DNA的分離、提取和純化技術(shù)-WL

1、DNADNA的分離、提取和純化的分離、提取和純化技術(shù)技術(shù) 營(yíng)養(yǎng)與食品營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)專業(yè)衛(wèi)生學(xué)專業(yè)王王亮亮DNADNA的理化性質(zhì)及特點(diǎn)的理化性質(zhì)及特點(diǎn)一一 物理性質(zhì)物理性質(zhì) 1 1、形態(tài)、形態(tài) DNADNA為白色纖維狀固體（通常溶于為白色纖維狀固體（通常溶于TETE緩沖液或水）。緩沖液或水）。2 2、溶解性、溶解性 溶于水溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有機(jī)溶劑；，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有機(jī)溶劑；DNADNA在水中呈粘性膠體溶液。在酸性溶液中在水中呈粘性膠體溶液。在酸性溶液中DNADNA易水解，易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 核酸既含有酸性的基團(tuán)

2、，又含有弱堿性的基團(tuán)，故可核酸既含有酸性的基團(tuán)，又含有弱堿性的基團(tuán)，故可發(fā)生發(fā)生兩性解離兩性解離。其解離狀態(tài)隨溶液的。其解離狀態(tài)隨溶液的pHpH值而改變。值而改變。3 3、兩性解離、兩性解離 利用核酸的兩性解離可以通過(guò)調(diào)節(jié)核酸溶液的等電點(diǎn)來(lái)利用核酸的兩性解離可以通過(guò)調(diào)節(jié)核酸溶液的等電點(diǎn)來(lái)沉淀核酸，也可通過(guò)電泳分離純化核酸。沉淀核酸，也可通過(guò)電泳分離純化核酸。 嘌呤和嘧啶具有共軛雙鍵，能強(qiáng)烈吸收紫外光。在紫嘌呤和嘧啶具有共軛雙鍵，能強(qiáng)烈吸收紫外光。在紫外區(qū)外區(qū)260nm260nm和和280nm280nm處有強(qiáng)的吸收峰處有強(qiáng)的吸收峰 。在。在260nm260nm紫外線下，紫外線下，1OD1OD（光

3、密度值）相當(dāng)于雙鏈（光密度值）相當(dāng)于雙鏈DNADNA濃度為濃度為5050g/mlg/ml；單鏈；單鏈DNADNA為為4040g/mlg/ml。因此可根據(jù)核酸溶液的。因此可根據(jù)核酸溶液的ODOD值，值，計(jì)算核酸樣品的計(jì)算核酸樣品的濃度或含量濃度或含量。對(duì)于純的。對(duì)于純的DNADNA，可以通過(guò)，可以通過(guò)A260/ A280A260/ A280值來(lái)判斷值來(lái)判斷其其純度純度。純的純的DNADNA：A260/ A280 =1.8A260/ A280 =1.8 二二 紫外吸收性質(zhì)紫外吸收性質(zhì) DNADNA的特點(diǎn)的特點(diǎn)（1 1）DNADNA（或（或RNARNA）是水溶性的。）是水溶性的。（2 2）嘌呤堿和嘧

4、啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系）嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系 （3 3）從核酸的分子結(jié)構(gòu)上看，核酸是兩性電離，既帶正電荷）從核酸的分子結(jié)構(gòu)上看，核酸是兩性電離，既帶正電荷， 又帶負(fù)電荷。又帶負(fù)電荷。（4 4）DNADNA在細(xì)胞中存在部位不同（細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)粒）。在細(xì)胞中存在部位不同（細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)粒）。（5 5）DNADNA空間構(gòu)象不同，電泳時(shí)遷移率不同?？臻g構(gòu)象不同，電泳時(shí)遷移率不同。 （6 6）根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，可設(shè)計(jì)引物和探針。）根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，可設(shè)計(jì)引物和探針。（7 7）DNADNA的雙螺旋的雙螺旋結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 DNADNA提取的方案提取的方案：應(yīng)根據(jù)具體生物

5、材料和待提取的核酸分：應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點(diǎn)而定。不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及子的特點(diǎn)而定。不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，基因組所含的成分不同，基因組DNADNA的提取方法也有差異。的提取方法也有差異。 在提取某種特殊組織的在提取某種特殊組織的DNADNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法的提取方法, , 以獲得可用的以獲得可用的DNADNA大分子。大分子。 DNADNA的提取方案的提取方案 DNADNA提取、純化的方法提取、純化的方法（1 1）酚抽提法）酚抽提法（2 2）甲酰胺解聚法）甲酰胺解聚法（

6、3 3）玻璃棒纏繞法）玻璃棒纏繞法（4 4）異丙醇沉淀法）異丙醇沉淀法（5 5）以及適用于小樣品量）以及適用于小樣品量DNADNA提取的試劑盒等提取的試劑盒等 大多數(shù)核酸提取與純化的方法包括了細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟。不同的方法之間主要是步驟與技術(shù)的差異，原理基本一致。最經(jīng)典的最經(jīng)典的最常用最常用 試劑盒提取DNA實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 試劑盒提取試劑盒提取DNADNA的基本原理是用細(xì)胞裂解液的基本原理是用細(xì)胞裂解液CLCL、緩沖液緩沖液FGFG和蛋白酶和蛋白酶K K，破壞、消化細(xì)胞，用異丙醇和，破壞、消化細(xì)胞，用異丙醇和乙醇沉淀乙醇沉淀DNADNA

7、，最后收獲，最后收獲DNADNA。 試劑盒提取試劑盒提取DNADNA的基本步驟的基本步驟細(xì)胞破碎、裂解細(xì)胞細(xì)胞破碎、裂解細(xì)胞核酸與其他大分子物質(zhì)分離核酸與其他大分子物質(zhì)分離核酸純化核酸純化酶處理酶處理所用器械與設(shè)備所用器械與設(shè)備1.1.磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（PBSPBS）：）：用于漂洗樣本用于漂洗樣本2.2.細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液CLCL：裂解細(xì)胞、破壞細(xì)胞裂解細(xì)胞、破壞細(xì)胞 3.3.蛋白酶蛋白酶K K與緩沖液與緩沖液FGFG：消化細(xì)胞、緩沖溶液消化細(xì)胞、緩沖溶液pHpH值、抑制值、抑制DNADNA聚聚 合酶活性、破壞降解合酶活性、破壞降解RNARNA4.4.異丙醇：異丙醇：沉淀沉淀DNA

8、DNA5.70%5.70%乙醇：乙醇：漂洗漂洗DNADNA6.6.緩沖液緩沖液TETE：溶解溶解DNADNA試劑及其作用試劑及其作用樣品前處理樣品前處理(1)(1)從低溫冰箱中取出事先采集好的血樣從低溫冰箱中取出事先采集好的血樣(2)(2)將血細(xì)胞放入研磨器中研磨。將血細(xì)胞放入研磨器中研磨。(3)(3)加入加入PBSPBS緩沖液，將樣本轉(zhuǎn)移緩沖液，將樣本轉(zhuǎn)移13ml13ml離心管中，離心管中，5400rpm5400rpm， 20min20min，4 4度離心，棄上清。度離心，棄上清。(4)(4)用用1mlPBS1mlPBS將離心沉淀物轉(zhuǎn)移至將離心沉淀物轉(zhuǎn)移至1.5mlEP1.5mlEP管中，管

9、中，5400rpm5400rpm，3min3min，4 4度離心，棄上清。度離心，棄上清。（1 1）若不能馬上進(jìn)行）若不能馬上進(jìn)行DNADNA提取，可將樣本封存貯存于提取，可將樣本封存貯存于2020冰箱冰箱 中。中。（2 2）研磨均勻，沒(méi)有團(tuán)塊）研磨均勻，沒(méi)有團(tuán)塊（3 3）離心時(shí)注意配平）離心時(shí)注意配平注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) DNA DNA提取步驟提取步驟 1 1消化消化 向上述處理好的樣品溶液中，加入細(xì)胞裂解液向上述處理好的樣品溶液中，加入細(xì)胞裂解液CLCL，顛倒混勻數(shù)次（目的：細(xì)胞破裂，使蛋白、核，顛倒混勻數(shù)次（目的：細(xì)胞破裂，使蛋白、核酸釋放）。酸釋放）。12000rpm12000rpm，1m

10、in1min，棄上清。將離心管倒，棄上清。將離心管倒置在吸水紙上。置在吸水紙上。 2 2緩沖液緩沖液FGFG與蛋白酶與蛋白酶K K 向樣品中加入緩沖液向樣品中加入緩沖液FGFG與蛋白酶與蛋白酶K K的混合液，的混合液，立即渦旋混勻至溶液無(wú)團(tuán)塊，混勻非常重要，充分立即渦旋混勻至溶液無(wú)團(tuán)塊，混勻非常重要，充分的混勻有利于將蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)與蛋白酶的混勻有利于將蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)與蛋白酶K K接接觸。觸。 3 3水浴水浴 6565度水浴度水浴10min10min，其間顛倒數(shù)次。，其間顛倒數(shù)次。 4 4加入異丙醇加入異丙醇 顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀DNADNA。 12

11、000rpm12000rpm，5min5min，棄上清。倒置在吸水紙上。，棄上清。倒置在吸水紙上。 5 5加入加入70%70%乙醇，渦旋振蕩乙醇，渦旋振蕩5 5秒鐘，秒鐘，12000rpm12000rpm，2min2min， 棄上清。重復(fù)操作兩次。倒置在吸水紙上，至少棄上清。重復(fù)操作兩次。倒置在吸水紙上，至少5min5min?？諝飧稍锟諝飧稍顳NADNA沉淀直至所有的液體揮發(fā)干凈（至少沉淀直至所有的液體揮發(fā)干凈（至少5min5min）6. 6. 加入緩沖液加入緩沖液TETE，低速渦旋，低速渦旋5s5s，6565度加熱度加熱10min-1h10min-1h， 溶解溶解DNADNA，其間彈數(shù)次助溶

12、，其間彈數(shù)次助溶殘液大分子物質(zhì)混合液混合液細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液CLCL混合液離心、棄上清離心、棄上清緩沖液緩沖液FGFG與蛋白酶與蛋白酶K K沉淀生成異丙醇異丙醇DNA70%70%乙醇乙醇緩沖液緩沖液TETE 7 7. .樣品測(cè)定樣品測(cè)定 在在260nm260nm紫外線紫外線下：下： 1OD 1OD5050g/mlg/ml（雙鏈（雙鏈DNADNA） 1OD1OD4040g/mlg/ml（單鏈（單鏈DNADNA或或RNARNA） 根據(jù)根據(jù)A260/A280A260/A280比值，可判斷所提取核酸（比值，可判斷所提取核酸（DNADNA）的）的純度純度:DNA:DNA純度比較理想的比值是純度比較理想

13、的比值是1.81.8。 提取提取的的DNADNA溶液的溶液的A260/A280A260/A280比值高于比值高于1.81.8，說(shuō)明有，說(shuō)明有RNARNA的污染；低于的污染；低于1.81.8或或1.751.75，則認(rèn)為是蛋白質(zhì)或酚污染。，則認(rèn)為是蛋白質(zhì)或酚污染。 本方法的注意事項(xiàng)：本方法的注意事項(xiàng)： 1 1）緩沖液）緩沖液FGFG與蛋白酶與蛋白酶K K現(xiàn)用現(xiàn)配，加入到樣本以現(xiàn)用現(xiàn)配，加入到樣本以 后立即渦旋后立即渦旋 2 2）乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的反應(yīng)（酶切、）乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的反應(yīng)（酶切、PCRPCR等）等） 3 3）過(guò)分干燥）過(guò)分干燥DNADNA沉淀會(huì)影響沉淀會(huì)影響DNADNA的溶解的溶

14、解核酸提取的原則核酸提取的原則: :1.1.保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。2.2.排除其他分子的污染，即純度要高。排除其他分子的污染，即純度要高。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：1.1.核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；濃度的金屬離子；2.2.其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3.3.排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。核酸制備的一般原則核酸制備的一般原則注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1. 1.盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程。盡量簡(jiǎn)化操作步驟

15、，縮短提取過(guò)程。2.2.減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。3.3.減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫和高溫4.4.防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。 1. 1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)多糖、多酚類雜質(zhì)2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)制后續(xù)酶解反應(yīng)3.3.DNADNA中殘留有金屬中殘留有金屬離子離子1. 1.重新純化重新純化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)等雜質(zhì)2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓，讓酒精充分揮

16、發(fā)酒精充分揮發(fā)3.3.增加增加7070乙醇洗滌乙醇洗滌的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次）q問(wèn)題一：?jiǎn)栴}一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。原原 因因 對(duì)對(duì) 策策1. 1.材料不新鮮或反復(fù)材料不新鮮或反復(fù)凍融凍融2.2.未很好抑制內(nèi)源核未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酸酶的活性3.3.提取過(guò)程操作過(guò)于提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，劇烈，DNADNA被機(jī)械被機(jī)械打斷打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融1. 1.盡量取新鮮材料，低溫保存材盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融料避免反復(fù)凍融2.2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在液氮研磨

17、或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液解凍前加入裂解緩沖液3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的材料的DNADNA時(shí)，可增加裂解時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量液中螯合劑的含量4.4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔輕柔5.5.所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌經(jīng)高溫滅菌6.6.將將DNADNA分裝保存于緩沖液中分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融，避免反復(fù)凍融q問(wèn)題二：?jiǎn)栴}二：DNADNA降解降解原原 因因 對(duì)對(duì) 策策1. 1.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時(shí)洗滌時(shí)DNADNA丟失丟失1. 1.盡量選用新鮮（幼嫩）盡量