應(yīng)用ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)(ATP-TCA)

1、應(yīng)用ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)(ATP-TCA)研究大腸癌藥敏的異質(zhì)性田海梅1 李艷芬1 吳健雄2 曹冬艷1 榮維淇2 劉毅1 李茉1 王海鵬2 王小兵1 張偉1#中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤所 1 生物檢測中心 2 腹部外科，北京 100021 摘要：目的 探討用ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)（ATP-TCA）研究大腸癌藥敏的異質(zhì)性和個體化療的可行性。 方法 用ATP-TCA檢測58例大腸癌標(biāo)本對16種單藥或聯(lián)合用藥的敏感性。結(jié)果 個體之間的藥物敏感性存在著明顯的異質(zhì)性。單藥中最有效的藥物為長春瑞濱、羥基喜樹堿、氟尿嘧啶和紫杉醇。聯(lián)合用藥最有效的是氟尿嘧啶+絲裂霉素+阿糖胞苷，91

2、.6%（11/12）的標(biāo)本對其敏感，其次是氟尿嘧啶+順鉑+阿霉素, 健擇+順鉑和5-FU氟尿嘧啶+長春新堿+卡氮芥。結(jié)論 大腸癌對抗癌藥物的敏感程度存在著異質(zhì)性。ATP生物熒光腫瘤藥敏檢測技術(shù)可用于為大腸癌選擇合適的化療藥物。關(guān)鍵詞: ATP生物熒光腫瘤藥敏檢測技術(shù) 大腸癌Heterogeneity of chemosensitivity of colorectal cancer determined by an ex vivo ATP-tumor chemosensitivity assayAbstract Objective To investigate the heterogeneity

3、 of chemosensitivity in colorectal cancer using an ATP-tumor chemosensitivity assay (ATP-TCA) and the feasibility of individual chemotherapy. Methods An ATP-TCA were used to determine the effect of 16 single or combined cytotoxic drugs in surgical specimens from 58 patients with colorectal cancer ca

4、ncer. Results There were considerable differences in chemosensitivitvy between individuals.The most active single drugs in the assay was identified as Navelbine, Hydroxycamptothecin, 5-Fluorouracil and Paclitaxel. 5-Fluorouracil+Mitomycin+Aytarabine was found to be the most effective combination in,

5、 for 91.6% （11/12）specimens were sensitive to this regimen. 5-Fluorouracil+Cisplatin+Adriamycin, Gemcitabine+ Cisplatin and 5-Fluorouracil +Vincristine+Carmustine were moderately active regimens. Conclusions There was the heterogeneity of the in vitro chemosensitivity in colorectal cancer. The use o

6、f the ATP-TCA provides a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in colorectal cancer. Key words ATP-TCA; colorectal cancer    大腸癌是常見的腫瘤之一，屬化療中度敏感類腫瘤。由于發(fā)現(xiàn)時(shí)多已屬中、晚期，術(shù)后需輔助化療。每個病人對不同化療藥的敏感性不同，在化療前為病人篩選出敏感性藥物，進(jìn)行個體化治療，有助于提高化療的療效。本研究采用現(xiàn)在較為先進(jìn)的ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)（ATP-TCA），對58例新鮮大腸癌手術(shù)標(biāo)本

7、進(jìn)行藥敏檢測。1 材料與方法1.1 臨床資料    58例標(biāo)本取自本院2002年3月2004年7月就診的大腸癌病人，其中57例是手術(shù)標(biāo)本，1例是結(jié)腸癌皮下轉(zhuǎn)移的活檢標(biāo)本。均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為大腸癌，其中結(jié)腸癌21例（腺癌20例，印戒細(xì)胞癌1例），直腸癌（腺癌）37例；TNM分期為I-II期32例，III期25例，IV期1例。病人中男性33人，女性25人；年齡3081歲，中位年齡58歲。術(shù)前1人接受過放療，1人接受過介入治療，4人曾經(jīng)手術(shù)。1.2 主要儀器和試劑    熒光測定儀MPL1型（德國Berthold公司）；ATP生物熒光腫瘤藥物

8、敏感性檢測試劑盒（北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），含混合消化酶、培養(yǎng)基、紅細(xì)胞去除液、細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）、ATP提取液和熒光酶熒光素工作液。1.3體外藥敏檢測實(shí)驗(yàn)    新鮮的大腸癌標(biāo)本，在含抗生素的培養(yǎng)基中浸泡25分鐘后，剪成0.51 mm3碎塊，置于50 ml離心管中，加入10 ml含混合消化酶的培養(yǎng)基，于37消化2h。160目篩網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基洗滌2次。臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活的腫瘤細(xì)胞。    先加待測藥物于96孔培養(yǎng)板，所用藥物及100TDC（測試藥物濃度）（100TDC參考藥物在人體內(nèi)的血漿峰值濃度）見表1，

9、聯(lián)合用藥的每個藥物濃度與單藥濃度相同。每個藥物設(shè)100、50、25、12.5、6.25TDC五個濃度，每個濃度2個平行孔，并設(shè)2排（8孔）無藥孔作對照，一排為無藥對照（M0），一排為最大抑制對照（MI）。接種腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為2×104個/孔。在37，5CO2條件下培養(yǎng)5d后，按試劑盒說明書操作，測定熒光值，并計(jì)算IC50和IC90。表1 所用的化療藥物及劑量藥物100TDC（g/ml）氟尿嘧啶（5-Fu)25健擇(GEM)25甲氨碟呤(MTX)2.75阿糖胞苷(Ara-C)25絲裂霉素(MMC)0.5阿霉素(ADM)1.0表阿霉素(EPI)1.0吡柔比星(THP)0.8長春新堿(V

10、CR)0.88長春瑞濱(NVB)1.0開普拓(CPT-11)4.7依托泊苷(VP-16)20羥基喜樹堿(HCPT)0.3紫杉醇(PTX)10.0泰索帝(TXT)4.6順鉑(DDP)3.6草酸鉑(L-OHP)5.0卡鉑(CBP)25卡氮芥(BCNU)2.01.4 藥敏檢測判定標(biāo)準(zhǔn)：    參照Kurbacher等Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 1998, 9: 51-7的判定標(biāo)準(zhǔn)：高度敏感：IC90<100TDC, IC50<25，以表示;部分敏感：IC90>100TDC, IC5

11、0<25，以表示;低度敏感IC90<100TDC, IC50>25，以表示;不敏感: IC90>100TDC, IC50>25，以表示。2 結(jié)果2.1 不同大腸癌標(biāo)本對化療藥物單藥的體外敏感性    58例大腸癌標(biāo)本進(jìn)行了4至16種單藥和/或聯(lián)合用藥的藥敏檢測，其中44例僅選用了4至16種單藥，3例僅選用3至8種聯(lián)合用藥藥物，11例選用了單藥和聯(lián)合用藥（共16種）。表2顯示大腸癌標(biāo)本對16種單藥的敏感性。結(jié)果顯示，大腸癌對單藥對敏感性普遍較差，對HCPT、MMC、THP、NVB和5-FU的高度敏感率為分別為4.7、3.1、2.5，2.

12、0和1.8，而對其余10個單藥對高度敏感率為0。如將高度敏感率和部分敏感率之和定義為敏感性（下同），那么敏感性的順序?yàn)镹VB>HCPT>5-FU>PTX，分別為34.0、30.2、29.1%、25.0，其余12種單藥的敏感性均低于20；CBP的活性最差，所有29例大腸癌標(biāo)本無一對其高度敏感或部分敏感，僅5例（17.2）標(biāo)本對其顯示低度敏感。進(jìn)行了單藥藥敏檢測的55例標(biāo)本中，有8例（14.5）無敏感藥物，17例（30.9）有1個敏感藥物，16例（29.1）有2個敏感藥物，10例（18.2）有3個敏感藥物，3例（5.5）有4個敏感藥物，1例（1.8）有6個敏感藥物。表2大腸癌標(biāo)本

13、對單藥的敏感譜藥物高度敏感部分敏感低度敏感不敏感(5-FU)1.8 (1/55)27.3 (15/55)36.4 (20/55)32.8 (19/55)(GEM)015.2 (5/33)12.1 (4/33)72.7 (24/33)(MMC)3.0 (1/33)15.2 (5/33)27.3 (9/33)54.5 (18/33)ADM08.8 (3/34)17.6 (6/34)73.5 (25/34)EPI010.0 (4/40)15.0 (6/40)75.0 (30/40)THP2.5 (1/40)10.0 (4/40)27.5 (11/40)60.0 (24/40)VCR03.0 (1/3

14、3)9.1 (3/33)87.9 (29/33)NVB2.0 (1/50)32.0 (16/50)18.0 (9/50)48.0 (24/50)CPT-11015.6 (5/32)15.6 (5/32)68.8 (22/32)VP16011.4 (4/35)28.6 (10/35)60.0 (21/35)HCPT4.7 (2/43)25.6 (11/43)27.9 (12/43)41.9 (18/43)PTX025.0 (11/44)43.2 (19/44)31.8 (14/44)TXT03.4 (1/29)37.9 (11/29)58.6 (17/29)DDP2.2 (1/45)4.4 (2

15、/45)6.7 (3/45)86.7 (39/45) L-OHP05.6 (2/36)16.7 (6/36)77.8 (28/36)CBP0017.2 (5/29)82.8 (24/29)2.2 不同大腸癌標(biāo)本對化療藥物聯(lián)合用藥的體外敏感性    表3顯示的是8組二藥或三藥的聯(lián)合用藥結(jié)果。大腸癌標(biāo)本對PTX+CBP的敏感性為21.4，并不高于PTX單藥（25.0）；同樣，5-FU+DDP組的敏感性為23.1，5-FU+MTX+ADM組的敏感性為25.0，聯(lián)合用藥并不高于5-FU單藥29.1。VP16+CBP組的敏感性為16.6，略高于VP16單藥（11.4）。結(jié)果

16、表明PTX與CBP、5-FU與DDP、VP16與CBP之間，5-FU與MTX、ADM無協(xié)同作用，提示PTX+CBP，5-FU+DDP和VP16+CBP三組聯(lián)合用藥可能并無優(yōu)勢。另外二組含5-FU的聯(lián)合用藥5-FU+VCR+BCNU和 5-FU+DDP+ ADM的敏感性分別是40.0和53.9，優(yōu)于5-FU單藥29.1。5-FU+MMC+Ara-C組的敏感性最高，為91.6，明顯高于5-FU和MMC的單藥敏感率之和47.3，提示5-FU+MMC+Ara-C聯(lián)合用藥可能優(yōu)于5-FU或MMC單藥。表3大腸癌標(biāo)本對聯(lián)合用藥的敏感譜聯(lián)合藥物高度敏感部分敏感低度敏感不敏感PTX+CBP021.4 (3/1

17、4)50.0 (7/14)28.6 (4/14)GEM+DDP045.5 (5/11)9.1 (1/11)45.5 (5/11)VP16+CBP8.3 (1/12)8.3 (1/12)25.0 (3/12)58.3 (7/12)5-FU+DDP7.7 (/13)15.4 (2/13)61.5 (8/13)15.4 (2/13)5-FU+MMC+Ara-C58.3 (7/12)33.3 (4/12)8.3 (1/12)05-FU+MTX+ADM025.0 (3/12)50.0 (6/12)25.0 (3/12)5-FU+DDP+ADM7.7 (1/13)46.2 (6/13)30.8 (4/13

18、)15.4 (2/13)5-FU+VCR+BCNU10.0 (1/10)30.0 (3/10)40.0 (4/10)20.0 (2/10)    本研究有11例大腸癌標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了5-FU、ADM、5-FU+DDP和5-FU+DDP+ADM的藥敏檢測，結(jié)果見表4。大腸癌標(biāo)本對5-FU+DDP+ADM的敏感程度與對5-FU或5-FU+DDP的敏感程度基本相符，僅有3例（例810）ADM的加入使敏感程度提高。這表明5-FU+DDP+ ADM的抗癌活性主要來自5-FU或5-FU+DDP，ADM的作用較小。表4 11例大腸癌標(biāo)本對5-FU、ADM、5-FU+DDP和5-F

19、U+DDP+ ADM的敏感譜病例5-FU5-FU+DDPADM5-FU+DDP+ADM1-2-3+-+4+-+5+-+6+-+7+-+8+-+9+-+10-+-+11+-+   本研究有9例大腸癌標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了5-FU、MMC和5-FU+MMC+Ara-C的藥敏檢測，結(jié)果見表5。所有9例大腸癌標(biāo)本對5-FU+ MMC+Ara-C敏感程度均高于5-FU和MMC單藥。表5 9例大腸癌標(biāo)本對5-FU、MMC和5-FU+ MMC+Ara-C的敏感譜病例5-FUMMC5-FU+MMC+Ara-C1-+2+3+-+4-+5+-+6+-+7+8-+9+    

20、; 圖1、2所示的單藥和聯(lián)合用藥的抑制作用結(jié)果來自同一標(biāo)本。如圖1所示，抑制作用高低依次是5-FU+DDP+ADM、5-FU+DDP、5-FU和ADM，但4條曲線較為接近。圖2中5-FU+ MMC+Ara-C的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MMC和5-FU。3 討論    ATP生物熒光法是一個測定胞內(nèi)ATP含量的技術(shù)。因?yàn)榧?xì)胞死亡后，胞內(nèi)的ATP被迅速水解。所以，所測得的胞內(nèi)ATP含量可以反映出存活細(xì)胞量。因此，ATP生物熒光法常被用于抗腫瘤藥物的體外藥敏檢測。本研究用這項(xiàng)技術(shù)對58例新鮮大腸癌手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行藥敏檢測。    藥敏結(jié)果顯示，在進(jìn)行了

21、單藥藥敏檢測的55例大腸癌標(biāo)本中，有8例（14.5）無敏感藥物，17例（30.9）有1個敏感藥物，16例（29.1）有2個敏感藥物，10例（18.2）有3個敏感藥物，3例（5.5）有4個敏感藥物，1例（1.8）有6個敏感藥物。結(jié)果表明，來自不同個體的大腸癌標(biāo)本對化療藥物的敏感程度有明顯的異質(zhì)性，該技術(shù)能敏感地反應(yīng)出細(xì)胞對藥物作用異質(zhì)性的存在。    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸癌對單藥對敏感性普遍較差，對HCPT、MMC、THP、NVB和5-FU的高度敏感率為分別為4.7、3.1、2.5，2.0和1.8，而對其余10個單藥對高度敏感率為0。這個結(jié)果與大腸癌屬化療低度敏感的臨

22、床觀察相符合。    目前大腸癌化療方案以5-FU為主。本研究的5-FU單藥敏感性為29.1%，與臨床報(bào)道的單藥有效率21基本相符4。羥基喜樹堿對大腸癌也有一定療效，臨床報(bào)道單藥有效率為520，我們的體外藥敏為30.2，與之基本符合。另外NVB和PTX可能也有一定的療效。    5-FU+DDP+ADM是臨床治療大腸癌的常用化療方案。本研究的結(jié)果顯示，5-FU+DDP+ ADM聯(lián)合化療的敏感率明顯高于5-FU單藥（53.9 vs 29.1）。5-FU+DDP+ADM的敏感程度基本與5-FU+DDP或5-FU的敏感程度一致，提示ADM對聯(lián)合方案的有效率的貢獻(xiàn)可能很小。    Ara-C與5-FU同屬于抗代謝藥物，一般常用于惡性血液病的治療，在消化道腫瘤治療上也有應(yīng)用。我們的體外藥敏結(jié)果顯示，5-FU+MMC+Ara-C的抗癌活性最高，58.3的標(biāo)本對其強(qiáng)敏感，33.3的標(biāo)本對其中度敏感，總敏感率高達(dá)91.6。提示5-FU+MMC+Ara-C聯(lián)合用藥在臨床上可能有較好的療效。    另外，我們的藥敏結(jié)果還顯示，PTX+CBP、5-F