精密度和準(zhǔn)確度之間的差別。精密度體現(xiàn)了多次重復(fù)測定同一被分析物時各測定值之間的接近程度，但它不能表達與已建立的真實值或參考值之間的符合程度，后者由準(zhǔn)確度來測定。通過一系列的測定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定與真實值或參考值相符，在這種狀況下，需要修改方法以消除偏差。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l精密度精密度l精密度與準(zhǔn)確度關(guān)系圖第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥

35、品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l精密度精密度l驗證方法l精密度可從重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性三個層次考察。l重復(fù)性：在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度。l重復(fù)性需考察以下兩方面：儀器精密度和方法精密度l儀器精密度：考察儀器（包括進樣器）、色譜柱、流動相、樣品與色譜條件之間是否符合要求。l考察方法：取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進樣6針，測得峰面積或峰高，計算RSD%值。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD%2.0 n6 第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l精密度精密度l方法精密度：在考察儀器精密度的基礎(chǔ)上，考察所擬定的方法是否符合精密度要求，包

36、括稱量，制備及測定過程。l考察方法：取同一樣品，在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9 個測定結(jié)果進行評價。例如：設(shè)計3 個不同濃度，每個濃度各分別制備3 份供試品溶液或?qū)⑾喈?dāng)于100%濃度水平的供試品溶液，用至少測定6 次的結(jié)果進行評價。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD%2.0 n6 第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l精密度精密度l中間精密度：在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員、用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度。l驗證方法：為考察隨機變動因素對精密度的影響，應(yīng)設(shè)計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備。取同一批樣品，采用同一根色譜柱，于不

37、同日期、由不同分析人員、在不同設(shè)備上考察含量結(jié)果。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD%2.0 n4第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l精密度精密度l重現(xiàn)性：在不同實驗室之間由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度。l驗證方法：法定標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法或在不同實驗室之間進行方法轉(zhuǎn)移時，應(yīng)進行重現(xiàn)性試驗。例如建立藥典分析方法時，通過協(xié)同檢驗得出重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中，應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗用的樣品本身的質(zhì)量均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD%2.0 n4第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分

38、：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度l準(zhǔn)確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度。一般用回收率表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測試。l準(zhǔn)確度是定量測定的必要條件，因此含量測定、雜質(zhì)定量測定均需驗證準(zhǔn)確度。l驗證方法l準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，至少用9個測定結(jié)果進行評價。例如：測定含量的準(zhǔn)確度，按標(biāo)示量的80%，100%和120%配制三個濃度的溶液，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。根據(jù)測定結(jié)果與配制濃度計算出平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。l原料藥含量測定準(zhǔn)確度驗證方法：l方法1：用已知純度的對照品或供試品進行測定l方法2：用本法所得結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一方

39、法測定的結(jié)果進行比較第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度l制劑含量測定準(zhǔn)確度驗證方法：l方法1 : 用含已知量被測物的各組分混合物進行測定l方法2 : 如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加人已知量的被測物進行測定。（加樣回收試驗，一般用于中藥）l方法3 : 用本法所得結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進行比較l特別說明一下中藥的加樣回收試驗：l用已知純度的對照品做加樣回收測定，即于已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試

40、驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之各必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度l加樣回收計算公式第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度l數(shù)據(jù)要求：l在規(guī)定的范圍內(nèi)，取同一濃度（100%）的供試品，用6個測定結(jié)果進行評價；或設(shè)計3個不同濃度（80%、100%、120%），每個濃度分別制備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結(jié)果進行評價，一般中間濃度加入量與所

41、取供試品含量之比控制在11左右。應(yīng)報告供試品的取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結(jié)果和回收率（%）計算值，以及回收率（%）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或可信限。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：l回收率（%）平均值在98.0%102.0%之間lRSD%2.0 n9（或n6）l濃度與回收率關(guān)系-美國官方分析化學(xué)師協(xié)會（AOAC）.gif第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l范圍范圍l范圍系指能夠達到一定的精密度、準(zhǔn)確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。l范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。l對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其范

42、圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。l可接受標(biāo)準(zhǔn)：l至少標(biāo)示量（100%溶液）的80% 120%l不需另做測試，寫出結(jié)論。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l耐用性耐用性l耐用性系指測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法可用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。l開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性。經(jīng)試驗，應(yīng)說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法有效。如果通過耐用性研究發(fā)現(xiàn)分析方法對某個或某些測試條件敏感或要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。l方法耐用性影響因素：l典型影響耐用性的變動因素：1、被測溶液的穩(wěn)定性；2、樣品的提取次數(shù)、時間等（

43、前面已講過）；l液相色譜法（HPLC) 中的典型影響耐用性的變動因素：1、流動相的組成；2、流動相的pH值；3、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱；4、柱溫；5、流速；6、其他第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l耐用性耐用性lHPLC含量方法耐用性考慮因素及變化范圍示例：l流動相的組成：有機相的5%，例如方法規(guī)定流動相緩沖溶液與甲醇的比例為4555 ,那么允許使用4060至5050范圍的比例；l流動相的pH值：0.5,如果巳知pH值為關(guān)鍵影響因素，變化范圍會更?。?0.2 ）；l色譜柱：3種不同填料的色譜柱l柱溫：5l檢測波長： 5nml流速：

44、20%l一般對照及樣品各一個，每個進2針；l可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：l主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。 第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l耐用性耐用性l溶液穩(wěn)定性研究：l溶液的穩(wěn)定性研究用來證明根據(jù)相應(yīng)方法制備的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在規(guī)定的儲存條件下在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定。如果方法中沒有規(guī)定有效期，樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液需進行穩(wěn)定性研究。l樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液依據(jù)方法進行配制和分析。在室溫或其他條件下（如冰箱28)儲存適當(dāng)?shù)臅r間。每個間隔點，用新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液做對照，測定儲存

45、的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。測定結(jié)果與初始結(jié)果進行比較，符合接受標(biāo)準(zhǔn)便可確認(rèn)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在規(guī)定的儲存條件下在規(guī)定儲存時間是穩(wěn)定的。l方法：l標(biāo)準(zhǔn)品溶液穩(wěn)定性考察：如上過程即可第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l耐用性耐用性l樣品溶液穩(wěn)定性考察：取供試品溶液，分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h、 16h、18h、24h進樣測定峰面積或峰高，計算RSD%值， 要求RSD%2.0；l注意事項：l樣品溶液穩(wěn)定性考察時間要足夠長，如測定三七總皂苷進樣一針約需1.5小時，若溶液穩(wěn)定性考察8小時，則配制的樣品第7針數(shù)據(jù)即為無效數(shù)據(jù)。l有些樣品，如

46、在4小時內(nèi)峰面積發(fā)生較大變化，則樣品需在避光或低溫下測定（需考察）；若在避光或低溫下8小時至少4小時穩(wěn)定，則需在擬定的標(biāo)準(zhǔn)項下注明條件；若在避光或低溫下4小時內(nèi)仍不穩(wěn)定，則需在擬定的標(biāo)準(zhǔn)項下注明配制后立即測定或臨用新制。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l含量測定及限度的制定含量測定及限度的制定l含量測定要求：l（l）應(yīng)首選處方中的君藥（主藥）、貴重藥、毒性藥制訂含量測定項目。如有困難時則可選處方中其他藥味的已知成份或具備能反映內(nèi)在質(zhì)量的指標(biāo)成分建立含量測定。如因成品測定干擾較大并確證干擾無法排除而難以測定的，可測定與其化學(xué)結(jié)構(gòu)母核相似，分子量

47、相近，總類成份的含量或暫將浸出物測定作為質(zhì)量控制項目，但必須具有針對性和控制質(zhì)量的意義。（2）含量測定方法可參考有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或有關(guān)文獻，也可自行研究后建立，但均應(yīng)作方法學(xué)考察試驗。（3）含量限（幅）度指標(biāo)，應(yīng)根據(jù)實測數(shù)據(jù)（臨床用樣品至少有三批、6個數(shù)據(jù)，申報生產(chǎn)用樣品至少有10批、20個數(shù)據(jù)）制訂。含量限度一般規(guī)定低限，或按照其標(biāo)示量制訂含量測定用的百分限（幅）度。毒性成分的含量必須規(guī)定幅度。（4）含量限度低于萬分之一者，應(yīng)增加另一個含量測定指標(biāo)或浸出物測定。（5）在建立化學(xué)成分的含量測定有困難時，可考慮建立生物測定等其它方法。 第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法

48、驗證方法驗證方法驗證l含量測定及限度的制定含量測定及限度的制定l限度的制定：l各批次樣品檢測數(shù)據(jù)比較接近，則取其平均值下調(diào)15%；l各批次樣品檢測數(shù)據(jù)相差較大，則取80%的數(shù)據(jù)為低限； 80%的數(shù)據(jù)為20個數(shù)據(jù)中，最后4個較低數(shù)據(jù)不要，倒數(shù)第5個數(shù)據(jù)為限度（該方法一般用于藥村或穩(wěn)定性不好的制劑。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l含量測定及限度的制定含量測定及限度的制定l另外說明：l做標(biāo)準(zhǔn)時藥材檢測及樣品含量限度的復(fù)核：l投料藥材均需留樣檢測，10批樣品需有10批藥材數(shù)據(jù)，藥材檢測后計算轉(zhuǎn)移率。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)

49、量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法驗證方法驗證l原則：l原藥材直接粉碎投料的制劑：轉(zhuǎn)移率應(yīng)大于80%；（制劑10%、檢驗10%損失）l原藥材經(jīng)一步提取的制劑：轉(zhuǎn)移率應(yīng)大于60%70%；l原藥材經(jīng)多步提取的制劑：轉(zhuǎn)移率應(yīng)大于50%60%；l如復(fù)方丹參片中丹參酮A的轉(zhuǎn)移率為22%也允許。l方法確認(rèn)適用范圍方法確認(rèn)適用范圍l適用于：物料和產(chǎn)品中不需要進行驗證的檢驗方法以及藥典方法和其他已驗證的法定標(biāo)準(zhǔn)。通過方法確認(rèn)來證明方法在本實驗室條件下的適用性。l不適用于：實驗室日常測試操作步驟不需要進行方法確認(rèn)，例如（包括但不限于）干燥失重、熾灼殘渣、各種濕法化學(xué)步驟如酸值和簡單的儀器方法如pH計，除非有特殊要求。l確認(rèn)

50、方式確認(rèn)方式l通常采用以下兩種方式：l方式一：由兩名檢驗人員分別獨立對同一批產(chǎn)品進行檢驗（如可能，使用不同的儀器），比較兩人的檢測結(jié)果來證明方法在本實驗室（人員、分析儀器、試劑等）的適用性。l方式二：根據(jù)驗證目的和評估結(jié)果選擇相關(guān)項目進行確認(rèn)，如下表：第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法確認(rèn)方法確認(rèn)l檢驗項目確認(rèn)內(nèi)容示例（僅供參考）檢驗項目確認(rèn)內(nèi)容示例（僅供參考）第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法確認(rèn)方法確認(rèn)l方法轉(zhuǎn)移是在兩個實驗室之間進行，通過比較轉(zhuǎn)出方和接受方兩實驗室的分析結(jié)果，以確認(rèn)分析方法在接受方實驗室條件下的適

51、用性。l方法轉(zhuǎn)移方案方法轉(zhuǎn)移方案l為保證方法轉(zhuǎn)移的順利實施，在雙方充分溝通的基礎(chǔ)上，確定方法轉(zhuǎn)移方案。方法轉(zhuǎn)移方案應(yīng)對以下內(nèi)容作出明確規(guī)定，并經(jīng)雙方審核、批準(zhǔn)。l方法轉(zhuǎn)移的目的；l待轉(zhuǎn)移的檢驗方法；l物料：試驗樣品（包括：批號、劑量 、產(chǎn)品號、儲存條件）和標(biāo)準(zhǔn)品（批號、儲存條件、含量及有效期等）；l試驗樣品應(yīng)為同批有代表性的樣品，標(biāo)準(zhǔn)品最好為同來源同批次。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在運輸過程中要符合其規(guī)定的儲存條件；l接受標(biāo)準(zhǔn)；l異常數(shù)據(jù)的調(diào)查；l實驗結(jié)果的評估；l雙方的職責(zé)。第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移l方法轉(zhuǎn)移的批次數(shù)（僅供參考）：方法轉(zhuǎn)移的批次數(shù)

52、（僅供參考）：l輔料、中間產(chǎn)物、包材、原料和成品（鑒別實驗和其它簡單實驗）：1批l原料和成品（除鑒別實驗和其它簡單實驗）：2批（條件允許3批）l方案的實施：方案的實施：l雙方均應(yīng)在規(guī)定的時間內(nèi)完成樣品的檢驗，以減少因檢驗雙方實驗間隔時間過長帶來的差異。l方法轉(zhuǎn)移報告：方法轉(zhuǎn)移報告：l工作完成后，應(yīng)按規(guī)定的模板出具報告，并經(jīng)雙方審核和批準(zhǔn)。報告中必須明確的寫出結(jié)果和結(jié)論，包括評價和建議。l方法驗證、方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移的文件管理內(nèi)容：略方法驗證、方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移的文件管理內(nèi)容：略第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第一部分：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證方法轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移l1 1、新的或是未做的藥品標(biāo)準(zhǔn)第

53、一次操作時的注意事項：、新的或是未做的藥品標(biāo)準(zhǔn)第一次操作時的注意事項：l先查一下方法學(xué)研究材料或文獻資料等，了解一下操作的具體細(xì)節(jié)。l經(jīng)驗：液相色譜法等度操作，先長柱后根據(jù)情況采用短柱、高效柱或?qū)ιV條件做以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整以達到系統(tǒng)適用性實驗條件；梯度操作，方法未指明則用長柱且需采用不同填料的長柱進行測試（即使第一根柱符合條件）。l有關(guān)物質(zhì)或限度檢查需注意檢測器采樣頻率的合理設(shè)置，過大會造成峰丟失現(xiàn)象或準(zhǔn)確性的問題，過小會造成基線噪聲的增大。l容量法要搞清楚原理，關(guān)鍵操作點，如與時間相關(guān)則需注意操作順序及反應(yīng)時間，特別是在生化藥方面尤其重要；要養(yǎng)成先加樣、先反應(yīng)、先檢測的習(xí)慣。l2 2、注意方法的

54、正確性：、注意方法的正確性：l不管是藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還是藥典標(biāo)準(zhǔn)都是人制定的，在方法設(shè)計時都可能有考慮不到或疏忽的地方，所以我們按標(biāo)準(zhǔn)操作時也要仔細(xì)研究標(biāo)準(zhǔn)的正確性，及早發(fā)現(xiàn)問題并對標(biāo)準(zhǔn)做以修訂、提高。l如：血塞通及三七總皂苷原標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的問題。l如：藥典中刺五加藥材標(biāo)準(zhǔn)中進樣量的問題：100%強溶劑造成色譜峰過早洗脫，導(dǎo)致峰變形；解決辦法：減少進樣量或降低溶劑強度。l舒血寧注射液銀杏內(nèi)酯含量檢測問題：溶劑與流動相極性差異太大。第二部分：第二部分：檢驗基礎(chǔ)知識l3 3、容量器具的校準(zhǔn)、使用問題：、容量器具的校準(zhǔn)、使用問題：l常用的量瓶、胖肚移液管、刻度吸管、滴定管等均需校準(zhǔn)，因為現(xiàn)市場假貨太多

55、，質(zhì)量參差不齊，有的誤差極大，即使是真貨也要做校正，以減少誤差的來源。另外標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定精密量取最好用胖肚移液管，盡量不要用刻度吸管，因為允差不一樣，胖肚移液管的允差會更小。注意量瓶及移液管的正確使用。l容量瓶的正確使用方法和步驟容量瓶的正確使用方法和步驟.doc.docl移液管的正確使用方法和步驟移液管的正確使用方法和步驟.doc.docl4 4、液相樣品針筒式濾器使用：、液相樣品針筒式濾器使用：l采用不同材質(zhì)的針筒濾器需驗證是否有較大的吸附性，如最常用的尼龍膜N66可耐受大多數(shù)有機溶劑和堿性溶液，但是對Pr具有較大的吸附性，若要濾Pr類樣品可用混合纖維素膜 (MCE) ；醋酸纖維素和再生纖維素濾

56、膜對多環(huán)芳烴具有較低的吸附性；一般來說濾膜對多環(huán)芳烴的回收率能達到80%左右就不錯了，所以在有條件的情況下我們應(yīng)當(dāng)針對不同樣品做一下回收率，以驗證濾膜是否適合該樣品；l平時使用時需棄去初濾液取續(xù)濾液進樣分析；l若吸附性較大需采用其它方法處理（如離心等）。第二部分：第二部分：檢驗基礎(chǔ)知識l5 5、對照品濃度與樣品濃度應(yīng)相匹配：、對照品濃度與樣品濃度應(yīng)相匹配：l含量測定采用單點外標(biāo)法時，對照品的濃度與供試品溶液的濃度要接近，這樣才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，因為直線方程可能不過原點，有一定的截距，另外樣品濃度可能會超出或低于線性范圍，這樣就會造成較大的誤差。l含量測定采用外標(biāo)兩點法或外標(biāo)多點校正曲線法時，

57、供試品溶液濃度要落入曲線內(nèi)，另外，若使用ELSD、CAD等這些非線性響應(yīng)的檢測器，數(shù)據(jù)需進行擬合，一定要使擬合后的供試品落入到對照品的兩點內(nèi)。l6 6、水與甲醇、乙腈、水與甲醇、乙腈、DMADMA、DMFDMF等有機溶劑混合問題：等有機溶劑混合問題：l在配制混合流動相或是供試品溶液制備定容過程中，我們會發(fā)現(xiàn)水與MeOH、ACN、DMA、DMF等有機溶劑混合會發(fā)生明顯的放熱或吸熱過程，從而導(dǎo)致體積會發(fā)生變化，原因是由于水分子氫鍵破壞或重新形成而導(dǎo)致產(chǎn)生熵變的過程。水與MeOH、DMA、DMF混合會放出大量的熱，而與ACN會吸收熱量。所以我們配制流動相或樣品時要多加注意，流動相分別量取一定體積配制

58、，配后要放冷至室溫使用；供試品溶液先加入適量有機溶劑，待冷至室溫時再定容。l如：舒血寧總黃酮醇苷含量測定。第二部分：第二部分：檢驗基礎(chǔ)知識l7 7、血注或三七總皂苷含量測定：、血注或三七總皂苷含量測定：l目標(biāo)成分洗脫出后不宜立即用100%乙腈清洗強保留組份，要用梯度的方法升到90%清洗，以避免強保留成分在高濃度乙腈中析出，造成堵塞儀器管路或破壞色譜柱。l8 8、基線漂移的理解：、基線漂移的理解：lHPLC：色譜柱未平衡好、柱溫未穩(wěn)定、流動相變化等，梯度洗脫正常；lGC：程序升溫，柱流失增加引起。l9 9、頂空法測定乙醇?xì)埩魡栴}：、頂空法測定乙醇?xì)埩魡栴}：l注意管路系統(tǒng)的吸附性，造成重復(fù)性差，需

59、經(jīng)常熱清洗。l1010、分光光度法測定血塞通總皂苷的注意事項：、分光光度法測定血塞通總皂苷的注意事項：l由于皂苷顯色反應(yīng)產(chǎn)生的顏色受溶液濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素的影l(fā)響，所以須注意反應(yīng)條件的控制。精密加入5%的香草醛-冰乙酸溶液及高氯酸溶液要迅速；保溫結(jié)束后，要快速加入5ml冰乙酸（也可加一個測一個）；測量吸收度要快，盡量在10分鐘內(nèi)結(jié)束。l該反應(yīng)液會隨時間出現(xiàn)吸收值下降的現(xiàn)象：20min下降0.25第二部分：第二部分：檢驗基礎(chǔ)知識l1111、天平稱量問題：、天平稱量問題：l簡單的操作流程及注意事項簡單的操作流程及注意事項l一、稱量前的電子天平操作1、用前關(guān)門、關(guān)閉空調(diào)；2、調(diào)整天平的水

60、平； 3、天平的放置不要放在下列位置：陽光直曬、潮濕、不平穩(wěn)的地方二、稱量時電子天平的操作1、稱量容器的選擇： （1）避免使用過大的容器稱重，以免浮力導(dǎo)致誤差； （2）避免使用塑料及磁性物質(zhì)作容器，以免靜電引力及電磁感應(yīng)導(dǎo)致誤差； （3）如藥品吸水易潮(如：NaOH)，不可用稱藥紙稱重可用小燒杯承裝；2、稱重時的注意事項 （1）采用與稱量精確度相適應(yīng)的天平。 （2）稱重時需將待測物及其承裝容器與電子天平維持在相同的溫度，不要稱量直接從烘箱或冷藏箱內(nèi)拿出的樣品 ；特別是稱量對照品：如第二天稱量，今天就把量瓶放到天平室，使量瓶的溫度與濕度條件與天平室保持一致。 第二部分：第二部分：檢驗基礎(chǔ)知識 （