銅尾礦復墾后土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究

1、劉愛民等：銅尾礦復墾后土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究 879銅尾礦復墾后土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究劉愛民1, 2，黃為一1*1. 南京農業(yè)大學生命科學學院微生物學系/農業(yè)部農業(yè)環(huán)境微生物工程重點開放實驗室，江蘇 南京 210095；2. 安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖 241000摘要：對安徽銅陵五公里尾礦區(qū)三葉草復墾后的土壤微生物活性和群落的功能多樣性研究表明，復墾后每克土壤微生物細菌數已達2.3×107個，并存在一定量耐Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+、Pb2+、Ni2+的菌株，但種類少，主要為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和短桿菌屬。BIOLOG測試結果顯示

2、，銅鎘重金屬離子的復合污染使土壤微生物群落豐富度降低；外源耐銅鎘微生物菌劑的添加使尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝剖面（AWCD）變化明顯，提高微生物對單一碳源底物的利用能力，增加利用不同碳底物的微生物數量，減輕了重金屬污染引起的土壤微生物群落功能多樣性的下降，為尾礦區(qū)生境加速恢復提供一條有效途徑。關鍵詞：銅尾礦；銅鎘污染；耐銅鎘菌劑；土壤微生物群落功能多樣性中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：1672-2175（2005）06-0876-04尾礦（tailings），又稱尾沙，屬于固體廢棄物的一種，它是礦石經粉碎、浮選精礦后余下的微粒狀固體粉末。在礦產開發(fā)過程中，尾礦通常被排放到低洼的地

3、方或借助山體，筑壩堆存，形成非經治理而無法使用的礦業(yè)廢棄地。日益增多的尾礦不僅占用大量土地，覆蓋原有的植被，排放的尾礦廢渣和產生的酸性礦山廢水嚴重破壞了生態(tài)系統1。土壤微生物是維持土壤生物活性的重要組分，對物質循環(huán)起重要作用，微生物的活性和群落結構的變化能敏感地反映土壤質量2,3。BIOLOG作為對功能微生物群落變化的敏感指標，廣泛應用于評價土壤微生物群落的功能多樣性4。研究表明，用BIOLOG方法測得的代謝多樣性類型與微生物群落組成相關5。安徽銅陵銅尾礦廢棄地，是一種以重金屬Cu毒害為主要特征的極端裸地，且土壤中鎘的含量較高。有關該銅尾礦區(qū)復墾后土壤微生物群落多樣性研究鮮有報道。本文主要探討

4、銅尾礦區(qū)復墾后土壤微生物對多種重金屬離子的耐受性，接種外源微生物菌劑對銅鎘污染的土壤微生物群落多樣性的影響，為加快尾礦區(qū)生境恢復提供依據。1 礦區(qū)自然狀況和研究方法1.1 礦區(qū)自然概況 安徽省銅陵地處北緯30°56¢42，東經117°43¢28，屬亞熱帶濕潤氣候，季節(jié)交替明顯，氣候溫和，雨量充沛，年均溫16.2 ，無霜期約為230天。銅陵市是我國重要的銅礦開采和冶煉基地，目前存有規(guī)模較大的尾礦庫(場)5個，占地面積達280 hm2。五公里尾礦場位于銅陵市區(qū)，停止排放時間約8 a，面積約105 hm2。1993年10月開始進行復墾試驗，現部分已復墾地段的植

5、被蓋度已達90%以上，但未復墾處仍裸露，風蝕、水蝕現象嚴重。主要復墾植物為狗牙根Cynodondactylon、白茅(Imperatacylindrica、三葉草Trifoliumpratense等，以邊緣區(qū)自然定居的植物為多。1.2 取樣及樣品處理土樣于2004年11月取自安徽銅陵五公里尾礦區(qū)三葉草復墾土，將一部分新鮮土研磨過篩，置于4 冰箱保存以供土壤微生物學指標分析；稱取其中部分土200 g接種微生物J5菌劑(實驗室分離保存的耐銅和耐鎘離子的微生物菌液)；另外稱取部分土200 g分別以20 mg/kg添加硫酸鎘和以300 mg/kg添加硫酸銅，充分混勻，平衡5 d后測定微生物的存活率（以

6、土壤細菌數計）和群落多樣性。另一部分土壤于室內自然風干、研磨、過篩，供土壤基本理化性質測定。化學試劑：3CdSO4·8H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，ZnSO4·7H2O，NiSO4·7H2O，Pb(CH3COO)2·3H2O，K2CrO4·H2O，分析純，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司。配制成金屬離子濃度為0.2 mol/L的貯備液備用。1.3 土壤微生物群落功能多樣性測試BIOLOG研究微生物的載體是96微孔板(MicroPlate)，將微生物接種到分別含有95種單一碳源和四唑染料（四氮疊茂）微孔板

7、上的孔中，當孔中一旦有微生物利用碳源，發(fā)生電子轉移，四唑染料就變?yōu)樽仙? 另外一個未加碳源的孔中加水作為對照6。根據反應孔中顏色變化的吸光值來指示微生物對95種不同碳源的利用模式差別，從而反映微生物群落的功能代謝能力差異。稱取5.00 g土，放置45 mL生理鹽水（NaCl的質量濃度為8.5 g/L）中，振蕩30 min后，靜置5 min，吸取5 mL上清液放入45 mL生理鹽水中，搖勻后加入GN板中，每個孔中加樣125 µL。25 恒溫中培養(yǎng)168 h。測定時間間隔為0、24、48、72、96、120、144、168 h。用Emax E11383 BIOLOG自動讀數裝置在590

8、nm下測定其吸光值。1.4 土壤微生物活性指標分析土壤細菌計數采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋平板法7。1.5 土壤重金屬含量及理化性質分析土壤理化性質按常規(guī)方法測定8。pH的測定方法：尾礦水=12.5，用PHS-3C精密pH計測定。1.6 數據分析表1 供試尾礦土的基本理化性質pH值w(有機質)/(g·kg-1)w(全N)/(g·kg-1)w(全P)/(g·kg-1)w(全K)/(g·kg-1)w(全銅)/(mg·kg-1)w(有效態(tài)銅)/(mg·kg-1)w(全鎘)/(mg·kg-1)w(有效態(tài)鎘)/(mg·kg-1

9、)6.185.520.34.312.62362.70130.7615.41.87土壤微生物群落BIOLOG GN微平板中多底物反應采用每孔的平均吸光值（Average well color development, AWCD）來描述9。計算表達式為：AWCD=（C-R）/95 （1）（1）式中C是所測的95個反應孔的吸光值，R是對照孔的吸光值。土壤微生物群落功能多樣性測定方法見文獻10，代謝剖面反應孔的數目代表微生物群落的豐富度（S）。本研究運用AWCD值接近0.6時的數據來比較BIOLOG板中的微生物代謝多樣性類別，這樣可以比較顏色變化率相同的情況下BIOLOG板的碳源利用情況，而不考慮接種

10、密度帶來的差異11，比較時采用168 h的數據。2 結果與分析2.1 銅陵尾礦區(qū)土壤的基本理化性質從表1供試尾礦土的基本理化性質分析結果來看，銅礦區(qū)典型污染土壤中金屬污染以銅為主，鎘次之。隨著尾礦棄置堆放時間的延長，pH逐漸降低，由于酸化程度的不斷加深，從而形成銅鎘污染及酸性廢水污染，造成極端板結、貧瘠和過高的含鹽量，N、P、K含量不足。2.2 銅尾礦區(qū)土壤微生物細菌數量分析表2 每克供試土壤細菌數量分析1) Table 2 Bacteria number of per gram soil samples tested /105細菌平板中的各種重金屬離子的濃度/(mmoL·L-1)尾

11、礦尾礦+硫酸鎘尾礦+J5菌液尾礦+硫酸鎘+J5菌液Zn2+：4158±20138±16172±42145±27Ni2+：22.5±0.52.37±0.21.09±0.23.50±0.5Cr6+：42.50±0.11.45±0.21.65±0.051.75±0.2Cu2+：2135±38109±18155±31139±23Cd2+：21.38±0.11.50±0.380±1356±21Cu2+Cd2

12、+：各20000Pb2+：4112±37125±28155±18143±23Co2+：20000不含重金屬離子的對照細菌平板230±87190±52258±17214±161）硫酸鎘的質量分數為20 mg·kg-1按前面方法處理后的各類尾礦土，取10 g土放入90 mL生理鹽水中，30 ，150 r/min下振蕩30 min，稀釋涂布法分離獲得土壤微生物，培養(yǎng)48 h后，計算細菌數量，結果見表2。由表2可知，供試尾礦土在含和不含重金屬細菌平板上的細菌數量分析結果顯示，尾礦土中本身有豐富的耐4 mmol/L

13、 Zn2+、Cr6+、Pb2+和2 mmol/L Cu2+、Cd2+、Ni2+的菌株，細菌數量較多；但從耐性平板上可見，分離出來的耐重金屬細菌種類較少，菌種單一，經形態(tài)和生理生化初步鑒定主要為芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas和短桿菌屬Brevibacterium。分離出的菌株對Ni2+和Cr6+的抗性較弱，菌落單薄。由于所添加的J5菌液具有在Zn2+和Cd2+平板上呈亮黃綠色的特點，當尾礦中添加有J5菌液時，發(fā)現這時的尾礦中的微生物在Zn2+和Cd2+平板上主要以J5菌株為主；而在沒有添加J5的尾礦土中篩選出的抗性菌株多數呈無色，表明J5在尾礦土中可定居下來并能很好

14、檢測出來，且在抗性菌中占一定的優(yōu)勢。在Cu2+平板上的抗性菌株種類相對略多，可能與長期生存的高銅環(huán)境有關。尾礦土中微生物具有較強的抗Zn2+、Cu2+、Pb2+能力，基本不耐Co2+；Cu2+和Cd2+兩者在一起對土壤微生物的毒性遠遠高于單獨離子的毒性，在此平板上幾乎不能篩選出任何土壤微生物。經抗性平板篩選出的細菌數明顯低于不含重金屬平板上篩選出的細菌數，表明重金屬離子對土壤微生物具有一定的抑制作用。尾礦中添加J5菌劑的土中分離出的抗Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+細菌數高于對照尾礦土。2.3 尾礦區(qū)土壤微生物群落功能多樣性分析2.3.1 尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝功能多樣性BIOLOG測

15、試系統已廣泛用于不同生境土壤微生物多樣性研究12，它可以從微生物功能代謝水平上來揭示微生物群落結構的多樣性及其變化，BIOLOG盤中每孔的平均吸光值（AWCD）是反映土壤微生物群落生理功能多樣性的重要指標。圖1是采用BIOLOG測試系統研究6種處理的尾礦土中微生物群落代謝功能多樣性的變化。圖1 不同處理供試土壤平均吸光值Fig. 1 Average well colour development (AWCD) in tailings soil samples tested after different treatment1:尾礦土；2:尾礦土+J5；3:尾礦土+硫酸鎘；4:尾礦土+硫酸鎘+J

16、5；5:尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘；6:尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘+J5表3 供試土壤微生物群落豐富度分析Table 3 Analysis of soil microbial community richness土壤編號微生物群落豐富度/S 尾礦土66 尾礦土+J5菌劑68 尾礦土+硫酸鎘58 尾礦土+硫酸鎘+J5菌劑71 尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘60 尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘+J5菌劑80從圖1可以看出，1號至6號各供試土壤微生物群落的AWCD值在48 h之前未表現出變化，培育至72 h時開始出現變化，96 h時出現明顯變化，其數值越來越高。24 h后光密度值上升的速率隨土壤受污染時間而增加，即表明了土

17、壤微生物對碳源的消耗速度不斷加快。在尾礦土中加有2種重金屬（硫酸銅和硫酸鎘）后再添加J5菌劑對微生物群落影響較大，能有效提高微生物對單一碳底物的利用能力，增加利用不同碳底物的微生物數量，提高土壤微生物群落的功能多樣性。在尾礦土中同時加入一定濃度的硫酸銅和硫酸鎘時，可能因尾礦土的一定吸附作用，減弱了重金屬離子對微生物的毒害作用，所以礦土中的微生物群落生理功能多樣性變化不大；而J5菌劑能夠耐一定濃度的硫酸銅和硫酸鎘，J5菌劑本身代謝產生堿性物質，添加到尾礦土中后，中和土壤酸性，改善礦土環(huán)境，增強礦土中微生物活性，即提高土壤微生物利用單一碳底物的能力。同時J5菌體具有一定吸附重金屬能力，降低菌體周圍

18、環(huán)境中重金屬離子濃度，促進礦土中微生物的活性。2.3.2 尾礦區(qū)土壤微生物群落豐富度由于BIOLOG GN盤中制備有95種不同性質的碳源，在培養(yǎng)過程中土壤的不同微生物對各自的優(yōu)先利用碳源基質具有選擇性，進而使BIOLOG GN盤中反應孔的顏色變化出現不同程度的差異，因而，BIOLOG GN盤中反應孔的顏色變化數目在一定程度上間接反映土壤微生物群落結構組成上的差異，顏色變化孔數越多則表明土壤微生物群落種類相對就越豐富，通常把顏色變化孔數作為土壤微生物群落功能多樣性的豐富度（S）。從表3可知，添加J5菌劑能夠提高尾礦區(qū)土壤微生物群落的豐富度，而外加重金屬則明顯降低尾礦區(qū)土壤微生物群落的豐富度，表明

19、在重金屬離子脅迫下，土壤微生物對碳源的優(yōu)勢利用種類和利用程度存在差異，揭示出在污染環(huán)境中土壤微生物的群落結構和功能多樣性發(fā)生了一定程度的變化，從而對能源碳的利用選擇發(fā)生了轉移。其中6號土添加硫酸銅和硫酸鎘后再加J5菌液，則顯色孔數最多（達80目），即微生物群落豐富度最大。說明J5菌劑具有防止外加重金屬后導致土壤微生物群落多樣性降低的作用，有活化土壤微生物活性和提高微生物群落豐富度的功效。細菌數量反映的是微生物群落大小，AWCD和微生物群落豐富度則是反映微生物活性及其功能多樣性，利用兩者可有效分析尾礦區(qū)土壤生態(tài)系統穩(wěn)定性和受外源因子影響的程度。要恢復一個受擾受損的土壤生態(tài)系統，建立一個高質量的健

20、康土壤生態(tài)應該具有良好的生物活性狀況和穩(wěn)定性的微生物種群組成，不僅要恢復地上部植被，還應考慮恢復地下部土壤微生物群落多樣性，可考慮適當添加外源微生物菌劑加速復合重金屬污染的尾礦區(qū)生境的恢復。3 結論銅陵尾礦區(qū)三葉草復墾后的每克土壤的微生物細菌數量已達一定數目（2.3×107個），并存在耐Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+、Pb2+、Ni2+的菌株，但這些耐重金屬細菌的種類不多，主要為芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas和短桿菌屬Brevibacterium。添加的外源耐銅鎘微生物J5菌劑可以在尾礦土中定殖，并在抗性菌中占一定的優(yōu)勢。高濃度的硫酸鎘和硫酸銅降

21、低了土壤微生物群落的豐富度，而J5菌劑的添加有效提高土壤微生物對單一碳底物的利用能力，增加利用不同碳底物的微生物數量，土壤微生物群落的AWCD值變化明顯，土壤微生物活性和群落豐富度增幅顯著，有利于加速復合重金屬污染的尾礦區(qū)生境的恢復。參考文獻：1 田勝尼, 劉登義, 王崢峰, 等. 銅尾礦對5種豆科植物根系生長的影響J. 生態(tài)環(huán)境, 2005, 14(2): 199203. TIAN S N, LIU D Y, WANG Z F, et al. Effects of copper tailings on the growth of roots of five legume species J.

22、 Ecology and Environment, 2005, 14(2): 199203.2 姚斌, 汪海珍, 徐建民, 等. 除草劑對水稻土微生物的影響J. 環(huán)境科學學報, 2004, 24(2): 349354.YAO B, WANG H Z, XU J M, et al. Effects of herbicides on soil microorganisms in a paddy soilJ. Acta Sientiae Crcumstantiae, 2004, 24(2): 349354.3 滕應, 黃昌勇, 駱永明，等. 鉛鋅銀尾礦區(qū)土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究J. 土壤

23、學報, 2004, 41(1): 113119.TENG Y, HUANG C Y, LUO Y M, et al. Microbial activities and functional diversity of community in soils polluted with Pb- Zn-Ag mine tailingsJ. Acta Pdologica Sinica, 2004, 41(1): 113119.4 ROGERS B F, TATE R L. Tempora analysis of the soil microbial community along a top seque

24、nce in Pineland soils J. Soil Biology Biochemistry, 2001, 33: 13891401. 5 HAACK S K, GARCHOW H M, KLUG J, et al. Analysis of factors affecting the accuracy, reproducibility and interpretation of microbial community carbon source utilization patternsJ. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61

25、: 14581468.6 ZAK J C, WILLIG M R, MOORHEADd D L, et al. Functional diversity of microbial communities: a quantitative approach J. Soil Biology Biochemistry, 1994, 26: 11011108.7 MCGREGOR R G, BLOWES D W, JAMBOR J L. The solid-phase control on the mobility of heavy metals at the copper cliff tailings

26、 area, Sudbury, Ontario, CanadaJ. Journal of Contaminant Hydrology, 1998, 33: 247271.8 魯如坤. 土壤農業(yè)化學分析法M. 北京: 中國農業(yè)科技出版社, 1999: 107240.LU R K. Soil Analysis of Agro-chemic Property M. Beijing: Chinese Agriculture Science and Technology Press, 1999: 107240.9 GARLAND J L, MILS A L. Classification and cha

27、racterization of heterotrophic microbial communities on basis of patterns of community-lever sole-carbon-source utilization J. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57: 23512359.10 BRONWYN D H, RAYMOND L C. Using the Gini coefficient with BIOLOG substrate utilization date to provide an alter

28、native quantitative measure for comparing bacterial soil communities J. Journal Microbiology Methods, 1997, 30: 91101.11 GARLAND J L. Analytical approaches to the characterization of sample microbial communities using patterns of potential C source utilization J. Soil Biology Biochemistry, 1996, 28:

29、 218221.12 KNIGHT B. Biomass carbon measurements and substrate utilization patterns of microbial populations from soils amended with cadmium, copper, or zinc J. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63: 3943.Microbial activities and functional diversity of communityin soils polluted with cop

30、per tailings after cultivateLIU Ai-min1, 2, HUANG Wei-yi11. Department of Microbiology, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University/Key Lab of Microbiological Engineering of Agricultural Environment, Ministry of Agriculture. Nanjing 210095, China; 2. College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, ChinaAbstract: Microbial activity and microbial community diversity were determined in polluted soils of copper main tailings which were cultivated by T