乳酸菌的益生及免疫調(diào)節(jié)作用

1、乳酸桿菌的益生特性及免疫調(diào)節(jié)作用乳酸桿菌的益生特性及免疫調(diào)節(jié)作用International Journal of Food MicrobiologyAvailable online 13 May 2011Keywords:Lactobacilli Probiotic characteristics Immune modulationIn the current study, the probiotic potential of approximately 350 strains of lactic acid bacteria isolated from Korean infant feces

2、and Kimchi was investigated. Common probiotic properties of the bacterial strains, such as acid tolerance, bile tolerance and adhesion to human intestinal epithelial cells (HT-29 cells), were examined.Some strains were found to have immune modulatory and antimicrobial properties. Antagonistic activi

3、ty against a panel of pathogenic bacteria was found to be strain dependent. To evaluate the immune modulatory activity of the strains, lymphocyte interferon (IFN)- secretion was determined in conjunction with cell proliferation. Some strains of Lactobacillus gasseri, L. fermentum and L. plantarum ex

4、hibited increased IFN-levels and lymphocyte proliferation. To evaluate the effects of these immune modulating lactobacilli on host life span, Caenorhabditis elegans was used as an in vivo model. Nematodes that were supplied heat-killed lactobacilli as a food source exhibited obvious differences in l

5、ife span compared with those fed Escherichia coli OP50. The mean life span (determined as mean percent survival) of worms fed L. plantarum CJLP133 andL. fermentum LA12 was 13.89% and 13.69% greater, respectively, than that of control nematodes after 21 days(P=0.036 and 0.043, respectively). In addit

6、ion, some of safety profiles, including hemolytic type, gelatin hydration and degradation of urea, were found to be positive. These newly identified lactobacilli hold promise for use as probiotic agents, feed additives and/or in food applications.A b s t r a c t研究發(fā)現(xiàn)，從韓國(guó)嬰兒的糞便及泡菜中分離出的乳酸菌大約有350株菌株有益生潛力

7、。益生菌的普遍益生特性主要包括：耐酸性，耐膽鹽及對(duì)人腸上皮細(xì)胞的粘附性。還有一些菌株有免疫調(diào)節(jié)作用及抗菌作用。一些細(xì)菌對(duì)致病菌有一定的抵抗作用。為了評(píng)估這株菌的免疫調(diào)節(jié)作用，測(cè)定淋巴細(xì)胞干擾素（IFN） - 的分泌與增值。一些發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌會(huì)使干擾素（IFN） - 分泌增加及淋巴細(xì)胞的增值。一些安全指標(biāo)，包括溶血性，明膠水化及尿素降解發(fā)現(xiàn)是陽(yáng)性的。這些分離出來(lái)的菌株可以作為益生菌用于飼料及食物中。1 Introduction乳酸菌作為益生菌可以有益于人類(lèi)健康及阻止人類(lèi)疾病。乳酸桿菌是一個(gè)有較好益生效果的菌屬。大量的研究證實(shí)許多的乳酸桿菌都有益生特性。雖然在傳統(tǒng)的食品中乳酸桿菌作為益生菌

8、有很長(zhǎng)的歷史了，但它作為益生作用及用于食品加工之前一些指標(biāo)還是需要測(cè)定的。益生菌能夠抵抗胃酸和膽鹽，并能夠定植于人體的腸道中。已經(jīng)證實(shí)乳酸菌能夠抑制致病菌的生長(zhǎng)，如大腸桿菌，李斯特菌，沙門(mén)氏菌等。臨床上也顯示出了乳酸桿菌的有益作用，如降低膽固醇，預(yù)防腹瀉，緩解乳糖不耐癥，抗癌及免疫調(diào)節(jié)作用，這些都說(shuō)明它具有益生功能。近年來(lái)認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)作用對(duì)宿主腸道健康有很重要的作用。益生菌的益生作用被應(yīng)用于功能性食品及藥物制劑中，主要是由于這些微生物能夠刺激宿主的免疫系統(tǒng)。對(duì)致病菌及微生物抗原的防御反應(yīng)能夠促進(jìn)腸道成熟及完整性。一些體外實(shí)驗(yàn)也證明了乳酸桿菌具有抑制致病菌的作用。本實(shí)驗(yàn)的研究主要集中在對(duì)從韓國(guó)嬰

9、兒糞便及泡菜中分離出乳酸桿菌的益生特性的研究主要集中在耐酸性（acid tolerance），耐膽鹽（bile tolerance）及人體上皮細(xì)胞的粘附性上（human intestinal epithelial cells）。一些測(cè)試菌株表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用及抗菌作用并且能夠延長(zhǎng)宿主的壽命。主要應(yīng)用于亞洲人群的發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌有潛在的益生特性。這些益生特性可以應(yīng)用于功能性食品及飼料中。2 Materials and methods2.1 Isolation and preliminary identification乳酸桿菌來(lái)自于韓國(guó)嬰兒的糞便及泡菜中。乳酸桿菌用改良的MRS固體培養(yǎng)基，

10、37厭氧培養(yǎng)48h。從平板中挑取單菌落在純化的MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行革蘭氏染色。在-80條件下用含15%甘油的MRS液體培養(yǎng)基儲(chǔ)存。傳代三次。2.2 Species level identification通過(guò)16rDNA序列分析對(duì)209個(gè)分離菌株進(jìn)行測(cè)定。從每個(gè)菌株中提取DNA進(jìn)行引物擴(kuò)增。PCR引物序列如下：正向引物，5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3; 反向引物5-GGTTACCTTTGTTACGACTT-3；94下變性5min。然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，持續(xù)一分鐘。退火：50-55,1min,72，40s聚合反應(yīng)，最后72聚合5min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。

11、最終產(chǎn)品的序列通過(guò)ABI377 DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行分析。將得到的序列與DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比較進(jìn)行同源性分析。2.3 pH and bile tolerance耐酸性：含有1000單位/毫升的胃蛋白酶的酸化MRS液體培養(yǎng)基 37培養(yǎng)3h，觀察活菌存活數(shù)。膽鹽耐受性：含0.3%膽汁的MRS液體培養(yǎng)基37培養(yǎng)24h,觀察活菌數(shù)2.4 Adhesion assayHT-29腸上皮細(xì)胞儲(chǔ)存于24孔培養(yǎng)板中并供給補(bǔ)充10%的胎牛血清的RPMI-1640，細(xì)胞濃度為4104個(gè)細(xì)胞/孔。所用細(xì)胞濃度大約為約1107CFU/毫升。在37培育兩個(gè)小時(shí)后，用PBS洗滌單層膜6次。用無(wú)菌水吹打粘附的細(xì)菌，使其分

12、離，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。重復(fù)兩次。2.5 Inhibition of intestinal pathogens六個(gè)代表性的腸道致病菌：大腸桿菌O157和H7 ATCC 43894，鼠傷寒沙門(mén)氏菌KCCM 11806，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和李斯特菌。致病菌在37 BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h。取1ml細(xì)菌培養(yǎng)液與100ml含有1.2%瓊脂的BHI一起倒入平板中。將乳酸桿菌（40微升）涂在平板的表面，37培養(yǎng)12h。不含乳酸桿菌的MRS作為陰性對(duì)照組。培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌圈的范圍。出現(xiàn)明顯的超過(guò)2mm的抑菌圈為陽(yáng)性。重復(fù)三次。2.6 Lymphocyte proliferation

13、 assay采用MTT法。淋巴細(xì)胞取自六周齡小鼠的脾臟，將其接種于96孔板中，加入200微升的RPMI-1640（補(bǔ)充10%FBS），培養(yǎng)24h。將乳酸桿菌加入到每孔中，在37含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌細(xì)胞的準(zhǔn)備：在MRS液體培養(yǎng)基37C培養(yǎng)18小時(shí)后，將細(xì)胞懸浮液以8000r/min離心10min,用PBS洗滌兩次。每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的調(diào)整6 106 CFU /毫升。72h后，將培養(yǎng)液從每孔移出，并在每孔加入20微升的MTT溶液。1h后，有色甲臜結(jié)晶溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490nm的吸光度（OD值）。重復(fù)三次。陽(yáng)性對(duì)照組，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在含有刀豆蛋白A（10微克/毫升），植物血凝素（ P

14、HA ， 10微克/毫升）或脂多糖（ LPS ， 10微克/毫升）；陰性對(duì)照組：不含乳酸桿菌的的細(xì)胞2.7Determination of interferon (IFN)-gamma production此實(shí)驗(yàn)使用活菌體及熱滅活的細(xì)菌?；罹w的制備同上，細(xì)菌的懸浮液的體積調(diào)節(jié)到105菌落形成單位/毫升。熱滅火細(xì)胞的制備：37MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，8000r/min離心10min,用PBS洗滌兩次。調(diào)整細(xì)胞懸浮液的體積到105菌落形成單位/毫升的密度108菌落形成單位/毫升；最后細(xì)胞在70熱滅活10min，在-20儲(chǔ)存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA ）測(cè)定培養(yǎng)上清液中的IFN-

15、的水平。從小鼠取出的脾淋巴細(xì)胞，將其接種于96孔板中，加入200微升的RPMI-1640（補(bǔ)充10%FBS），將細(xì)菌細(xì)胞加入其中，37C在含5% CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，回收培養(yǎng)上清，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）測(cè)定IFN-釋放量。在酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）中，微量滴定板涂覆有5微克/毫升純化的抗IFN-抗體，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，然后孔板用PBS洗滌三次。用1牛血清白蛋白（BSA）的PBS封存。重復(fù)三次?？装逶谑覝叵屡囵B(yǎng)2h，之后用PBS洗滌5次。IFN 通過(guò)生物素標(biāo)記的抗IFN - 抗體來(lái)測(cè)定。將孔板洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶。加入100微升的鹽酸終止反應(yīng)。在450nm處

16、測(cè)定OD值。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在含有刀豆蛋白A（10微克/毫升），植物血凝素（ PHA ， 10微克/毫升）或脂多糖（ LPS ， 10微克/毫升）；陰性對(duì)照組：不含乳酸桿菌的的細(xì)胞。2.8 Safety evaluation在含5羊血瓊脂平板上培養(yǎng)48h后，測(cè)定溶血性和菌落形態(tài)。明膠液化程度在25C冷凍的營(yíng)養(yǎng)明膠管中測(cè)定至少72h。3 Results3.1pH值及膽鹽耐受性350株菌株中有118株在含有1000單位/ml，pH2.5的條件下存活。一些菌株能夠在膽鹽環(huán)境中存活24h以上?？偨Y(jié)起來(lái)，共有59株乳酸桿菌在酸性及膽鹽條件下有較強(qiáng)的存活性。3.2粘附力測(cè)定用上述59株菌株粘附

17、HT-29腸上皮細(xì)胞（表1）。菌株間的差異性很大。在測(cè)試菌株中，有29株對(duì)上皮細(xì)胞有較強(qiáng)的粘附性，粘附性高于或接近陽(yáng)性對(duì)照組鼠李糖乳桿菌。其余30株表現(xiàn)出低度或中度的粘附性。3.3腸道致病菌的抑制乳酸桿菌對(duì)腸道致病菌的抑制作用有很大的不同。許多的菌數(shù)顯示出對(duì)腸道致病菌有弱的或沒(méi)有致病性，但是一些菌株，包括發(fā)酵乳桿菌LA12和CJMA3，植物乳桿菌CJMA1，CJLP56 ，CJLP133，CJLP243， CJNR26，CJNR37，CJNR54，BJ58，BJ217，BJ224和BJ242能夠廣泛的抑制腸道致病菌。MRS液體培養(yǎng)基對(duì)六株腸道致病菌沒(méi)有抑制作用。3.4淋巴細(xì)胞增值MTT法是一種比色的方法。新分離的脾淋巴細(xì)胞與乳酸桿菌共同培養(yǎng)72h，細(xì)胞的活力采用MTT法測(cè)定。菌株對(duì)細(xì)胞活力的影響不同。一些菌株沒(méi)有活力，而一些菌株可以增加脾