微生物分析用圖的看圖說明

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1. 稀釋性曲線（Rarefaction Curve）采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構建曲線，即稀釋性曲線。當曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻很??；反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。橫軸：從某個樣品中隨機抽取的測序條數(shù)；"Label 0.03" 表示該分析是基于OTU 序列差異水平在0.03，即相似度為97% 的水平上進行運算的，客戶可以選取其他不同的相似度水平?？v軸：基于該測序條數(shù)能構建的OTU數(shù)量。曲線解讀：Ø 圖1中每條曲線代表一

2、個樣品，用不同顏色標記；Ø  隨測序深度增加，被發(fā)現(xiàn)OTU 的數(shù)量增加。當曲線趨于平緩時表示此時的測序數(shù)據(jù)量較為合理。2. Shannon-Wiener 曲線反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。橫軸：從某個樣品中隨機抽取的測序條數(shù)?？v軸：Shannon-Wiener 指數(shù)，用來估算群落多樣性的高低。Shannon 指數(shù)計算公式：其中，Sobs= 實際測量出的OTU數(shù)

3、目；ni= 含有i 條序列的OTU數(shù)目；N = 所有的序列數(shù)。曲線解讀：Ø 圖2每條曲線代表一個樣品，用不同顏色標記，末端數(shù)字為實際測序條數(shù)；Ø 起初曲線直線上升，是由于測序條數(shù)遠不足覆蓋樣品導致；Ø  數(shù)值升高直至平滑說明測序條數(shù)足以覆蓋樣品中的大部分微生物。3.Rank-Abundance 曲線用于同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均

4、勻程度越高。橫軸：OTU 相對豐度含量等級降序排列?？v軸：相對豐度比例。曲線解讀：Ø 圖3與圖4中每條曲線對應一個樣本（參考右上角圖標）；Ø 圖3與圖4中橫坐標表示的是OTU（物種）豐度排列順序，縱坐標對應的是OTU（物種）所占相對豐度比例（圖3為相對百分比例，圖4為換算后Log值），曲線趨于水平則表示樣品中各物種所占比例相似；曲線整體斜率越大則表示樣品中各物種所占比例差異較大。4. 樣本群落組成分析：多樣本柱狀圖/ 單樣本餅狀圖根據(jù)分類學分析結(jié)果，可以得知一個或多個樣品在各分類水平上的物種組成比例情況，反映樣品在不同分類學水平上的群落結(jié)構。柱狀圖（圖5

5、）橫軸：各樣品的編號?？v軸：相對豐度比例。圖標解讀：Ø 顏色對應此分類學水平下各物種名稱，不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例；Ø 可以在不同分類學水平下作圖分析。餅狀圖（圖6）在某一分類學水平上，不同菌群所占的相對豐度比例。不同顏色代表不同的物種。5. 樣品OTU 分布Venn 圖用于統(tǒng)計多個樣品中共有或獨有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)各環(huán)境樣品之間的OTU 組成相似程度。不同樣品用不同顏色標記，各個數(shù)字代表了某個樣品獨有或幾種樣品共有的OTU 數(shù)量，對應的OTU編號會以EXCEL 表的形式在結(jié)題報告中呈現(xiàn)。分析要求單

6、張分析圖，樣本分組至少兩個，最多5 個。Ø 默認設置為97% 相似度水平下以OTU 為單位進行分析作圖。6. Heatmap 圖用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。 相對豐度比例：熱圖（圖8）中每小格代表其所在樣品中某個OTU 的相對豐度。以圖8為例，紅框高亮的小格所對應的信息為：樣本（R11-1Z）中OTU（OTU128）的相對豐度比例大

7、概為0.2%。豐度比例計算公式（Bray Curtis 算法）：其中，SA,i = 表示A樣品中第i個OTU所含的序列數(shù)SB,i = 表示B樣品中第i個OTU所含的序列數(shù)樣品間聚類關系樹：進化樹表示在選用成圖數(shù)據(jù)中，樣本與樣本間序列的進化關系（差異關系）。處于同一分支內(nèi)的樣品序列進化關系相近。物種/OTU 豐度相似性樹：豐度相似性樹表示選用成圖的數(shù)據(jù)中樣品與樣品中的OTU 或序列在豐度上的相似程度。豐度最相近的會分配到同一分支上?？蛻糇远x分組：根據(jù)研究需求對菌群物種/OTU 研究樣本進行二級分組

8、6; 二級物種/OTU 分組：將下級分類學水平物種或OTU 分配到對應的上級分類學水平，以不同顏色區(qū)分；Ø 二級樣品分組：根據(jù)研究需要，對樣品進行人為的分組，以不同顏色區(qū)分。7. 主成分分析PCA (Principal Component Analysis)在多元統(tǒng)計分析中，主成分分析是一種簡化數(shù)據(jù)集的技術。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時保持數(shù)據(jù)集中對方差貢獻最大的特征，從而有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構，去除噪音和冗余，將原有的復雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構。通過分析不

9、同樣品的OTU 組成可以反映樣品間的差異和距離，PCA 運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸為能夠最大程度反映方差的兩個特征值。如樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。橫軸和縱軸：以百分數(shù)的形式體現(xiàn)主成分主要影響程度。以圖9為例，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）是造成四組樣品（紅色，藍色，黃色和綠色）的兩個最大差異特征，貢獻率分別為41.1% 和27.1%。十字交叉線：在圖9中作為0 點基線存在，起到輔助分析的作用，本身沒有意義。圖例解讀：Ø PCA 分析圖是基于每個樣品中所含有的全部OTU&

10、#160;完成的；Ø 圖9中每個點代表了一個樣本；顏色則代表不同的樣品分組；Ø 兩點之間在橫、縱坐標上的距離，代表了樣品受主成分（PC1 或 PC2）影響下的相似性距離；Ø 樣本數(shù)量越多，該分析意義越大；反之樣本數(shù)量過少，會產(chǎn)生個體差異，導致PCA分析成圖后形成較大距離的分開，建議多組樣品時，每組不少于5個，不分組時樣品不少于10個；Ø 圖10中的圓圈為聚類分析結(jié)果，圓圈內(nèi)的樣品，其相似距離比較接近。8. RDA/ CCA 分析圖基于對應分析發(fā)展的一種排序方法，將對應分析與多元回歸分析相結(jié)合，每

11、一步計算均與環(huán)境因子進行回歸，又稱多元直接梯度分析。主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關系。RDA 是基于線性模型，CCA是基于單峰模型。分析可以檢測環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關系或者兩兩之間的關系。 橫軸和縱軸：RDA 和CCA 分析，模型不同，橫縱坐標上的刻度為每個樣品或者物種在與環(huán)境因子進行回歸分析計算時產(chǎn)生的值，可以繪制于二維圖形中。圖例解讀：Ø 冗余分析可以基于所有樣品的OTU作圖，也可以基于樣品中優(yōu)勢物種作圖；Ø 箭頭射線：圖11中的箭頭分別代表不同的環(huán)境因子（即圖中的碳酸氫根離子HCO3-，醋酸根離

12、子AC-等，圖中的其它環(huán)境因子因研究不同代表的意義不同，因此不再贅述）；Ø 夾角：環(huán)境因子之間的夾角為銳角時表示兩個環(huán)境因子之間呈正相關關系，鈍角時呈負相關關系。環(huán)境因子的射線越長，說明該影響因子的影響程度越大；Ø 圖11中不同顏色的點表示不同組別的樣品或者同一組別不同時期的樣品，圖中的拉丁文代表物種名稱，可以將關注的優(yōu)勢物種也納入圖中；Ø 環(huán)境因子數(shù)量要少于樣本數(shù)量，同時在分析時，需要提供環(huán)境因子的數(shù)據(jù)，比如 pH值，測定的溫度值等。9. 單樣品/ 多樣品分類學系統(tǒng)組成樹根據(jù)NCBI 提供的已

13、有微生物物種的分類學信息數(shù)據(jù)庫，將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學系統(tǒng)關系樹中，從整個分類系統(tǒng)上全面了解樣品中所有微生物的進化關系和豐度差異。單樣品圖（圖12）：可以了解單樣品中的序列在各個分類學水平上的分布情況。圖例解讀：Ø 圖12中不同的層次反映不同的分類學水平；Ø 分支處的圓面積說明了分布在該分類學水平，且無法繼續(xù)往下級水平比對的序列數(shù)量，面積越大，說明此類序列越多；Ø 每個分支上的名詞后面的兩組數(shù)字分別表示比對到該分支上的序列數(shù)和駐留在該節(jié)點上的序列數(shù)；Ø 圖13中為某單一水平物種分布情況，并非是

14、序列分布。 多樣品圖（圖14）：比對多個樣品在不同分類學分支上序列數(shù)量差異。圖例解讀：Ø 比對不同樣品在某分支上的序列數(shù)量差異，通過帶顏色的餅狀圖呈現(xiàn)，餅狀圖的面積越大，說明在分支處的序列數(shù)量越多，不同的顏色代表不同的樣品。Ø 某顏色的扇形面積越大，說明在該分支上，其對應樣品的序列數(shù)比其他樣品多。Ø 多樣品在做該分析時，建議樣品數(shù)量控制在10個以內(nèi)，或者將重復樣本數(shù)據(jù)合并成一個樣本后，總樣品數(shù)在10個以內(nèi)。10.系統(tǒng)發(fā)生進化樹在分子進化研究中，基于系統(tǒng)發(fā)生的推斷來揭示某一分類水平上序列間堿基的差異，進而構建進化樹。 

15、;圖例解讀：Ø 圖15中體現(xiàn)的是序列進化差異情況，處在同一分支上的物種說明進化關系較近。Ø 圖15左下角的圖例為距離標尺，分支距離越長，進化關系越遠。11. (un)Weighted UniFrac PCoA/Tree 分析利用各樣品序列間的進化信息來計算樣品間距離，反映環(huán)境樣品在進化樹中是否有顯著的微生物群落差異。PCoA（principal co-ordinates analysis）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過一系列的特征值和特征向量進行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值

16、，PCoA 可以找到 距離矩陣中最主要的坐標，結(jié)果是數(shù)據(jù)矩陣的一個旋轉(zhuǎn)，它沒有改變樣品點之間的相互位置關系，只是改變了坐標系統(tǒng)。通過PCoA 可以觀察個體或群體間的差異。圖例解讀：Ø 圖16和圖17中不同顏色代表不同分組；Ø PCoA 分析建議不分組時，樣本數(shù)量不少于10 個；多組樣本時，每組樣本數(shù)量不少于5 個；Ø 對于某一功能基因，進行進化樹分析時，建議采用OTU數(shù)目控制在10,000以內(nèi)，或者由客戶指定分析優(yōu)勢OTU個數(shù)。12. NMDS 分析NMD

17、S（Nonmetric Multidimensional Scaling）常用于比對樣本組之間的差異，可以基于進化關系或數(shù)量距離矩陣。橫軸和縱軸：表示基于進化或者數(shù)量距離矩陣的數(shù)值在二維表中成圖。圖例解讀：Ø 圖18中不同的顏色代表不同的分組；Ø 建議不分組時，樣本數(shù)量不少于10個；多組樣本時，每組樣本數(shù)量不少于5個；Ø 圖18中的點代表樣本，點與點之間的距離表示差異程度。13. 含相似性樹柱狀圖根據(jù)樣品中相似程度進行排布，并繪制對應樣本樹狀圖反映樣本中群落結(jié)構。圖例解讀：Ø 圖19中

18、左側(cè)是相似度樹狀圖，樣本之間的差異越小，樣本便會處在相近的同一分支上；Ø 右側(cè)柱狀圖，展示樣本中微生物的群落結(jié)構。不同顏色代表不同物種。14.Unifrac 顯著性差異分析比較樣品間進化差異的顯著性分析。圖例解讀：Ø 圖20橫坐標為兩組樣品；Ø 縱軸坐標為unifrac 進化距離（序列差異）。15. 單因素unweighted unifrac PCA 分析在某單一因素上，進行unweighted unifrac PCA 分析。圖例解讀：Ø

19、; 圖21橫軸為不同變量（本例為不同年齡階段）下的樣本；Ø 縱坐標為主成分，圖21中顯示同一年齡階段內(nèi)和不同年齡階段間的由主成分導致的差異情況。16. 個性化分析案例展示案例描述一Community composition of root-associated fungi in a Quercus-dominated temperate forest:"codominance" of mycorrhizal and root-endophytic fungi. Ecol Evol. 2013 May; 3(5):1281-93. 樣本

20、來源樣本數(shù)量高變區(qū)測序平臺測序量（reads）植物根系/ 泥土159/38ITSRoche GS70,495 樣本來自于以日本橡木為主的溫帶森林，使用454 測序分析多個生態(tài)系統(tǒng)的真菌多樣性。樣品來源為植物根系樣本，從12 株植物中提取了159 份根系。分析結(jié)果表明，外生真菌群落和根系內(nèi)生真菌群落互相作用，維持了這種以日本橡木為主的溫帶森林的生態(tài)環(huán)境。圖例解讀：Ø 圖22構建了地下植物與真菌的相互關系網(wǎng)絡；Ø 圖22中灰色圓點表示與植物共生的微生物物種，菱形代表真菌OTU，它們之間的關系用灰色連接線表示；

21、Ø 它們之間的密集程度越高表示它們之間相互作用被觀察的次數(shù)越多；Ø 互利共生真菌OTU 用粉色菱形表示；寄生微生物OTU用橘色菱形表示；未知功能OTU用藍色菱形表示；Ø A：子囊真菌門；B：擔子菌門；G：球囊菌門；U：表示門水平未知真菌。案例描述二The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed 

22、by 16S pyrosequencing. Sci Rep. 2013;3:1413.室內(nèi)微生物群落對日常生活中人類健康起著重要作用，尤其是醫(yī)院的重癥監(jiān)護室。采用擴增焦磷酸測序研究ICU 中微生物群落可以檢測多種微生物序列，與現(xiàn)有的傳統(tǒng)標準培養(yǎng)技術相比，有極大的優(yōu)越性。傳統(tǒng)培養(yǎng)方式只能檢測總細菌多樣性的2.5。結(jié)合外部環(huán)境與物種系統(tǒng)發(fā)育譜分析發(fā)現(xiàn)，許多微生物與潛在的人類病原菌相關，當然也包含有益菌，一共7 個門76 個屬。此外，丙酸桿菌屬，假單孢菌屬和伯克霍爾德氏菌被確定為感染的重要來源。在地板，醫(yī)療器械和工作間

23、微生物組成有顯著差異，但網(wǎng)絡分析和一致性分子指紋印記分析發(fā)現(xiàn)該三個地點微生物組成也有一定的相似性。這些信息將幫助加護病房進行新的公共衛(wèi)生風險評估，幫助建立新的衛(wèi)生協(xié)議，幫助深入了解醫(yī)院獲得性感染的情況。 樣本來源樣本數(shù)量高變區(qū)測序平臺測序量（reads）重癥監(jiān)護室（ICU）中地板，醫(yī)療設備及工作間表面樣品3416S rRNARoche 454 FLX+5000/樣本圖23為豐度最高的40 種菌(OTU) 在不同采樣區(qū)域的分布情況。不同顏色代表不同樣本來源，綠色為ICU 地板，紅色為醫(yī)療設備，藍色為工作間。結(jié)點面積表示該OTU

24、 在三個采樣區(qū)域之間的相對豐度。案例描述三Skin Microbiome Imbalance in Patients with STAT1/STAT3 Defects Impairs Innate Host Defense Responses. Journal of Innate Immunity. 2013, DOI: 10.1159/.CMC和HIES均屬于罕見的原發(fā)性免疫缺陷病。本文研究了C

25、MC和HIES病人皮膚及口腔微生物與正常人群的微生物菌群差異。結(jié)果表明，相比正常人體的微生物組成（主要包括棒桿菌屬和放線菌科等），病人的所攜帶的微生物中革蘭氏陰性菌比例增加。而革蘭氏陰性菌（如不動桿菌屬）可以抑制機體對假絲酵母和金色葡萄球菌的免疫反應，結(jié)果很可能導致患者對這些菌感染的敏感性增加。本文的研究表明，此類免疫缺陷病人所攜帶的微生物菌群可以影響宿主的免疫防御系統(tǒng)，進而有可能通過基于微生物的輔助療法來治療免疫缺陷的患者。樣本來源樣本數(shù)量高變區(qū)測序平臺測序量（reads）慢性皮膚黏膜念珠菌病（CMC）、高IgE綜合癥（HIES）患者皮膚及口腔微生物6016S rRNA 

26、V4區(qū)MiSeq6389/樣 本 圖24 為免疫缺陷疾病各亞型患者皮膚和口腔微生物群落結(jié)構的協(xié)方差。（a）圖表示35個皮膚樣本的微生物多樣性的差異；（b）圖表示21個口腔樣本微生物多樣性差異。其中，綠色方塊表示健康對照組，紅色圓圈表示CMC，藍色三角形表示HIES。健康人體皮膚表面的微生物主要包括葡萄球菌和棒狀桿菌，而疾病組多為莫拉菌科。培訓文檔境微生物多樣性分析-基礎境微生物多樣性分析-高級常見問題Q1.能對哪些環(huán)境下的樣品進行分析？A 目前已經(jīng)成功運用Roche 454技術發(fā)表的文章涵蓋農(nóng)業(yè)、土壤、林業(yè)、海洋、礦井（石油等）、人體醫(yī)學等諸多領域，共計

27、近1400篇，Paper目錄可向本公司索取。其中有大量文獻發(fā)表于國際頂級雜志上，包括Science、Nature、ISME、PNAS、AEM等。 Q2. DGGE技術與Roche 454高通量測序技術在環(huán)境微生物群落多樣性研究中有什么區(qū)別？A DGGE等分子指紋圖譜技術，在其實驗結(jié)果中往往只含有數(shù)十條條帶，只能反映出樣品中的優(yōu)勢種群，也無法得到細菌種類及其絕對含量。而Roche 454高通量測序技術能同時對樣品中的優(yōu)勢種群及微量菌進行檢測，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數(shù)字化。 Q3. 在醫(yī)學領域有哪些應用？A 在人類的皮

28、膚、口腔、呼吸道、胃腸道和尿道等處存在著大量與人體健康密切相關的正常菌群。它們能夠合成并輔助機體吸收一些必需氨基酸和維生素；加工諸如植物多糖等人類飲食中一些難以消化的組分；占據(jù)人體的不同粘膜表面并產(chǎn)生天然的抗生素，抑制有害菌的著落與生長。目前，人們已經(jīng)采用傳統(tǒng)方法對人人體微生物作了許多研究，但是這種方法需要對微生物進行純培養(yǎng)，從而大大限制了我們對機體正常菌群，尤其是許多不可培養(yǎng)微生物的認識。第二代高通量測序技術能對人體菌群進行深度測序，從而精確檢測到千分之一機體微生物群落的數(shù)量和組成結(jié)構的變化，突破了傳統(tǒng)方法基于純培養(yǎng)的限制，能使我們從整體上認識微生物群落與宿主之間的相互關系及其對人體健康的影

29、響。例如，利用第二代高通量測序技術可以對處于疾病狀態(tài)下的人體微生境進行研究，比較分析正常和疾病狀態(tài)下或疾病不同進程人體微生物群落的結(jié)構和功能變化；可以對正常人群與某些疾病患者體內(nèi)的微生物群體多樣性進行比較分析，研究微生物群落變化同疾病之間的關系；通過深度測序還可以快速地發(fā)現(xiàn)和檢測常見病原及新發(fā)傳染病病原微生物。 Q4. 高通量測序是否需要做平行樣？A 隨著高通量測序的發(fā)展，提出研究過程中設置重復樣的要求，也日益被大家所接受。在高通量研究中，設置重復樣不僅僅是體現(xiàn)了科研的一種嚴謹態(tài)度，同時也體現(xiàn)了結(jié)果的真實性，避免了個體差異造成的影響。目前的發(fā)展趨勢：普通樣品（水體，土壤，處

30、理樣本內(nèi)部設置重復等）一般會要求設置重復樣；對于大面積研究水體和土壤等樣本時，可以采用多點采樣混樣研究。稀有樣本（稀有動物糞便，冰川極地冰樣，過多采樣會影響整體環(huán)境構成的樣本等）對于重復樣設置的要求相對比較寬松。 Q5. 454一塊PTP板最多可以放多少樣本？1個相同的樣本分別研究細菌，真菌，古菌是否可以放在同一塊PTP板上測序？A理論上，知道每個樣本的測序量和一個454PTP板能夠容納的測序量，便能得知可以測序的樣本量。實際上，考慮到測序質(zhì)量的因素，不可如此計算上樣量。一塊PTP能夠容納多少樣本往往應該考慮以下兩個因素：1. barcode數(shù)量：barcode是用于區(qū)分上

31、樣樣品的標簽序列，標簽的個數(shù)限制著一塊PTP能夠容納多少樣本；2. PTP板分區(qū)情況：PTP板分區(qū)越多可以增加上樣的樣品個數(shù)，但分區(qū)越多，會影響測序總量。一塊PTP板，在不分區(qū)的情況下，一般可以產(chǎn)出80萬條序列，綜合考慮barcode數(shù)量，分區(qū)情況以及單樣本的測序量，便可計算一塊PTP板容納的樣本數(shù)量。對于同一個樣本，分別研究細菌，真菌，古菌一般是可以放到同一個板里進行測序，但要考慮到不同類型PCR產(chǎn)物的長度對測序結(jié)果的影響，如果PCR產(chǎn)物長度差異較大，則不可以放入同一塊PTP板進行測序。參考文獻Ø Aleksandar D. Kostic, 

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43、mmunities associated with culex mosquito larvae and two emergent aquatic plants of bioremediation importance. PLoS ONE, 2013, 8(8): e72522. Ø Coolon JD, Jones KL, et al. Long-term nitrogen