分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)分子生物學(xué)是在生物化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科，在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究發(fā)病、診斷、治療和預(yù)后的機(jī)制。其中基因工程（基因技術(shù)，基因重組）是目前分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，這些技術(shù)可以改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對(duì)象達(dá)到分析水平，是研究基因調(diào)控和表達(dá)的方法，也是分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因治療的方法。轉(zhuǎn)化（transformation）、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段?；蛑亟M的目的之一是基因克?。╣ene clone），基因克隆可理解為以一分子基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增得到的與模板分子結(jié)

2、構(gòu)完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析。 外來(lái)基因引起細(xì)胞生物性狀改變的過(guò)程叫轉(zhuǎn)化（transformation），以噬菌體把外源基因?qū)爰?xì)菌的過(guò)程叫轉(zhuǎn)染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過(guò)程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的過(guò)程叫轉(zhuǎn)位（transposition），這些游動(dòng)的基因叫轉(zhuǎn)位子。一、基因工程的常用工具（一）載體載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀

3、噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源DNA插入的位點(diǎn)；本身體積小等特征。質(zhì)粒存在于多種細(xì)菌，是染色體（核）以外的獨(dú)立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴(yán)緊型和松弛型之分。嚴(yán)緊型由DNA多聚酶復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制1-5個(gè)質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制30-50個(gè)質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過(guò)改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個(gè)基本基因，如復(fù)制起動(dòng)區(qū)（復(fù)制原點(diǎn)Ori），便于復(fù)制擴(kuò)增；抗抗生素標(biāo)記（

4、抗氨芐青霉素Apr、抗四環(huán)素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動(dòng)子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，即基因插入位點(diǎn)，又叫基因重組位點(diǎn)，基因克隆位點(diǎn)。常用噬菌體載體有單鏈?zhǔn)删wM13系統(tǒng)；雙鏈?zhǔn)删w系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細(xì)胞配合使用。以上載體各有特點(diǎn)，便于選擇，靈活應(yīng)用。（二）工具酶工具酶是基因重組技術(shù)不可缺少的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。限制性內(nèi)切酶有型和型限制性DNA內(nèi)切酶之分，型能嚴(yán)格識(shí)別核酸序列，

5、并在識(shí)別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開(kāi)DNA雙鏈。故通常所指都是型限制性DNA內(nèi)切酶。識(shí)別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱。切口分開(kāi)端和粘端，產(chǎn)生3OH和5P末端。內(nèi)切酶品種多，使用時(shí)應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一般1g DNA/2-5單位酶）等反應(yīng)條件。酶識(shí)別序列切口 Alu AGCTAG CT四核苷酸 TCGATC GA平端切口Eco R1GAATTCG AATTC六核苷酸 CTTAAGCTTAA G粘端切口連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應(yīng)需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7

6、.6。最適溫度37，30以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25，粘端連接用12左右。聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶，大腸埃希菌DNA聚合酶大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）。大腸埃希菌DNA聚合酶具有53聚合酶活性和53，35外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶被枯草桿菌酶作

7、用產(chǎn)生的一個(gè)大片段，有53聚合酶和53外切酶活性，無(wú)35外切酶活性。可用于缺口翻譯（Nick translation）法標(biāo)記核酸，也可用于DNA序列測(cè)定，修補(bǔ)DNA鏈等。核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應(yīng)的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。末端轉(zhuǎn)移酶在Mg2+存在下，選擇3OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在Co2+存在下，選擇3OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端標(biāo)記和核酸連接的互補(bǔ)多聚尾（連接器）。堿性磷酸酶去除5P，可防止二分子DNA片段5端P基團(tuán)

8、自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5端P基團(tuán)，在連接酶作用下目的基因的5端P先與載體3端OH連接，再通過(guò)復(fù)制修復(fù)另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率（圖18-1）。圖18-1經(jīng)堿性磷酸酶處理后載體DNA與目的基因DNA的連接二、目的基因常把需研究的基因稱為目的基因，需分析的基因稱靶基因，在基因克隆過(guò)程中有時(shí)兩者均稱為插入基因，有時(shí)三者含義相近。簡(jiǎn)單的原核生物目的基因可從細(xì)胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對(duì)染色體上，較難從直接法得到。簡(jiǎn)短的目的基因可在了解一級(jí)結(jié)構(gòu)或通過(guò)了解多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列基礎(chǔ)上人工合成。但多數(shù)

9、的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反轉(zhuǎn)錄DNA）得到。CDNA通過(guò)各種方式與載體連接，克隆可得到全長(zhǎng)cDNA或片段，用于探針制備、序列分析、基因表達(dá)等研究。因此以cDNA為研究材料反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對(duì)以后翻譯的影響情況，即反映某一基因（DNA）外顯子的情況。（圖18-2）圖18-2目的基因cDNA的合成三、基因庫(kù)的建立建立基因庫(kù)的目的是為了便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化?；驇?kù)是利用工具酶，通過(guò)基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化、篩選而建立，也是基因克隆的過(guò)程。實(shí)際上是利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長(zhǎng)快，繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn)，而作為一種核酸擴(kuò)增篩選的載體，把人類等高等生

10、物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便的基因庫(kù)?；驇?kù)交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。（一）基因重組基因重組方案很多，簡(jiǎn)單的可用同一種限制性內(nèi)切酶分別在載體和目的基因切出相對(duì)應(yīng)的切口，便于連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）。近年，Okayama方案為實(shí)驗(yàn)室普遍采用，該方法可得到全長(zhǎng)的cDNA。（二）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的是把有復(fù)制能力，但在細(xì)胞外無(wú)復(fù)制活性的目的基因-載體重組體裝入細(xì)胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟介紹如下：圖18-3基因重組方案之一大腸埃希菌的處理（增加細(xì)胞膜通透性

11、，便于基因進(jìn)入細(xì)胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種于Lb agar培養(yǎng)基，37培養(yǎng)一晚。挑選35個(gè)大菌落，接種于50ml LB培養(yǎng)基，37，振搖培養(yǎng)一晚后，在A550測(cè)定，要求細(xì)菌繁殖一定量（一般為細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），野生型（rec，5x107cells/ml）為0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）為0.5-0.6。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl2懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離心。棄上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2懸浮。4可保存48小時(shí)，用于轉(zhuǎn)化，稱competent cells。質(zhì)粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒，基

12、因庫(kù)等）的轉(zhuǎn)化 將competent cells（以美國(guó)BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時(shí)將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取100l菌液（DH10B）于2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1l，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取0.1-50ng質(zhì)粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。此間備好42水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42備用。將試管置于42，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮，把質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。加42SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管，37培養(yǎng)1小時(shí)。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，用200lSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。

13、接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落（因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)?；驇?kù)的建立、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增、純化的過(guò)程就是基因克隆的過(guò)程。LB培養(yǎng)基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高壓滅菌，pH7.5。SOB培養(yǎng)基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高壓滅菌。另外準(zhǔn)備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過(guò)濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。SOC培養(yǎng)基（100ml）：臨用前加入1ml過(guò)濾滅菌的2mol/

14、L葡萄糖。四、核酸的分離與純化核酸存在于多種細(xì)胞，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、動(dòng)植物細(xì)胞；多種標(biāo)本中，如血液、組織、唾液、尿液等其它來(lái)源的標(biāo)本。因此分離方法復(fù)雜而多樣。又因各種DNA、RNA的豐度差異，各種分析方法對(duì)核酸的純度與量的要求有差異，因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)采用的方法有所了解和選擇。總的說(shuō)來(lái)核酸的分離與純化是在溶解細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機(jī)溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀，收獲。溶解細(xì)胞的方法因標(biāo)本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相，而核酸保留在水相，達(dá)到分離核酸的目的。實(shí)驗(yàn)上生物標(biāo)本

15、中含量最多的就是蛋白質(zhì)。為了除去分離過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過(guò)離心回收核酸，然后用70-80乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應(yīng)。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到純的DNA，用DNA酶除去DNA而獲得RNA。目前開(kāi)發(fā)了許多商品化的核酸分離柱，可簡(jiǎn)單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量差異，有的利用需分離核酸的特點(diǎn)與其特異性結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的。（一）質(zhì)粒的分離與純化含質(zhì)粒的E. Coli cells經(jīng)LB培養(yǎng)液250ml擴(kuò)大培養(yǎng)，倒入50ml離心管，4，300

16、0rpm，離心15分鐘。棄去上清液。（棄去液丟棄前應(yīng)作消毒處理，以免污染環(huán)境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20SDs 2ml，蒸餾水30ml）上下?lián)u勻，置冰水浴5分鐘。禁用混勻器，以免DNA分子斷裂），加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下?lián)u勻，冰浴5分鐘。4，3000rpm，離心15分鐘。沉淀蛋白質(zhì)。取上清液，加無(wú)水乙醇12-24ml（上清液

17、的二倍）放室溫15分鐘后，10000rpm離心，棄上清液。加約為沉淀物體積的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨?？捎没靹蚱骰靹?，置冰浴10分鐘。4，10000rpm離心5min，棄上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA緩沖液，1/10體積的5mg/ml RNase，37，30分鐘保溫。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml異戊醇)，混勻。4，10000rpm，離心5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復(fù)一次。取上層

18、液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無(wú)水乙醇，20過(guò)夜或702小時(shí)以上。4，10000rpm，離心10分鐘，棄上清液。加80乙醇不搖動(dòng)，直接10000rpm離心，棄上清液，真空干燥。加適量（約200l）TE溶解。測(cè)定含量后備用。（二）重組質(zhì)粒中目的基因的分離與純化先取少量純化的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶切出目的基因，經(jīng)電泳分離，確認(rèn)。以200l含2mg DNA（重組質(zhì)粒）為例：取10l含100g DNA，加90l TE。按1g DNA加2-5U限制性內(nèi)切酶，1/10體積緩沖液，1-2小時(shí)保溫。緩沖液種類和酶反應(yīng)溫度因內(nèi)切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc，2倍無(wú)水乙醇，70，

19、2小時(shí)（20過(guò)夜），10000rpm，10分鐘離心，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物），電泳分離（用相應(yīng)分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)電泳），在紫外光下觀察結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，確認(rèn)目的基因和內(nèi)切酶的切割效果。電泳條件：凝膠制備：1瓊脂糖凝膠agarose(mg)X50TAE(ml)EB(溴化乙錠l) (agarose)10002.04.0 總體積（ml）    100   膠濃度（）：0.30.60.70.91.21.52.0DNA長(zhǎng)度（kb）：60-520-110

20、-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1電泳緩沖液：X50TAE(ml)EB(l)總體積(ml)     20301000    X50TAE：Trisma base 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTA pH8.0 20ml；蒸餾水至1000ml。EB：10mg/ml ethidium bromide。(EB有致癌性，操作應(yīng)小心)。經(jīng)電泳確認(rèn)后，取適量DNA（重組質(zhì)粒）同上條件切開(kāi)，用1.5低熔點(diǎn)（65熔解）瓊脂糖凝膠，電泳分離。在紫外光下，切出含目的基因區(qū)帶（凝膠），放入離心管中，提取

21、純化。從低熔點(diǎn)凝膠提取，純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無(wú)水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測(cè)定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。（三

22、）標(biāo)本DNA的分離與純化用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)調(diào)整細(xì)胞為2×107個(gè)（組織應(yīng)切碎置液氮冰凍，高速攪切成粉末后，加入緩沖液）。加1/10-1/20體積（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma 型），1/20v 10SDS，372小時(shí)。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混勻（至少7分鐘）。4，3000rpm，10分鐘。取上清液，加2ml TE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH8.0)，充分混勻。乙醇沉淀。2mlTE溶解

23、沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重復(fù)2-4步驟。測(cè)定含量。（四）樣品RNA的分離，純化含106個(gè)細(xì)胞液加等量純化溶液4mol/L胍基硫氰酸鹽，25mmol/L檸檬酸pH7.0，0.5肌氨酸（sarcosyl），0.1mol/l 2-巰基乙醇。總體積為細(xì)胞沉淀4-5倍，混勻。加0.1體積2ml/L乙酸鈉（pH4.1），1體積酚（重蒸水上封），0.2體積CIAA，混勻器劇烈混合10秒鐘。冰水浴15分鐘。10000xg4，20分鐘。離心（不用剎車）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），20，60分鐘以上。10000xg，4，20分鐘離心。棄上清液。用1.5ml離心管約加0.3ml純化溶液，重復(fù)3)步驟，離心10分鐘，棄上清液。加75乙醇