分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)_LSW

1、實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的小量制備（堿裂解法）一、 實(shí)驗(yàn)原理 所有分離質(zhì)粒DNA的方法都含有以下3個(gè)步驟：細(xì)菌培養(yǎng)物的生長；細(xì)菌的收獲和裂解；質(zhì)粒DNA的提取與純化。 本實(shí)驗(yàn)以堿性SDS快速法小量制備pUC質(zhì)粒。堿裂解法對(duì)于以前應(yīng)用的所有的大腸桿菌均卓有成效。該方法的特點(diǎn)是，加溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞（小量制備可省略不用溶菌酶），去污劑SDS可使細(xì)胞壁裂解，并使蛋白質(zhì)變性，在堿性條件下，破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而彼此不分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)（加入酸性試劑中和），質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。細(xì)菌染色體DNA纏繞附

2、著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀下來而質(zhì)粒DNA則留在上清液中，乙醇沉淀后可得到質(zhì)粒DNA。如需進(jìn)一步純化，可應(yīng)用聚乙二醇沉淀法或氯化銫溴化乙錠梯度平衡法。 環(huán)狀雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)行結(jié)構(gòu)時(shí)，稱之為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋SC構(gòu)型；如果兩條多核苷酸中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí)，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型；若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分子（L DNA），通稱L構(gòu)型。質(zhì)粒DNA Mr一般在106107之間，常以kb表示

3、（l kb雙鏈DNA=6.6×105）,如質(zhì)粒pUC19的Mr為1.8×106 (2.69 kb)。在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管Mr相同，仍具有不同的電泳遷移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次為L DNA和ocDNA。二、 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1. 用品與儀器可調(diào)微量取樣器（20 l、l 000 l），Tip頭，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃儀器，恒溫空氣搖床，臺(tái)式高速微量離心機(jī)，旋渦振蕩器。含pUC19質(zhì)粒DNA的大腸桿菌。2. 試劑LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用

4、10mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌(6.895×104Pa) 15min，貯存于4。溶液：0.2 mol/L NaOH，1SDS（臨用時(shí)配制）。溶液：pH4.8乙酸鉀溶液（60ml 5mol/L KAC，11.5ml冰醋酸，28.5ml H2O）。所配成的溶液鉀離子濃度為3 mol/L，醋酸根離子濃度為5 mol/L。滅菌。V（酚）：V（氯仿）=11：酚需在180重蒸，加入抗氧化劑8羥基喹啉，終濃度為0.1，并用Tris

5、83;HCl緩沖液平衡至pH7.6。氯仿中加入異戊醇V（氯仿）V（異戊醇）=241。1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA；20g/ml RNaseA。無水乙醇，70乙醇，氨芐青霉素貯存液50 mg/ml。三、 實(shí)驗(yàn)操作程序1 細(xì)菌的生長與收獲（1）將35 ml含氨芐青霉素（50 g/ml）的LB加入到容量為15 ml、通氣良好的長玻璃試管中，接入一單菌落，于37振蕩（350 r/min）培養(yǎng)過夜。（2）取1.5 ml細(xì)菌培養(yǎng)物加入Eppendorf管中，以5 000 r/min離心2 min去掉上清液，使細(xì)菌沉淀

6、盡可能干燥。2 堿裂解法（1） 將細(xì)菌沉淀重懸于100 l預(yù)冷的溶液中，充分分散混懸細(xì)菌。（2） 加入200 l新配制的溶液，蓋緊管口，快速顛倒數(shù)次，充分混合，要確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液接觸，冰浴放置5min。（3） 加入150 l預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，冰浴放置5min。（4） 在4以10 000 r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)Eppendorf管中。（5） 向上溶液加入等體積/酚/氯仿，振蕩混勻，以5 000r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移上層水相至新的Eppendorf管中。（6） 向水溶液加入2倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置5

7、min，以10 000 r/min離心5min，傾去乙醇液，將離心管倒置于吸水紙上，吸干液體。（7） 加入1 ml 70乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，按步驟（6）所述方法棄上清，于空氣中或用電吹冷風(fēng)使質(zhì)粒DNA沉淀干燥。（8） 用2030 l含RNaseA酶（20 g/ml）的TE溶解沉淀，4貯存。3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA通過瓊脂糖凝膠電泳方法可鑒定。通常情況下經(jīng)堿裂解法制備的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)可見23條帶。四、 討論 1細(xì)胞的裂解作用是分離質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵步驟。通常是加入溶菌酶或SDS來促使大腸桿菌細(xì)胞裂解的。如果寄主細(xì)胞沒有完全裂解，就會(huì)顯著降低質(zhì)粒DNA的回收率。理想的狀況是使每

8、一個(gè)細(xì)胞都充分破裂到能使質(zhì)粒DNA順利溢出，而又沒有污染過多的染色體DNA分子。2提取過程中，除規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件外，應(yīng)盡量保持低溫，避免過酸過堿，操作中手法要溫和，防止機(jī)械剪切，盡可能避免脫氧核糖核酸酶對(duì)質(zhì)粒DNA的降解和破壞。3采用酚/氯仿去除蛋白的效果較單獨(dú)使用酚或氯仿好。一般來講，要將蛋白質(zhì)盡量除干凈，需多次抽提一次，已能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。注意在吸取上層水相時(shí)勿吸入下層有機(jī)相混于其中。4 乙醇沉淀質(zhì)粒DNA是最常用的沉淀方法，通常采用冷乙醇（無水乙醇貯存于-20），沉淀?xiàng)l件為-20，1 h。因本實(shí)驗(yàn)為微量快速，室溫下數(shù)分鐘DNA即可沉淀，雖然DNA量少，但純度相對(duì)高（因?yàn)榈蜏亻L時(shí)間雜質(zhì)也一并沉

9、淀下來），有利于以后的酶切及電泳結(jié)果。沉淀方法也可用乙丙醇，只需0.54倍體積常溫下即可將DNA完全沉淀出來，這對(duì)于大體積的質(zhì)粒DNA沉淀十分有效。但缺點(diǎn)是常將鹽等亦同時(shí)沉淀出來，因此需要用70乙醇很好地洗滌。一般來講廣泛應(yīng)用的沉淀試劑還是乙醇。實(shí)驗(yàn)二 DNA的酶切一、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類：類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。類由兩種酶組成：一

10、種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoR識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5'-GAATTC-3')，有少數(shù)酶識(shí)別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如Sma: 5'-CCCGGG-3')；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端，如EcoR切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端： 5&

11、#39;GAATTC3' 5' G AATTC3' 3'CTTAAG 5' 3' CTTAA G5' DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。采用粘末端連接必須對(duì)目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同，這時(shí)可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進(jìn)行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入

12、第二種酶進(jìn)行酶切；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行，盡量避免星號(hào)活力。 二、材料、試劑和儀器 1 材料：質(zhì)粒DNA 2 試劑：限制性內(nèi)切酶、ddH2O3 儀器：微量移液槍，離心機(jī)，水浴鍋，電泳儀，紫外透射觀測儀 實(shí)驗(yàn)程序：取2只清潔、干燥、無菌的Eppendorf管，編號(hào)，按照限制性內(nèi)切酶Hind、EcoR試劑盒說明書用量，用微量注射器加入各種試劑質(zhì)粒DNA和pBR322，最后用雙蒸水補(bǔ)足至10 l，小心混勻。37水浴保溫1-2 h，然后各小管內(nèi)加入1l的酶反應(yīng)終止液，混勻，終止酶促反應(yīng)，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。操作前各試劑用量要反?fù)核對(duì)，保證準(zhǔn)確無誤，所加試劑用量很少，必須認(rèn)

13、真操作。I. 單酶切： （1）在一滅菌的1.5 ml 離心管中依次加入： 質(zhì)粒DNA 5 l ddH2O 3 l 10×buffer 1 l 限制性內(nèi)切酶 1 l總體積 10 l （2）混勻，稍離心 （3）37水浴13 hr （4）70水浴10 min，中止酶切反應(yīng) （5）電泳檢測酶切效果 II. 雙酶切： （1）在一滅菌的1.5 ml 離心管中依次加入： 質(zhì)粒DNA 5 l（約1g） ddH2O 3 l 10×buffer 1 l 限制性內(nèi)切酶1 0.5 l 限制性內(nèi)切酶2 0.5 l 總體積 10 l （2）混勻，稍離心 （3）37水浴13hr （4）70水浴10min

14、，中止酶切反應(yīng) （5）電泳檢測酶切效果 注：酶切的選擇原則一般是盡量擴(kuò)大酶切體系，這樣抑制因素得以稀釋；基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1g/10;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10，否則甘油濃度會(huì)超過5%，會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力；對(duì)難切的質(zhì)?；蚧蚪MDNA應(yīng)延長反應(yīng)時(shí)間4-5 hr，甚至過夜。滅火限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能完全滅活，這一點(diǎn)需要注意。 三、 結(jié)果與分析 假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個(gè)酶切位點(diǎn), 且酶切徹底，紫外燈下檢測電泳結(jié)果, 則單酶切應(yīng)為一條帶, 而雙酶切則為兩

15、條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環(huán)三條帶），則說明質(zhì)粒完全沒有被切開。 M1 1 2 3 4 5 6 M2 圖2-1 重組質(zhì)粒HindIII+XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析： M1: DNA/ HindIII, M2: DL2000, 1-6: 重組質(zhì)粒HindIII+XbaI. 重組質(zhì)粒用HindIII+XbaI雙酶切后釋放出插入片斷，因此空載體處于同一水平位置，而插入片斷長度分別為0.8, 2.1, 1.6, 1.2, 0.7和0.3 kb。 四、思考題 假設(shè)一種內(nèi)切酶在重組質(zhì)粒上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，如果酶切后的電泳顯

16、示有三條帶，分析可能的原因。說明DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的構(gòu)建在核酸研究和遺傳工程等方面的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)三 DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、目的要求1. 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。2. 學(xué)習(xí)利用瓊脂糖電泳方法測定DNA片段大小。3. 學(xué)習(xí)有關(guān)建立DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的基本技術(shù)。二、原 理DNA分子在堿性環(huán)境中（pH8.3緩沖液）帶負(fù)電荷，外加電場作用下，向正極泳動(dòng)。不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構(gòu)型的不同，在電泳時(shí)的泳動(dòng)速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶，電泳后經(jīng)溴乙錠染色，在波長254n m紫外光照射下，DNA顯橙紅色熒光。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA的分離作用主要依據(jù)DNA

17、的分子量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。一定大小的DNA 片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNA片段大小范圍見表1。因而要有效分離大小不同的DNA片段，主要是選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度。不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的DNA移動(dòng)速度次序如下：共價(jià)閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。在同一濃度的凝膠中，分子量較小的DNA片段比較大的片段快。DNA片段的遷移距離（遷移率）與它的大?。ǚ肿恿浚┑膶?duì)數(shù)成反比。將未知DNA的遷移距離與已知分子大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)物的電泳遷移距離進(jìn)行比較，即可計(jì)算出未知

18、DNA片段的大小。表3-1 DNA大小范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度/%可分辨的線性DNA大小范圍/kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1本實(shí)驗(yàn)采用限制性內(nèi)切酶Hind 或EcoR酶解DNA的片段為標(biāo)準(zhǔn)物，建立其酶切圖譜，同時(shí)以酶解各片段的分子量為縱坐標(biāo)，以它們對(duì)應(yīng)的遷移率為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，連接各點(diǎn)繪制出測定DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒pBR322 DNA只有一個(gè)EcoR酶切位點(diǎn)，酶解后成為一條線狀DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，測量酶解后線型DNA的遷移距離，可以直接在分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其分子大小。三、試

19、劑和器材一）、試劑1. 限制性內(nèi)切酶Hind、EcoR試劑盒 2. 標(biāo)準(zhǔn)DNA：按使用說明配制3. 標(biāo)準(zhǔn)pBR322：按使用說明配制4. 酶反應(yīng)終止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚藍(lán)）：10 l/組稱取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚藍(lán)，溶解后定容至100 ml。5. 電極緩沖液（5×TBE）：用前稀釋10倍稱取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸餾水定容至200ml。使用前用蒸餾水稀釋10倍，稱為TBE稀

20、釋緩沖液（0.5×TBE）。6. 溴乙錠（EB）染色貯存液（1mg/ml）：1滴/組將100mg溴乙錠溶于蒸餾水或電極緩沖液100 ml，棕色瓶內(nèi)封好，避光保存。EB是誘變劑，配制和使用時(shí)應(yīng)戴乳膠手套，并且不要將該溶液灑在地面或桌面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。 7. 1%瓊脂糖二）、器材Eppendorf離心管（1.5ml，預(yù)先高溫高壓滅毒，3個(gè)/組）及其離心管架，電泳槽（1個(gè)/組），電泳儀（1個(gè)/2組），凝膠塑料托盤（1個(gè)/組），錐形瓶（100 ml×1，烘干），小燒杯（50，100，250 ml），微量注射器（2 l×

21、3，15 l或20 l×1），一次性塑料手套(64只)，膠頭滴管（×3），紫外反射投射儀，防護(hù)眼鏡，洗瓶2個(gè)（分別盛重蒸水和蒸餾水），大燒杯1個(gè)，膠頭滴管2支，量筒（50 ml×1），卡尺（學(xué)生自備）四、操作方法一、1.0%瓊脂糖凝膠板的制備1. 用配套擋板將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置水平玻板或水平工作臺(tái)面上，將樣品槽模板（梳子）插進(jìn)托盤長邊上的凹槽內(nèi)（距一端約1.5 cm），梳齒底邊與托盤表面保持0.51 mm的間隙，安置好后保持靜置狀態(tài)。2. 稱取0.3克瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入30 ml TBE稀釋緩沖液，在電爐上（或微波爐中）加熱融化，輕輕搖勻，避免產(chǎn)

22、生泡沫。圖3-1 凝膠托盤的組裝1. 托盤 2. 擋板 3. 梳子3. 待瓊脂糖冷卻至放在手背不覺太燙手（約60）后，滴一滴EB，然后將瓊脂糖溶液在靠近擋板一側(cè)連續(xù)地倒入托盤內(nèi)（注意中間不要間斷），使凝膠緩慢而連續(xù)地展開直至在托盤表面形成一層約3mm厚均勻膠層（7.1×9.0cm）。膠內(nèi)不要存有氣泡，室溫下靜置約20分鐘。4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齒附近加入少量TBE稀釋液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板（注意勿使樣品槽破裂），則在膠板上形成相互隔開的樣品槽。5. 取下封邊的擋板，將凝膠連同托盤放入電泳槽平臺(tái)上，倒入大量TBE稀釋緩沖液直至浸沒過凝膠面2-3 mm，要防

23、止樣品槽內(nèi)窩存氣泡，可以用微量注射器挑除。 二、加樣用微量注射器或移液槍將經(jīng)酶切的樣品液和未經(jīng)酶切的樣品液（要加2 l的酶反應(yīng)終止液）分別加入到膠板的不同加樣槽內(nèi)，每個(gè)槽（5×2×2.5 mm）容積約為25 l，因此加樣量不要超過20 l，避免因樣品過多而溢出，污染鄰近樣品。加樣時(shí)，注射器針頭穿過緩沖液小心靠近加樣槽底部，但不要損壞凝膠槽，然后緩慢地將樣品推進(jìn)槽內(nèi)，讓其集中沉于槽底部。加完一個(gè)樣品后的微量注射器應(yīng)反復(fù)洗凈后才能用以加下一個(gè)樣品。三、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負(fù)極，另一端連接正極（千萬不要搞錯(cuò)），接通電源，開始電泳。在樣品進(jìn)膠前可用略高電壓，防止樣品擴(kuò)

24、散，樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓降不高于5V/cm。當(dāng)染料帶移動(dòng)到距離凝膠前沿約1cm時(shí)，停止電泳。四、觀察小心地取出凝膠置托盤上，將膠板推至預(yù)先浸濕并鋪在紫外燈觀察臺(tái)上的玻璃紙內(nèi)，在波長254 nm紫外燈下進(jìn)行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，可觀察到清晰的條帶。觀察時(shí)應(yīng)帶上防護(hù)眼鏡，避免紫外燈對(duì)眼睛的傷害。五、制作測定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線用卡尺量出DNA/Hind 酶解各片段的遷移距離（cm），以DNA酶解各片段分子量為縱坐標(biāo)，它們的遷移距離為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上連結(jié)各點(diǎn)劃出曲線，即為DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNA/Hind 酶解各片段大小見表3-2。表3-2 DNA/Hind 酶解片段片段堿

25、基對(duì)數(shù)目（kb）道爾頓（×106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08注意事項(xiàng):1. 溴乙錠（EB）是誘變劑，配制和使用時(shí)應(yīng)帶乳膠手套，并且不要將該溶液灑在桌面或地面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)過專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。2. DNA酶解過程中，使用的器具都應(yīng)干凈，并經(jīng)消毒。配制時(shí)急需用滅菌的雙蒸水，還要防止限制性內(nèi)切酶被污染。3. 加樣量的多少取決于加樣槽最大容積。可以采用大小不同的樣品槽模板以形成容積不同的加樣槽，加入樣品的體積應(yīng)略小于加樣

26、槽容積，為此，對(duì)于較稀的樣品液應(yīng)設(shè)法調(diào)整其濃度或加以濃縮。4. DNA/Hind酶解后應(yīng)有8條帶，但實(shí)際上只能看見6條，分子量小的2條帶由于其熒光弱，往往看不見。思考題1. 名詞解釋：DNA；限制性內(nèi)切酶；Marker2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，解釋瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段大小的根據(jù)，聚丙烯酰胺凝膠電泳能否測定DNA分子的大小，它們的區(qū)別是什么？實(shí)驗(yàn)四 PCR技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用（綜合性）利用提取的幾種不同農(nóng)作物品種DNA樣品，用310個(gè)RAPD或SSR引物進(jìn)行分子標(biāo)記分析，讓學(xué)生學(xué)會(huì)從分子水平研究不同植物擴(kuò)增DNA片段的遺傳多樣性。使學(xué)生熟悉和掌握PCR技術(shù)的原理和方法，并能夠使用、掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀

27、器的操作和使用方法。讓學(xué)生記錄擴(kuò)增樣品數(shù)量，循環(huán)次數(shù)和擴(kuò)增時(shí)間，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。（一） 植物DNA的提取與分離一、目的：學(xué)習(xí)并掌握CTAB法提取藥用植物的總DNA的原理和操作步驟。二、原理和方法 關(guān)于植物總DNA的提取方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很多，但從提取原理上看主要有二種:CTAB法及SDS法。1、 CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法：CTAB是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的。采用氯仿異戊醇抽提蛋白質(zhì)，通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能

28、溶解于乙醇。CTAB法提取DNA最初用于冷凍干燥的材料。其程序及試劑比例經(jīng)適當(dāng)改動(dòng)后也于新鮮植物組織及細(xì)胞器DNA的提取。用冷凍干燥材料提取時(shí)，使用1×CTAB。用新鮮材料提取時(shí)使用2×CTAB緩沖液。實(shí)驗(yàn)需要注意的問題是CTAB溶液在15以下會(huì)發(fā)生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低溫下離心。與SDS法相比，CTAB法的最大優(yōu)點(diǎn)是能很好地去除糖類雜質(zhì)，對(duì)于含糖較高的材料可優(yōu)先采用，該方法另一個(gè)特點(diǎn)是在提取的前期能同時(shí)得到高含量的DNA和RNA。2、SDS（十二烷基硫酸鈉）法： 其原理是利用高濃度的SDS，在較高溫度(5565)條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出

29、核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的作法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀(量常用的是加 5 mol/L的KAC于冰上保溫，在低溫條件下KAC與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物)，離心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法操作簡單，溫和，也可提取到分子量較高的DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多。三、材料、試劑和儀器1 試驗(yàn)材料：新鮮或超低溫冷凍干燥植物組織0.2g2 試劑：2×CTAB提取緩沖液：2g/100ml CTAB, 100mmol/L Tirs·Cl(pH=8.0), 50mmol/L EDTA(pH=8.0)，700 mmol/L Na

30、Cl (pH=8.0)無水乙醇，70乙醇，氯仿，異戊醇3 儀器設(shè)備：恒溫水浴鍋，冰凍離心機(jī)，移液器及配套槍頭，離心管，研缽四、步驟 1）取約0.2g黃化苗或新鮮葉在含有750 l預(yù)熱提取緩沖液的研缽中磨碎后轉(zhuǎn)至1.5ml的離心管中，65水浴1h,其間輕輕顛倒幾次；2）用等體積氯仿-異戊醇（24：1）輕輕混勻并顛倒約510min，然后18下10000r/min離心10min；3）上清液用2倍體積的預(yù)冷(-20)無水乙醇沉淀， DNA用70%乙醇洗12次后,干燥,然后用無離子水溶解后保存在-20冰箱中備用。SDS提取緩沖液組成： CTAB提取緩沖液組成：100 mmol/L Tris-HCl pH

31、 8.0 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.050 mmol/L EDTA-Na2 pH 8.0 50mmol/L EDTA-Na2 pH 8.0100 mmol/L NaCl 700 mmol/L NaCl2% SDS 1% CTAB五、結(jié)果記錄觀察DNA的顏色、形態(tài)變化。（二） DNA的定量分析一、目的 了解檢驗(yàn)DNA定量分析的方法和原理，熟悉檢驗(yàn)提取DNA的質(zhì)量，包括濃度與純度的具體步驟和操作過程。二、原理和方法1、濃度DNA樣品的濃度一般可根據(jù)其在260nm的吸收值來確定。50gml的雙鏈DNA對(duì)260nm紫外光的吸收值為1.0。 凡是濃度大于0.25 gml的純凈DN

32、A樣品均可按此關(guān)系，由其OD260值求出其濃度。測定時(shí)因比色杯最小的容積為0.5 ml，微量制備的樣品總體積不過20100l，因此應(yīng)從所制備的樣品中取出少量稀釋后進(jìn)行測定，根據(jù)稀釋樣品的吸收值及釋釋倍數(shù)計(jì)算出原樣品的DNA濃度。測定方法：取10 l DNA樣品溶液，加ddH2O至2 ml，混勻后注入5ml的石英比色杯中，以ddH2O為空白對(duì)照調(diào)零后進(jìn)行測定。DNA樣品濃度(g/l)=OD260×樣品稀釋倍數(shù)×50/10002、純度純凈的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度計(jì)測定其260nm及280nm的吸收值比應(yīng)為1.8。若OD260OD280大于1.8，表明樣品中有較多的R

33、NA，這時(shí)應(yīng)該用RNA酶重新處理樣品，若比值小于1.6，則說明樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多，這時(shí)需要用氯仿重新抽提樣品進(jìn)一步去除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)。三、材料、試劑和儀器1 實(shí)驗(yàn)材料：提取的植物總DNA 2 試劑：超純水（dd H2O）儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)，石英比色杯，燒杯，洗瓶四、步驟（1） 預(yù)熱分光光度計(jì)1020 min。（2） 取兩只1.0 ml的狹縫石英比色杯，一只裝入1.0ml ddH2O作為空白溶液，校正分光光度計(jì)零點(diǎn)和透光度至100。（3） 測定DNA的濃度與純度： 1） 取5l DNA待測樣品，加ddH2O稀釋混勻至1000 l。 2） 將兩只比色杯放置在分光光度計(jì)中，調(diào)整入射光波長分別為

34、260nm、280nm和230nm的OD值。（每次用ddH2O液調(diào)整零點(diǎn)：T100、OD0）。（4）DNA濃度與純度的計(jì)算：DNA樣品的濃度：一般可根據(jù)其在260nm的吸收值來確定，50gml的雙鏈DNA對(duì)260nm紫外光的吸收值為1.0。凡是濃度大于0.25 g/ml的純凈DNA樣品均可按此關(guān)系，由其OD260值求出其濃度。測定時(shí)因比色杯最小的容積為0.5ml，微量制備的樣品總體積不過20100l，因此應(yīng)從所制備的樣品中取出少量稀釋后進(jìn)行測定，根據(jù)稀釋樣品的吸收值及釋釋倍數(shù)計(jì)算出原樣品的DNA濃度。DNA樣品濃度(g/l)=OD260×N（樣品稀釋倍數(shù)）×50/1000D

35、NA樣品的純度：純凈的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度計(jì)測定其260nm及280nm的吸收值比應(yīng)為1.8，OD260/OD230因大于2.0。若OD260OD280值大于1.8，表明樣品中有較多的RNA，這時(shí)應(yīng)該用RNA酶重新處理樣品，若OD260OD280比值小于1.6，則說明樣品中蛋白質(zhì)或酚雜質(zhì)較多，這時(shí)需要用氯仿重新抽提樣品進(jìn)一步去除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)；OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明存在鹽和小分子雜質(zhì)的污染。五、結(jié)果 計(jì)算DNA濃度和純度。（三） RAPD或SSR標(biāo)記技術(shù)一、目的學(xué)習(xí)掌握應(yīng)用RAPD或SSR技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行DNA水平的遺傳多樣性檢測。二、原理和方法RAPD標(biāo)記技術(shù):利

36、用10堿基RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。SSR標(biāo)記技術(shù): 利用20堿基SSR特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。三、材料、試劑和儀器(一) RAPD標(biāo)記技術(shù)1. 實(shí)驗(yàn)試劑與RAPD反應(yīng)混合物體系：ddH2O 10.8 lDNA 2 l (80 ng)10×buffer 2.0 l引物 2 l (40 ng)2.5 mM dNTP 1.5 l 25mM MgCl2 1.5 lTaq酶 0.2 l (1 U) 總體積 20 l2. 實(shí)驗(yàn)儀器： PCR儀， 移液器，漩渦振蕩器，0.2 ml離心管3. 反應(yīng)程序： （1） 94 3min ;（2） 94 1min， 37 1min ，72 2min, 35個(gè)循環(huán)；（3） 72 5min；（4） 4保存（二）SSR標(biāo)記技術(shù)1. 實(shí)驗(yàn)試劑與RAPD反應(yīng)混合物體系：ddH2O 9.0 lDNA 1.6 l (80 ng)10×buffer 2 l 2.5 mM dNTP 1.6 l 上游引物 2 l (40ng)下游引物 2 l (40ng)25mM MgCl2 1.6 lTaq 酶 0.2 l (1 U)總體積 20 l2. 實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀，移液器，漩渦振蕩器，0.2ml離心管3