高三生物理綜教學(xué)案046 DNA提取蛋白質(zhì)分離PCR技術(shù)

1、第45講生物技術(shù)在其他方面的應(yīng)用考綱要求1.PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。2.蛋白質(zhì)的提取和分離。3.實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定?？键c(diǎn)一DNA的粗提取與鑒定1基本原理2操作過(guò)程 材料的選?。哼x用DNA含量相對(duì)較高的生物組織去除雜質(zhì)：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的 不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)DNA的鑒定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水中加熱5 min，溶液變成藍(lán)色易錯(cuò)警示(1)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核。可選用雞血細(xì)胞作材料。(2)實(shí)驗(yàn)中兩次使用蒸餾水，第一次的目的是使成熟的雞血細(xì)胞漲破釋放出DNA，第二次的目的

2、是稀釋NaCl溶液，使DNA從溶液中析出。1下圖表示以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定的操作程序，請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：(1)步驟一中，向雞血細(xì)胞液中加入_并攪拌，可使雞血細(xì)胞破裂。(2)步驟二中，過(guò)濾后收集含有DNA的_。(3)步驟三、四的操作原理是_；步驟四中，通過(guò)向溶液中加入_調(diào)節(jié)NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度至_mol/L時(shí)，DNA將會(huì)析出，過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì)。(4)步驟七：向步驟六過(guò)濾后的_中加入等體積的冷卻的_，靜置23 min，溶液中會(huì)出現(xiàn)_色絲狀物，這就是粗提取的DNA。(5)步驟七：DNA遇_試劑，沸水浴5 min，冷卻后，溶液呈_色。答案(1)蒸餾水(2)濾液(3)DNA

3、在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)蒸餾水0.14(4)濾液酒精白(5)二苯胺藍(lán)解析破碎紅細(xì)胞應(yīng)用蒸餾水，使之吸水漲破。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，在0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA析出?？赏ㄟ^(guò)加入蒸餾水將2 mol/L的NaCl溶液稀釋為0.14 mol/L的NaCl溶液。DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加熱呈藍(lán)色。1DNA與蛋白質(zhì)在NaCl溶液中溶解度比較2 mol/L NaCl溶液0.14 mol/L NaCl溶液溶解規(guī)律DNA溶解析出蛋白質(zhì)部分發(fā)生鹽析沉淀溶解NaCl溶液從2 mol/L

4、降低過(guò)程中，溶解度逐漸增大2DNA粗提取與鑒定中不同試劑的用途及原理比較試劑濃度用途原理(“”為實(shí)驗(yàn)的主要原理)NaCl溶液2 mol/L溶解DNADNA在NaCl溶液中的溶解度隨溶液濃度的變化而改變，溶解度在2 mol/L時(shí)最大、在0.14 mol/L時(shí)最小0.14 mol/L析出DNA2 mol/L鑒定時(shí)的溶劑酒精95%(體積分?jǐn)?shù))除去雜質(zhì)以提純DNADNA不溶于酒精，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)可以溶于酒精二苯胺鑒定劑DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)變藍(lán)色檸檬酸鈉0.03 g/mL抗凝劑除去血液中的鈣離子，防止血液凝固3DNA粗提取實(shí)驗(yàn)材料和方法的選擇(1)不同生物的組織中DNA含量不同在選取材料時(shí)，

5、應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。(2)材料不同所采用的提取方法不同植物組織：取材研磨過(guò)濾沉淀。雞血：制備雞血細(xì)胞液提取核DNA溶解細(xì)胞核內(nèi)DNA析出并濾取DNADNA再溶解提取較純凈的DNA。考點(diǎn)二PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用1PCR原理DNA熱變性原理，即：2PCR反應(yīng)過(guò)程(1)變性：當(dāng)溫度上升到90_以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。(2)復(fù)性：溫度下降到55_左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。(3)延伸：溫度上升到72 左右時(shí)，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。易錯(cuò)警示(1)DNA分子復(fù)制的人

6、工控制解開(kāi)螺旋：在80100 時(shí)，DNA雙螺旋打開(kāi)，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴?fù)螺旋：在50 左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液、DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和兩種引物。反應(yīng)場(chǎng)所：PCR儀。(2)PCR技術(shù)中的引物：含義：引物是一小段單鏈DNA或RNA分子。作用：為DNA聚合酶提供合成的3端起點(diǎn)。種類：擴(kuò)增一個(gè)DNA分子需要2種引物。數(shù)目：引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目。與DNA母鏈的關(guān)系：兩種引物分別與DNA母鏈的3端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。請(qǐng)回答下列有關(guān)PCR技術(shù)的基本

7、原理及應(yīng)用問(wèn)題：(1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔ的末端稱為5端，當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的_開(kāi)始延伸DNA鏈。(2)PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開(kāi)DNA雙鏈的問(wèn)題，但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問(wèn)題。到20世紀(jì)80年代，科學(xué)家從一種Taq細(xì)菌中分離到_，它的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了上述問(wèn)題。要將Taq細(xì)菌從其他普通的微生物中分離出來(lái)，所用的培養(yǎng)基叫_。(3)PCR的每次循環(huán)可以分為_(kāi)三步。假設(shè)在PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在5次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有_個(gè)這樣的DNA片段。(4)請(qǐng)用簡(jiǎn)圖表示出一個(gè)DNA片段PCR反應(yīng)中第二輪的

8、產(chǎn)物。(5)簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的主要應(yīng)用。_。答案(1)磷酸基團(tuán)3端(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶選擇培養(yǎng)基(3)變性、復(fù)性和延伸32(4)如圖所示(5)遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定(要求3項(xiàng)以上)解析(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已經(jīng)存在的核酸的3­羥基上，與DNA母鏈結(jié)合的引物就提供這個(gè)羥基。(2)因PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開(kāi)DNA雙鏈的問(wèn)題，所以用于催化DNA復(fù)制過(guò)程的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇培養(yǎng)基可將Taq細(xì)菌從其他普通的微生物中分離出來(lái)。(3)DNA復(fù)制時(shí)兩條鏈均作為模板，進(jìn)行半保留復(fù)制，所以復(fù)制5次后得到

9、的子代DNA分子數(shù)為2532個(gè)。(4)新合成的DNA鏈帶有引物，而最初的模板DNA的兩條鏈不帶有引物。(5)PCR技術(shù)可以對(duì)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，所以可用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等方面。1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR不同點(diǎn)解旋在DNA解旋酶作用下，邊解旋邊復(fù)制80100 高溫解旋，雙鏈完全分開(kāi)酶DNA解旋酶、DNA聚合酶Taq DNA聚合酶引物RNADNA或RNA溫度體內(nèi)溫和條件高溫相同點(diǎn)需提供DNA復(fù)制的模板四種脫氧核苷酸為原料子鏈延伸的方向都是從5端到3端2PCR的反應(yīng)過(guò)程(1)變性：當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為

10、單鏈，如下圖：(2)復(fù)性：溫度下降到50 左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖：(3)延伸：溫度上升到72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如下圖：考點(diǎn)三血紅蛋白的提取和分離1血紅蛋白的提取和分離原理及方法(1)原理：蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。(2)分離方法凝膠色譜法：也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。電泳法：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。常用的電泳法有瓊脂糖凝膠

11、電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。2血紅蛋白的提取和分離過(guò)程樣品處理：紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液純化：用凝膠色譜法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)3判斷正誤(1)利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量小的先洗脫出來(lái)()(2)在電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度，與分子本身的大小和形狀無(wú)關(guān)，而與所帶電荷的差異有關(guān)()(3)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電泳遷移率完全取決于分子的大小()易錯(cuò)警示“血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)”中的注意事項(xiàng)(1)紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過(guò)少，否則無(wú)法除去血漿蛋白；要低速、短時(shí)離心，否則會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。(2)凝膠的預(yù)處理：用沸水浴法不但節(jié)約時(shí)

12、間，而且除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。(3)色譜柱的裝填：裝填時(shí)盡量緊密，減小顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。(4)色譜柱成功的標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。3紅細(xì)胞中含有大量的血紅蛋白，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)提取和分離血紅蛋白。下列對(duì)血紅蛋白提取和分離的敘述，錯(cuò)誤的是()A血紅蛋白提取和分離一般按照樣品處理粗分離純化純度鑒定的順序進(jìn)行B純化過(guò)程中要用生理鹽水充分溶脹凝膠來(lái)配制凝膠懸浮液C粗分離中透析的目的是去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)D可經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定1常用的蛋白質(zhì)分離方法(1)凝膠色譜法蛋白質(zhì)項(xiàng)目相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)

13、量小凝膠內(nèi)部不能進(jìn)入能進(jìn)入運(yùn)動(dòng)方式垂直向下垂直向下和無(wú)規(guī)則擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)路程較短較長(zhǎng)洗脫次序先流出后流出(2)電泳法原理在一定pH下，蛋白質(zhì)分子的某些基團(tuán)解離后帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。2分離DNA、PCR技術(shù)、分離蛋白質(zhì)的比較分離DNAPCR技術(shù)分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精利用DNA熱變性原理體外擴(kuò)增DNA依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同來(lái)分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程選取材料破碎細(xì)胞釋放D

14、NA除雜DNA析出與鑒定變性復(fù)性延伸樣品處理凝膠色譜操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得較純凈的DNA獲得大量DNA相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)得以分離實(shí)驗(yàn)意義為DNA研究打下基礎(chǔ)解決了DNA研究中材料不足的問(wèn)題為蛋白質(zhì)的研究和利用提供了原材料3比較瓊脂糖凝膠電泳和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)從載體上看，利用瓊脂糖凝膠作為載體的是瓊脂糖凝膠電泳，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠作為載體的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(2)從依據(jù)上看，利用了分子帶電性質(zhì)差異和分子大小的是瓊脂糖凝膠電泳，僅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(3)從優(yōu)點(diǎn)上看，瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需處理，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了凈電荷對(duì)遷移率的影響，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。1(2012·江蘇卷，18)下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)”的敘述，正確的是()A洗滌劑能瓦解細(xì)胞膜并