土壤微生物多樣性研究中總DNA提取技術(shù)進(jìn)展

1、土壤微生物多樣性研究中總DNA提取技術(shù)進(jìn)展摘要：綜述了在土壤微生物多樣性研究中總dna提取技術(shù)的研究進(jìn)展，分析了dna提取過程中的主要影響因素及存在的問題。關(guān)鍵詞：土壤微生物；多樣性；dna；提取技術(shù)中圖分類號：s154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a 文章編號：0439-8114（2012）23-5253-06advances of total dna extraction technology for soil microbial diversity researchxiao bin，jiang dai-hua，liu li-long，liu quan-dong（college of agronomy

2、，guangxi university，nanning 530005，china）abstract： the influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of dna extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. applying appropriate methods to extract microorganism dna fragment that have righ

3、t purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.key words： soil microorganism； diversity； dna； extraction method土壤微生物多樣性是生物多樣性研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，是指其在遺傳、種類、結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能

4、方面的變化，對指示土壤微生物群落的穩(wěn)定性，在保持土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面具有重要意義1，是當(dāng)今國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)問題之一。長期以來，由于研究方法的限制，傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)技術(shù)僅能獲得土壤中微生物總種群數(shù)的1%左右，而絕大部分微生物目前還不能獲得純培養(yǎng)2，未能獲得純培養(yǎng)的微生物才是土壤微生物的主體，因此，有關(guān)微生物多樣性研究進(jìn)展不大。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落總dna的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能以及動(dòng)態(tài)監(jiān)測研究3。因此作為微生物群落分子分析方法的基礎(chǔ)，最重要的一步就是從土壤樣品

5、中盡量毫無偏差地提取出高質(zhì)量的、具有代表性的微生物總基因組dna。關(guān)于土壤微生物dna提取方法的報(bào)道很多4，5，然而這些方法主要側(cè)重于土壤中的細(xì)菌群落，很少關(guān)注土壤中真菌群落總基因組dna的提取方法及其提取效果。另外，細(xì)胞裂解不完全、dna分子吸附在樣品基質(zhì)顆粒的表面、從樣品中同時(shí)提取了某些重要酶的活性抑制劑、dna分子的損耗、降解和破壞等因素也影響著土壤微生物dna提取的質(zhì)量，因而提取土壤微生物總dna在研究中尤為重要6。本文主要對dna提取過程中的主要影響因素、現(xiàn)行各方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及存在的問題作一綜述。1 基于dna方法的土壤微生物多樣性研究現(xiàn)狀傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法主要依賴于純培養(yǎng)技術(shù)和顯

6、微鏡技術(shù)，對土壤微生物多樣性的描述與研究存在一定的局限性。20世紀(jì)中后期，隨著土壤微生物多樣性研究向多方面發(fā)展，人們嘗試著利用分析微生物細(xì)胞中某種指示成分，如磷脂脂肪酸（plfa）來研究土壤微生物的種群組成，但是這些方法的缺陷是無法保證細(xì)胞中某種指示成分在土壤中的穩(wěn)定性，并且如果某種微生物的plfa是未知的，則該不可培養(yǎng)微生物仍難以鑒別7，8。1980年，torsvik等9首次建立了從土壤樣品中直接提取細(xì)菌dna的方法，并于1990年將其成功應(yīng)用于dna雜交技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)1 g土壤中有4 000個(gè)以上不同的細(xì)菌種類，說明土壤中微生物多樣性是極其豐富的。后來研究者發(fā)現(xiàn)16s rdna在原核微生物

7、中普遍存在，并且含有相對保守和可變區(qū)域，在不同的個(gè)體間16s rdna基因序列也不會(huì)進(jìn)行基因交換，因此，每一種生物都有自己的獨(dú)特序列。1986年，pace3第一次以16s rdna為基礎(chǔ)確定環(huán)境樣品中的微生物，使人們對大量不可培養(yǎng)微生物群體有了全新的認(rèn)識(shí)。此后，基于16s rdna基因的指紋圖譜分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)得到迅速發(fā)展，包括限制性片段長度多態(tài)性分析（rflp）、隨機(jī)擴(kuò)增dna多態(tài)性分析（rapd）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（sscp）、基因芯片（microarray）、pcr-dgge/tgge 等，為全面揭示土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性提供了重要手段。其總的技術(shù)路線：分離微生物基因組

8、dna，用特異性引物擴(kuò)增16s rrna基因片段，再將該pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行更深一步分析，從而可在種、屬的水平上研究不同生境中的微生物種群結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化10。2 土壤微生物總dna的提取從土壤樣品中提取dna的方法大致可分為2類，即間接提取法和直接提取法。間接提取法首先是對土壤樣品進(jìn)行反復(fù)懸浮和離心，去除土壤等雜質(zhì)，提取土壤微生物細(xì)胞，再采用酶裂解細(xì)胞提取微生物總dna。直接裂解法是不去除土壤等雜質(zhì)，而是通過物理的、化學(xué)的、酶解等手段相結(jié)合，直接裂解土壤中的微生物細(xì)胞，使其釋放dna，再進(jìn)行提取和純化。但不論采用何種方法，都存在一定的缺陷，要想提取較完整的dna需要具備以下幾個(gè)條件： 土壤微生

9、物能從土壤中充分釋放，尤其是那些緊緊吸附在土壤顆粒，甚至深藏于土壤微穴中的細(xì)菌等相對比較難分離的微生物。對一些比較頑固的微生物，如革蘭氏陽性菌、孢子和小細(xì)菌的裂解，需要更劇烈的處理，而這又會(huì)造成對裂解敏感的細(xì)菌dna折斷。采集土壤樣品后應(yīng)盡快提取dna，因?yàn)橥寥涝? 儲(chǔ)藏幾周就會(huì)造成大分子dna的降解。2.1 間接提取土壤微生物總dnatorsvik等11最先報(bào)道了從土壤中提取微生物dna的間接法，包括以下4個(gè)步驟：分散土壤；土壤微生物的提?。ǚ蛛x細(xì)胞與土壤）；土壤微生物的純化；細(xì)胞裂解及dna純化。2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般與土壤顆粒結(jié)合，包藏在土壤團(tuán)聚體內(nèi)，因此，最大限度地分散土

10、壤是從土壤中分離提取微生物的關(guān)鍵。通常采用物理或化學(xué)法，或是二者相結(jié)合以達(dá)到微生物與土粒分離的目的。常用的物理分散技術(shù)是使用玻璃珠與土壤懸液一起振蕩，或是使用韋林氏攪拌器（勻漿器、轉(zhuǎn)子混合器）攪拌分散，或是使用超聲波分散土壤團(tuán)聚體等。而化學(xué)分散法是通過加入化學(xué)分散劑以達(dá)到促進(jìn)微生物與土粒分離的目的。最常用的分散劑為0.2%焦磷酸鈉，其他還有winogradsky鹽溶液、tris緩沖液、生理鹽水、六偏磷酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、純水等26。值得注意的是，為有效地分散土壤，分散劑的種類、濃度、加入量、機(jī)械作用（振蕩、攪拌和超聲波等）的方式、時(shí)間以及容器的大小等均應(yīng)加以考慮。還可以將化學(xué)試劑與機(jī)械方

11、法結(jié)合來懸浮土壤顆粒。研究發(fā)現(xiàn)chelex100就是一種有效的土壤顆粒懸浮劑。各種分散方法分散效果不同，采用何種分散方法效果最佳目前尚無一致結(jié)論，而且防止細(xì)胞因物理、化學(xué)作用導(dǎo)致破裂提前釋放dna很重要，處理不當(dāng)會(huì)使dna降解。常用分離提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用離心分離法，既要使微生物與土壤顆粒分離，又要保證基本不破壞微生物細(xì)胞。由于土壤中細(xì)菌的平均密度（1.1 g/cm3）遠(yuǎn)小于土壤礦物質(zhì)的平均密度（2.6 g/cm3），因此采用離心或淘選法可使細(xì)菌與土壤顆粒得到較好的分離。hopkins等17采用密度逐級離心法分離出60%以

12、上的土壤細(xì)菌。此外，也有學(xué)者提出用過濾法，即將土壤樣品分散處理后，經(jīng)20 m或30 m微孔篩真空抽濾，其濾液中即可能含有絕大多數(shù)土壤細(xì)菌，此過程操作簡便，提取液中土壤殘留物少，易于純化。由于土壤中的真菌、放線菌主要以菌絲的形態(tài)與土壤顆粒纏繞在一起以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性，從土壤樣品中分離提取真菌放線菌要比提取單細(xì)胞的細(xì)菌相對困難。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)分離提取真菌的研究文獻(xiàn)極少，且這些報(bào)道方法所提取的真菌菌絲只占真菌總生物量的極少部分。vilarino等21在前人研究的基礎(chǔ)上提出了分離土壤真菌的原理：新鮮土壤經(jīng)分散后，土壤懸浮液中的菌絲可附著在慢速轉(zhuǎn)動(dòng)的銅絲（直徑150 m）框上，洗脫后即得提取的

13、土壤真菌。潘力等22以曲霉菌為例，采用微波處理菌絲并置于10× te buffer中即可得到dna，建立了一種快速提取絲狀真菌dna的實(shí)驗(yàn)方法，為高通量快速篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化子奠定了基礎(chǔ)。吳敏娜等23以傳統(tǒng)土壤總dna提取方法及純菌dna提取方法為基礎(chǔ)，分別與蝸牛酶、纖維素酶進(jìn)行組合、優(yōu)化，得到7種不同的土壤真菌基因組dna提取方法。分離提取土壤細(xì)菌和真菌的流程如圖1所示。2.1.3 土壤微生物的純化 目前常用兩相分離技術(shù)對上述土壤微生物提取液進(jìn)行純化。兩相分離技術(shù)最早為德國化學(xué)家albertsson于20世紀(jì)50年代所建立，當(dāng)時(shí)主要用于生物大分子的分離。近些年該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)

14、、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)域，是一種分離、純化生物大分子、細(xì)胞、病毒的方法，該技術(shù)也逐步發(fā)展成為一種溫和的生物分離方法，相對于原始的純化手段具有過程簡單、純化時(shí)間較短等特點(diǎn)，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛24。關(guān)于其分離機(jī)制目前尚不完全清楚，有人認(rèn)為其分離的原理主要取決于不同組分的親水性差異，也有人認(rèn)為還與不同組分的電荷性質(zhì)差異有關(guān)。當(dāng)兩種互不相溶的聚合物以一定濃度溶于水中時(shí)，便可形成體積不同的兩相，被分離組分由于其與兩相的親和力不同，分別進(jìn)入不同相從而達(dá)到分離的目的。目前應(yīng)用最為廣泛的是peg（聚乙二醇）/dextran（葡聚糖）系統(tǒng)和peg/無機(jī)鹽（磷酸鹽或硫酸鹽）系統(tǒng)。對于不同的兩相組分，分離時(shí)間不盡相同

15、25。smith等19研究了應(yīng)用兩相分離技術(shù)從土壤中分離純化非菌絲體微生物的效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)充分混合靜置一定時(shí)間后，即可形成上下兩層體積比約為41的兩相分離系統(tǒng)，其中細(xì)菌主要富集在上層peg相，土壤殘存顆粒將進(jìn)入下層dextran相，經(jīng)4次提取純化，富集在上層peg相的細(xì)菌總量約達(dá)加入兩相分離系統(tǒng)細(xì)菌總量的60%，而上層peg相中的土壤礦質(zhì)顆粒總量僅占總加入量的4%以下。李妍等26用2%peg+6%dextran兩相分離技術(shù)（a2pp）純化細(xì)菌，測定細(xì)菌生物量，研究兩相分離技術(shù)在土壤微生物研究領(lǐng)域的可應(yīng)用性，結(jié)果表明采用0.1%膽酸鈉、鈉型離子交換樹脂、玻璃珠與土壤一起在4 下振蕩2 h，能較好地

16、分散、純化土壤細(xì)菌。研究表明，兩相分離技術(shù)同樣有可能用于分離純化土壤真菌。2.2 直接提取土壤微生物總dna現(xiàn)今的土壤細(xì)菌dna直接提取法是在ogram等27建立的方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要包括兩個(gè)步驟：原位細(xì)胞裂解；dna提取和純化。2.2.1 原位細(xì)胞裂解 直接裂解土壤微生物細(xì)胞的方法包括：機(jī)械破碎法、化學(xué)法、酶解法及3種手段相結(jié)合。機(jī)械破碎法常用的有凍融法、微波、超聲波法和玻璃微珠震蕩法；化學(xué)法常用表面活性劑sds和sarkosyi、熱酚、高鹽、異硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶k、鏈霉蛋白酶等。其中溶菌酶不僅可處理革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，還可水解糖苷鍵和腐殖酸。2種或多種方法相結(jié)

17、合對dna的提取效果較好。王嘯波等28采用pbs緩沖液洗滌土壤樣品，結(jié)合sds裂解微生物細(xì)胞的方法，同時(shí)提取2種土壤樣品的微生物dna和rna，結(jié)果表明該法提取的核酸不需要進(jìn)一步處理，其純度就可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)，從而避免了由于純化導(dǎo)致的核酸量的降低。熊開容等29采用凍融+玻璃珠+溶菌酶+sds方法提取了活性污泥中微生物dna，結(jié)果表明獲得的dna適合于酶解和pcr擴(kuò)增要求。值得關(guān)注的是，土壤中微生物種類繁多，生理狀態(tài)不同，革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌以及細(xì)菌與真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成亦不相同。為了使提取的dna具有代表性，就必須保證土壤樣品中所有微生物細(xì)胞裂解釋放出核酸，因此必須根據(jù)試驗(yàn)的性質(zhì)

18、、要求選擇適當(dāng)裂解方法。研究表明，基于sds的高鹽提取法會(huì)對一些革蘭氏陽性細(xì)菌效果不好。張瑞福等30采用凍融+溶菌酶+sds方法提取3種芽孢桿菌（g+）dna，結(jié)果表明經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌均提取到了dna，未經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌未提取到dna，且凍融處理未對dna造成大的剪切，提取的dna片段還大于23.1 kb。張穎慧等31使用優(yōu)化的ctab法提取真菌基因組dna。使用液氮凍融以及玻璃珠振蕩的方法代替了傳統(tǒng)的液氮研磨，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法所需菌體量少，且得到的基因組dna比用傳統(tǒng)的ctab法得到的基因組dna產(chǎn)率高、純度好且步驟簡單，適用于一次微量提取多個(gè)樣品的基因組dna，可用于大部

19、分分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)如pcr和dna的酶切等。2.2.2 dna提取和純化 在已報(bào)道的dna提取和純化方法中，通常采用飽和酚或氯仿和蛋白酶處理，去除dna樣品中的蛋白質(zhì)和部分rna，然后對dna進(jìn)行抽提，再用乙醇、異丙醇或聚乙二醇（peg）沉淀后，經(jīng)羥基磷灰石柱或氯化銫密度梯度超速離心等進(jìn)一步純化。其他純化方法有聚乙烯吡咯烷酮（pvpp）法、色譜法、電泳法、透析和過濾法、試劑盒法等。lamontagne等32研究結(jié)果表明pvp能夠與腐殖酸結(jié)合，起到有效去除提取的dna中腐殖酸雜質(zhì)、提高dna純度的作用。李靖宇等33采用氯化鈣-sds-酶法對濕地土壤微生物dna進(jìn)行提取，結(jié)果表明該方法能高效去除

20、濕地土壤腐殖酸，純度較高，能直接滿足pcr擴(kuò)增。李鈞敏等34用含pvpp的緩沖液預(yù)洗dna樣品，然后添加cacl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用peg8000沉淀dna，可提高dna質(zhì)量，并證實(shí)這是一種簡便有效可直接應(yīng)用于pcr分析的土壤微生物總dna的提取方法。蔡劉體等35采用 sds-ctab法提取煙草病圃土壤微生物總dna，該方法既可達(dá)到裂解效果，還有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取dna 的質(zhì)量。吳紅萍等36采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除劑對粗提取的土壤微生物dna進(jìn)行純化后，可用于pcr擴(kuò)增，并以細(xì)菌16s rdna基因引物可擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。朱立成等37采用直接法提取土壤微生物總

21、dna，然后用sephadex g-200凝膠離心層析法純化，可得到純度較高的dna。段學(xué)軍等38采用稀釋模板及巢式pcr法很好地解決了在dna提取純化過程中不能完全去除腐殖質(zhì)的問題。滕應(yīng)等39將bio101 systems公司研制的fastprep多試管核酸提取系統(tǒng)與相應(yīng)的fast dna spinkit for soil試劑盒聯(lián)用，有效地提取了重金屬復(fù)合污染的農(nóng)田土壤微生物總dna。沒有哪種單一的純化步驟可以除去所有污染物，故許多研究者已經(jīng)將幾種純化步驟結(jié)合起來以期獲得最好的純化效果。smalla等40將粗提的dna進(jìn)行3步純化：氯化銫密度梯度超速離心純化；醋酸鉀沉淀；geneclean純

22、化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)前2步純化的dna通過稀釋即可部分被限制性酶切和擴(kuò)增，但如不經(jīng)稀釋而進(jìn)行限制酶切和擴(kuò)增，則必需進(jìn)行最后一步純化。2.2.3 直接法和間接法的比較 研究表明，直接法獲得的dna較多，但不易去除抑制劑，間接法提取的dna只占直接法的1/10，但分離的dna純度較高，而且間接法得到的細(xì)菌量只占總菌群的25%50%，直接法提得的dna卻可以超過細(xì)菌總dna的60%。因此，要想獲得大量dna，選擇直接法較好，當(dāng)所需dna量不大，而且要排除真核或胞外dna污染時(shí)，可用間接提取法。直接提取對某些特定樣品用特定的操作方法能獲得較高的提取效率，但是對有些生物量不高的樣品則很難得到足夠的環(huán)境總dna用于

23、后續(xù)操作，適合在樣品生物量較大但采樣量不大的情況下采用。間接提取在提取效率上遠(yuǎn)小于直接提取，但用間接提取法所得到的環(huán)境總dna純度較高，所有樣品能直接用于pcr擴(kuò)增，并且能更好地體現(xiàn)樣品中微生物的多樣性，適用于有大量樣品的情況。2.3 dna的純度和濃度測定dna在260 nm處有吸收峰，腐殖酸在230 nm處有吸收峰，計(jì)算od230/od260（腐殖酸/dna）的比值可以確定所提dna中腐殖酸的污染程度。一般情況下od230/od260比值應(yīng)在0.40.5之間為好， od230/od260比值越高，腐殖酸污染越嚴(yán)重。蛋白質(zhì)在280 nm處有吸收峰，因此od260/od280比值經(jīng)常被用來指示

24、dna中蛋白質(zhì)的污染程度，當(dāng)od260/od280比值為1.82.2時(shí)，dna較純，當(dāng)受蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)污染時(shí)，od260/od280值則較低41。此外，還可采用pcr擴(kuò)增檢測dna的純化質(zhì)量，所用擴(kuò)增引物見文獻(xiàn)42。提取的dna濃度也可根據(jù)測定的od260值計(jì)算，根據(jù)公式dsdna=50×od260×稀釋倍數(shù)，計(jì)算dna的濃度（g/ml），換算出每克干土提取dna的量43；還可采用dyna quant 200熒光儀對純化后dna的濃度進(jìn)行測定28。3 影響土壤微生物總dna提取的因子土壤成分復(fù)雜，含有大量的有機(jī)及無機(jī)等多種生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚類化合物、重金屬等，

25、它們的存在可能影響土壤dna的提取質(zhì)量，抑制dna聚合酶的活性從而影響土壤微生物多樣性的分析。研究發(fā)現(xiàn)，腐殖酸是土壤dna提取過程中極難去除的污染物，由于它的分子大小和理化性質(zhì)與dna相似，過分注重腐殖酸的去除，勢必會(huì)造成dna的大量損失，因此腐殖酸的有效去除是土壤dna提取的難點(diǎn)所在。各種土壤類型、質(zhì)地和成分的差異，都會(huì)影響土壤微生物dna的提取效果。zhou等44用sds-ctab法從8種土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量為5%31%不等）中提取dna，平均獲得dna的量為0.526.9 g/g，并發(fā)現(xiàn)獲得的dna量與土壤的有機(jī)磷含量有明顯的正相關(guān)關(guān)系。另外，研究也發(fā)現(xiàn)，土壤中細(xì)

26、菌的裂解效率與其中黏粒的含量呈明顯的負(fù)相關(guān)。土壤中各粒級顆粒對細(xì)菌的吸附量從大到小的順序?yàn)椋吼ち！⒎哿?、?xì)沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.74.9倍、細(xì)沙粒的44.389.2倍、粗沙粒的262.0799.0倍，細(xì)菌在粒徑不同的土壤顆粒表面的最大與最小吸附量分別相差389.0和857.0倍，去有機(jī)質(zhì)土壤顆粒對細(xì)菌吸附親和力較含有機(jī)質(zhì)土壤顆粒的大45。因此，不同的土壤適合于不同的dna提取方法，在土壤dna提取過程中，應(yīng)針對土壤類別選取合適的提取方法，以便進(jìn)行后續(xù)研究。4 小結(jié)從土壤微生物群體基因組的角度研究其多樣性及功能是可行的方法，并受到廣泛的關(guān)注46。因而越過分離培養(yǎng)的步驟，直接從土壤中獲

27、得總dna以分析土壤微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)，關(guān)鍵是如何盡可能全面地提取土壤中微生物的總dna。土壤本身成分復(fù)雜，有許多物質(zhì)難以預(yù)料，對提取較好質(zhì)量的dna提出了很高的要求。因此建立一種簡單有效的提取方法顯得非常重要。間接法提取的微生物dna純度較高，提取的種類和數(shù)量較少；直接提取法直接在土壤中裂解細(xì)胞，使其中內(nèi)含物盡可能地釋放，能夠代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物質(zhì)種類較復(fù)雜，所以提取的dna質(zhì)量受到很大的影響，需要進(jìn)一步純化，而這些處理往往造成部分dna的喪失，可能使在土壤中本身存在量較少的種類喪失或檢測不到，影響到土壤微生物多樣性的分析。最近，milko等47發(fā)現(xiàn)一種taq dna聚合酶基因

28、突變型可增加對腐殖酸等pcr抑制物的抗性，不需要對基因組dna進(jìn)行純化就可以進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)分析，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。絕大多數(shù)直接提取法提取的dna片段長度不會(huì)超過23 kb，而dna的某些用途如宏基因組文庫構(gòu)建，需要大片段的dna，直接提取法對此幾乎無能為力。在dna提取產(chǎn)率高即表示其所代表的微生物多樣性高的前提下，dna直接提取法被認(rèn)為是較好的方法并被廣泛應(yīng)用48。但近年來有研究表明dna提取的產(chǎn)率高不等同于微生物的多樣性高，間接提取法又再次被提出并用于相關(guān)研究49。這就要求在選擇提取方法時(shí)不僅要試用直接提取和間接提取這兩類方法，而且在每類方法中也要試用不同的處理組合方式，以使后續(xù)

29、操作能順利進(jìn)行，并得到準(zhǔn)確可信的研究結(jié)果。評價(jià)一種土壤微生物dna提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段無降解且比較完整外，還需要能夠有效去除土壤中大量存在的影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚類化合物、重金屬離子等；能在單位樣本量中比較徹底地提取出微生物dna；提取方法應(yīng)具有普適性，對土壤中大多數(shù)微生物能夠有效等50，且提取的dna能更好地代表土壤微生物的真實(shí)性和異質(zhì)性。5 展望目前，國內(nèi)外對土壤微生物總dna提取方法的報(bào)道很多，但每一種方法都存在一定的缺陷。因此，從土壤樣品中提取dna還沒有通用的最佳方案，需要根據(jù)具體的土壤特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。在提取過程中還要兼顧實(shí)驗(yàn)

30、操作是否簡便，方法是否經(jīng)濟(jì)以及樣品量是否充足。另外，將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)微生物研究方法結(jié)合起來，才能更全面地認(rèn)識(shí)和理解土壤微生物群落多樣性及其相應(yīng)的生態(tài)功能。參考文獻(xiàn)：1 肖艾和，張洪霞，譚周進(jìn)，等.土壤微生物多樣性研究的dgge/tgge技術(shù)進(jìn)展j.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2009（4）：721-727.2 amann r i， lcdwigw， schleifer k h. phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivationj. microbiolog

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