酶聯(lián)免疫技術(shù)

1、1會計學酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)1.ELISA的原理的原理2.ELISA的類型的類型3.試劑準備試劑準備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結(jié)合物結(jié)合物 酶底物的準備酶底物的準備 4.對照設(shè)定對照設(shè)定5.標本的采取和保存標本的采取和保存6.結(jié)果判斷結(jié)果判斷 ELISA ELISA是一種免疫測定（是一種免疫測定（immunoassayimmunoassay，IAIA）。基礎(chǔ)）。基礎(chǔ): :抗原或抗體的固抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為相化及抗原或抗體的酶標記，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或有色產(chǎn)物，

2、產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。定量分析。-利用抗原抗體的特異性反應(yīng)作為識別手段，用酶催化底利用抗原抗體的特異性反應(yīng)作為識別手段，用酶催化底 物等方法作為顯示系統(tǒng)，用微孔板等材料作為載體和分物等方法作為顯示系統(tǒng)，用微孔板等材料作為載體和分 離系統(tǒng)的一種生物學檢測方法。離系統(tǒng)的一種生物學檢測方法。-結(jié)合物與相應(yīng)的抗原（抗體）反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催結(jié)合物與相應(yīng)的抗原（抗體）反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催 化底物生成有色物質(zhì)，而顏色的深淺可定量待測物的含化底物生成有色物質(zhì)，而顏色的深淺可定量待測物的含 量。量。1.ELISA的原理的原理酶免疫測定類型酶免疫測定類型 這種固相酶免

3、疫測定方法在這種固相酶免疫測定方法在19711971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay），簡稱），簡稱ELISAELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均相酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定液相酶免疫測定1.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)抗原與抗體結(jié)合形成

4、抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：式為：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb ,AgAgAb ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有關(guān)。值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離?？乖臎Q定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合

5、發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W結(jié)抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間。化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。最適比例最適比例 敏感性敏感性化學比色法的敏感度為化學比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平酶反應(yīng)測定法的敏感度約為酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達標記的免疫敏感度可提高

6、數(shù)千倍，達ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達，其敏感度可達0.1ng/ml0.1ng/ml。1.41.4免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應(yīng)的抗原，因清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣。此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣。固相載體抗體酶抗原酶標記抗原方法一方法一: :直接競爭法直接競爭法( (包抗體包抗體) )1.1.將抗體

7、包被在固相載體上將抗體包被在固相載體上。2.2.加入樣品和酶標記抗原加入樣品和酶標記抗原, , 兩者競爭板上的抗體兩者競爭板上的抗體. .3.3.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。樣本/標品(抗原)方法方法: :反應(yīng)步驟少反應(yīng)步驟少, ,操作簡單操作簡單; ;特異性不如間接競爭法特異性不如間接競爭法. .酶抗抗體酶標記抗抗體抗體偶聯(lián)抗原樣本/標品固相載體方法二方法二: :間接競爭法間接競爭法( (包被抗原包被抗原) )1.1.將抗原包被在固相載體上。將抗原包被在固相載體上。 2.2.加入樣本和抗體后，若樣本中加入樣本和抗體后，若樣本中 含有抗原，則將和板上抗原競爭含有抗原，則將和板上抗原競爭

8、結(jié)結(jié)合加入的抗體。合加入的抗體。3.3.再加入酶標記抗抗體，則結(jié)合再加入酶標記抗抗體，則結(jié)合為抗原為抗原- -抗體抗體- -酶標記抗抗體復(fù)合物酶標記抗抗體復(fù)合物。4.4.酶催化底物并顯色酶催化底物并顯色方法二方法二:二步反應(yīng)二步反應(yīng),操作比較簡單操作比較簡單,有有放大靈敏度和增強準確度的放大靈敏度和增強準確度的作用作用酶抗原酶標記 抗體樣本/標品(抗原)抗抗體固相載體抗體方法三方法三: :間接競爭法間接競爭法( (包二抗包二抗) )1.1.將抗抗體（二抗）包在固相載體將抗抗體（二抗）包在固相載體上。上。2.2.加入抗體，則結(jié)合為抗抗體加入抗體，則結(jié)合為抗抗體- -抗體抗體復(fù)合物。復(fù)合物。3.

9、3. 加入樣本和標準品及酶標記抗原加入樣本和標準品及酶標記抗原，兩者競爭結(jié)合抗體。，兩者競爭結(jié)合抗體。4.4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。方法三方法三: :二步反應(yīng)二步反應(yīng), ,操作比較簡單操作比較簡單, ,在加樣本時容易出現(xiàn)時間在加樣本時容易出現(xiàn)時間差而影響檢測結(jié)果的準確差而影響檢測結(jié)果的準確度度. .酶抗抗體酶標記抗抗體抗體樣本/標品（抗原）固相載體方法四方法四( (一步法反應(yīng)一步法反應(yīng)) )1.1.將抗原（或二抗）包被在固相載體上。將抗原（或二抗）包被在固相載體上。 2.2.加入樣本和酶標記二抗或酶標抗原加入樣本和酶標記二抗或酶標抗原后，最后加入抗體，三種一起混合后，最后加入抗體

10、，三種一起混合反應(yīng)。形成抗原（二抗）反應(yīng)。形成抗原（二抗）-抗體抗體- -酶標記抗抗體（抗原）復(fù)合物。酶標記抗抗體（抗原）復(fù)合物。4.4.酶催化底物并顯色酶催化底物并顯色 “一步法反應(yīng)一步法反應(yīng)”方法四方法四: :操作簡單操作簡單, ,方便方便, ,快速快速. .反應(yīng)靈敏反應(yīng)靈敏. .抗抗體取有取有機溶劑時，應(yīng)注意避免交叉污染）機溶劑時，應(yīng)注意避免交叉污染）用的用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無色化合物，

11、經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結(jié)酶結(jié)合物合物而建立此法。而建立此法。雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本不需稀釋用特異性抗原進行

12、包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAgHBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。間接法測抗體間接法測抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗同一酶標抗抗體體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。建立檢測相應(yīng)抗體的方法。競爭法測抗體競爭法測抗體 當抗原材料

13、中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。此法檢測特異性抗體。 競爭法測抗原競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點位點，因此不能用，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小

14、分子激素、藥物等合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISAELISA測定多用此法。測定多用此法。捕獲包被法測抗體捕獲包被法測抗體IgMIgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgMIgM抗體包被固相，以捕獲血清抗體包被固相，以捕獲血清標本中的標本中的IgMIgM（其中包括針對抗原的特異性（其中包括針對抗原的特異性IgMIgM抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgMIgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。此法常用于病毒性感染的早期診斷。酶免疫測定類型酶免疫測定類型 這種固相酶免疫測定方法在這種固相酶免疫測定方法在19711971年最初建

15、立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay），簡稱），簡稱ELISAELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均相酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定液相酶免疫測定1.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：式為：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)）