基因工程的工具課件

1、專題專題1 1 基因工程基因工程現(xiàn)代生物科技專題現(xiàn)代生物科技專題轉(zhuǎn)基因抗蟲棉轉(zhuǎn)基因抗蟲棉普通棉花普通棉花( (無(wú)抗蟲特性無(wú)抗蟲特性) )蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌提取提取抗蟲基因抗蟲基因棉花細(xì)胞棉花細(xì)胞( (含抗蟲基因含抗蟲基因) )棉花植株棉花植株( (有抗蟲特性有抗蟲特性) )重組重組DNADNA導(dǎo)入導(dǎo)入形成形成基因工程的別名基因工程的別名操作環(huán)境操作環(huán)境操作對(duì)象操作對(duì)象操作水平操作水平基本過(guò)程基本過(guò)程結(jié)果結(jié)果基因拼接技術(shù)或基因拼接技術(shù)或DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)生物體外生物體外基因基因DNADNA分子水平分子水平人類需要的基因產(chǎn)物人類需要的基因產(chǎn)物剪切剪切 拼接拼接 導(dǎo)入導(dǎo)入 表達(dá)表

2、達(dá)基因工程的概念基因工程的概念 準(zhǔn)確切割準(zhǔn)確切割DNADNA的工具（的工具（“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 DNADNA片段的連接工具（片段的連接工具（“分子縫合針?lè)肿涌p合針”）DNADNA連接酶連接酶 基因轉(zhuǎn)移工具（基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車”）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1.1 DNA1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具黏性末端黏性末端平末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”12345脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)3端5端3端5端 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯鍵鍵磷酸二酯

3、鍵磷酸二酯鍵8限制酶的識(shí)別序列限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列的限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是對(duì)稱，無(wú)論是6個(gè)堿基還個(gè)堿基還是是4個(gè)堿基，都可以找到個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿上的堿基是基是反向?qū)ΨQ重復(fù)反向?qū)ΨQ重復(fù)排列排列的的 ，稱為，稱為回文序列回文序列中軸線在G與A之間切割EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切開(kāi)的被限

4、制酶切開(kāi)的DNA兩條兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫對(duì)，這樣的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割 當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的時(shí)，切開(kāi)的DNADNA兩條單鏈的切口，是平整兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫的，這樣的切口叫平末端平末端。限制性內(nèi)切酶作用過(guò)程限制性內(nèi)切酶作用過(guò)程SmaISmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。中軸線SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G與C之間切割你能推測(cè)限制酶存在于原核生物

5、中的你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？作用是什么嗎？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶限制酶就是細(xì)就是細(xì)菌的一種菌的一種防御性工具，防御性工具，當(dāng)外源當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶利用限制酶將外源將外源DNA切割掉，切割掉，以保證自身的以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切切割外源割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的、使之失效，從

6、而達(dá)到保護(hù)自身的目的。目的。尋根問(wèn)底尋根問(wèn)底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其的細(xì)胞，其DNADNA分子中分子中不具備這種限制酶不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列的識(shí)別切割序列，或者，或者通過(guò)甲基化酶將甲通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的種限制酶也不會(huì)使自身的DNADNA被切斷，并被切斷，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入

7、侵。 基因的針線：基因的針線：DNA連接連接酶酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶用同種限制酶切割切割A(yù)TGCATGC連接酶連接連接酶連接磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNADNA連接酶的作用過(guò)程：連接酶的作用過(guò)程：二、二、DNADNA連接酶連接酶“分子縫合針?lè)肿涌p合針”作用部位：作用部位：（扶手）（扶手）（梯子）（梯子）核苷酸分子的連接：核苷酸分子的連接：ATGCATGCDNADNA聚合聚合酶連接單酶

8、連接單鏈，把單鏈，把單個(gè)脫氧核個(gè)脫氧核苷酸連接苷酸連接到到DNADNA片片段上段上？DNA聚合酶和聚合酶和DNA連接酶有連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶連接連接DNA鏈鏈連接部位連接部位雙鏈雙鏈在兩在兩DNADNA片片斷之間形成斷之間形成磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵單鏈單鏈將單個(gè)核苷酸加將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片斷片斷33末端形成末端形成磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵DNA連連接酶接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同點(diǎn)點(diǎn)作用作用實(shí)質(zhì)實(shí)質(zhì)化化學(xué)學(xué)本本質(zhì)質(zhì)不不同同點(diǎn)點(diǎn)模板模板作用作用對(duì)對(duì)象象 作用作用結(jié)結(jié)果果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯鍵磷酸二

9、酯鍵都是蛋白質(zhì)都是蛋白質(zhì)不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重組組DNA分子分子形成形成DNA的一條的一條鏈鏈基因工程基因工程DNA復(fù)制復(fù)制DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較聚合酶的比較只能將只能將單個(gè)核苷單個(gè)核苷酸酸連接到已有的連接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵E.coliDNAE.coliDNA連接酶：連接酶：連接黏性末端連接黏性末端T T4 4DNADNA連接酶：連接酶： 連接黏性末端連接黏性末端 平末端平末端DNADNA連接酶種類連接酶種類三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車分子

10、運(yùn)輸車”1.載體的作用載體的作用2.載體的必要條件載體的必要條件3.3.載體的種類載體的種類質(zhì)粒質(zhì)粒病毒：病毒：、動(dòng)植物病毒等、動(dòng)植物病毒等 大腸桿菌的質(zhì)粒：大腸桿菌的質(zhì)粒： 最常用的質(zhì)粒是最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因。中常含有抗藥基因。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成。在宿主細(xì)胞內(nèi)成?；蜻M(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車”能復(fù)制并帶能復(fù)制并帶著插入的目著插入的目的基因一起的基因一起復(fù)制復(fù)制有切割位點(diǎn)有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因有標(biāo)記基因的存在，

11、將的存在，將來(lái)可用含青來(lái)可用含青霉素的培養(yǎng)霉素的培養(yǎng)基鑒別。基鑒別?；蜻M(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車”小結(jié)基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有專一性具有專一性(識(shí)別序列識(shí)別序列)切開(kāi)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵種類種類E.coliDNA連接酶連接酶T4 DNADNA連接酶連接酶運(yùn)載運(yùn)載工具工具具備的具備的條件條件1、2、3、4、5、質(zhì)粒、質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒噬菌體、動(dòng)植物病毒第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)細(xì)胞

12、的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列能夠編碼蛋白質(zhì)的序列不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取 目的基因主要是指目的基因主要是指_ 獲取目的基因的常用方法獲取目的基因的常用方法 從基因文庫(kù)

13、中獲取從基因文庫(kù)中獲?。ɑ蚪M文庫(kù)，部分基因文庫(kù)）（基因組文庫(kù)，部分基因文庫(kù)） 利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因（變性，復(fù)性，延伸）（變性，復(fù)性，延伸） 通過(guò)通過(guò)DNADNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成合成儀用化學(xué)方法直接人工合成編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因基因文庫(kù)基因文庫(kù)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如部分基因文庫(kù)（如:cDNA:cDNA文庫(kù)）文庫(kù)）1. 1.基因文庫(kù)基因文庫(kù) 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片斷，片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，

14、稱為基因文庫(kù)種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因2.2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法鳥槍法：鳥槍法：供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運(yùn)載體運(yùn)載體限制酶限制酶與載體連接載入與載體連接載入受體細(xì)胞受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入導(dǎo)入外源外源DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增目的基因目的基因分離分離（直接分離法）（直接分離法）（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使的信使RNARNA為模板，反為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DN

15、ADNA，然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成雙鏈雙鏈DNADNA，從而獲得所，從而獲得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA雜交雙鏈雜交雙鏈( (單鏈單鏈RNA/RNA/單鏈單鏈DNA)DNA)單鏈單鏈DNADNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶核酸酶H H2.2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法基因文庫(kù)的構(gòu)建方法DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNADNA( (目的基因目的基因) )（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因（一）從基因文庫(kù)中獲得目的基因（二）利用（二）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_(kāi)，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核

16、酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _、_ (_ (做啟動(dòng)子做啟動(dòng)子) )、 _等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增循為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制模板模板DNADNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對(duì)引物一對(duì)引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增（二）利用（二）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因過(guò)程：過(guò)程：a a、DNADNA變性（變性（90-959

17、0-95）：）：目的基因目的基因DNADNA受熱變性，解鏈?zhǔn)軣嶙冃裕怄渂 b、復(fù)性（、復(fù)性（55-6555-65）：）：引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：）：合成鏈在合成鏈在DNADNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸聚合酶作用下進(jìn)行延伸（二）利用（二）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因三、根據(jù)已知的氨基酸序列合成三、根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使信使RNARNA序列，然后按序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的

18、推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成1. 1.用一定的用一定的_切割質(zhì)切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出出_。2.2.用用_切斷目的切斷目的基因，使其產(chǎn)生基因，使其產(chǎn)生_。3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處，再加入適量再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組DNADN

19、A分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶切口切口DNADNA連接酶連接酶相同的黏性末端相同的黏性末端二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種4.4.過(guò)程過(guò)程: :二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建5.5.基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+ +目的基因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +

20、標(biāo)記基標(biāo)記基因因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成： 目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段，位于基因的首端，片段，位于基因的首端，是是RNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。終止子終止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的：位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)。片段，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)。標(biāo)記基因標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，

21、從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建小結(jié)：小結(jié)：一、獲取目的基因的常用方法一、獲取目的基因的常用方法從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲?。B槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建（鳥槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建部分基因文庫(kù)，目的基因在細(xì)胞部分基因文庫(kù)，目的基因在細(xì)胞內(nèi)內(nèi)復(fù)制）復(fù)制）利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因（目的基因在細(xì)胞（目的基因在細(xì)胞 外外復(fù)制）復(fù)制）通過(guò)通過(guò)DNADNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合合成儀用化學(xué)方法直接人工合成成質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏

22、性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種過(guò)程過(guò)程: :二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+ +目的基因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基標(biāo)記基因因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基本操作程序第二課時(shí)基因工程的基本操作程序第二課時(shí)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)

23、桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1 1）農(nóng)桿菌介紹）農(nóng)桿菌介紹（2 2）原理及適用范圍）原理及適用范圍三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2 2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧?/p>

24、體細(xì)胞 顯顯微注射法：微注射法：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因基因動(dòng)動(dòng)物中采用最多，最物中采用最多，最為為有有效的方法效的方法 操作程序：操作程序：表達(dá)載體提純表達(dá)載體提純從雌性動(dòng)物體內(nèi)取出卵從雌性動(dòng)物體內(nèi)取出卵顯微注射顯微注射胚胎早期培養(yǎng)胚胎早期培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植顯顯微微注注射射儀儀固定固定吸管吸管微量注微量注射針射針針尖極細(xì)（針尖極細(xì)（0.10.1至至0.5m0.5m） 3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1 1）常用大腸桿菌：）常用大腸桿菌： （2 2）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法 首先用首先用CaCa2+2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收

25、周圍環(huán)境中環(huán)境中DNADNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。第二步是將重組表達(dá)載體細(xì)胞。第二步是將重組表達(dá)載體DNADNA分子溶于緩沖分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收DNADNA分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。檢測(cè)檢測(cè)鑒定：鑒定：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗

26、病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復(fù)性復(fù)性 不同來(lái)源的不同來(lái)源的DNA分子分子檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因方法方法DNADNA分子雜交分子雜交復(fù)性復(fù)性RNADNA檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA方法方法檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法抗原抗體雜交抗原抗體雜交鑒定

27、：鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程程序總結(jié)基因工程程序總結(jié)一、獲取目的基因的常用方法一、獲取目的基因的常用方法從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲?。B槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建（鳥槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建部分基因文庫(kù)，目的基因在細(xì)胞部分基因文庫(kù)，目的基因在細(xì)胞內(nèi)內(nèi)復(fù)制）復(fù)制）利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因（目的基因在細(xì)胞（目的基因在細(xì)胞 外外復(fù)制）復(fù)制）通過(guò)通過(guò)DNADNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合合成儀用化學(xué)方法直接人工合成成基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的

28、組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+ +目的基因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基標(biāo)記基因因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞檢測(cè)檢測(cè)鑒定：鑒

29、定：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1 1）以下說(shuō)法正確的是）以下說(shuō)法正確的是 A A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列序列B B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體質(zhì)粒是基

30、因工程中唯一的運(yùn)載體 C C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C C隨堂練習(xí)隨堂練習(xí)2 2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A A、能復(fù)制能復(fù)制 B B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C C、具有標(biāo)記基因具有標(biāo)記基因 D D、它是環(huán)狀它是環(huán)狀DNADNAD D隨堂練習(xí)隨堂練習(xí)3 3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是 A A、DNADNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D D、 運(yùn)載體和目的基因用同一種限制酶處理運(yùn)載體和目的基因用同一種限制酶處理A A隨堂練習(xí)隨堂練習(xí)4 4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載