煙草的組織培養(yǎng)技術(shù)

1、煙草的組織培養(yǎng)技術(shù)一、目的與要求1. 驗證“植物細(xì)胞全能性”理論 。2. 學(xué)習(xí)用生長調(diào)節(jié)劑對植物器官發(fā)生的誘導(dǎo)方法。二、實驗原理植物組織培養(yǎng) 是指在無菌條件下，分離、并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)離體植物組織（器官或細(xì)胞） 的技術(shù)。植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是 植物細(xì)胞的全能性， 即植物體的每個活細(xì)胞都有相同的遺傳組成，在適當(dāng)條件下具有繁殖出完整植株的能力。植物組織當(dāng)中原本已經(jīng)分化的細(xì)胞，組織、器官一旦脫離原有的機體環(huán)境，成為離體狀態(tài)， 在適宜的營養(yǎng)和外界條件下， 就會表現(xiàn)出細(xì)胞的全能性， 從已經(jīng)分化的細(xì)胞通過 脫分化，成為重新具有分裂能力的胚性細(xì)胞， 并能再分化 重新生長發(fā)育成完整的植株。愈傷組織： 是指一個

2、離體的細(xì)胞、一塊組織或一個器官的細(xì)胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細(xì)胞，這些細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成了無序結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)。脫分化：已經(jīng)分化的細(xì)胞，發(fā)生生理、生化的改變，退回到胚性細(xì)胞的過程。再分化： 經(jīng)過脫分化的細(xì)胞或組織再次獲得分化成不同功能的細(xì)胞、組織、器官或完整植物體。三、材料和用具1. 材料：無菌煙草葉盤（已經(jīng)誘導(dǎo)成芽） ，擬南芥。2. 用具：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、電子天平、移液器、手術(shù)解剖刀、大、小鑷子、 30ml 燒杯、 500ml 燒杯、藥勺、玻璃棒、培養(yǎng)瓶、平皿、試紙（ PH5.4-7），報紙等。3. 試劑： MS 培養(yǎng)基、 0.5mol/LNaOH

3、、 1mol/L HCl 。四、操作步驟（一） 誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制（見表 1）1. 加 MS 儲液（儲液配置見附表）大量元素和微量元素的母液都是高濃度的，為防止混合后發(fā)生沉淀，建議加完大量元素后先加水 （約總體積 3/4），再加各微量元素和有機成分。鐵鹽也是微量元素，因為易發(fā)生沉淀，所以與其它微量元素分開配。儲液中的鐵鹽存于棕色瓶中。配好的儲液應(yīng)當(dāng)4保存。表 1 是 4 瓶培養(yǎng)基（ 1組）的配置方案。表 1誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制表成分實際稱取量蒸餾水120 mlMS 母液15 mL蔗糖4.5 g用蒸餾水粗略定容至100mlpH 值5.8瓊脂1.2 g2. 加蔗糖（ 3%）（ m/v）。蔗糖是碳源，同時起到

4、維持滲透壓的作用。3. 調(diào) pH=5.8。pH 過低，高溫處里時間過長，都可能會使培養(yǎng)基不凝。4. 加瓊脂（ 0.7-0.8%）（ m/v ）瓊脂粉是固化劑、支持物。（二）滅菌1. 培養(yǎng)基、解剖刀、鑷子、平皿需在高壓滅菌鍋 120，滅菌 15min。2. 接種前打開無菌間和超凈臺紫外燈照射 30min。3. 用肥皂洗手和手腕。 進(jìn)入無菌間， 先用 70%酒精或新潔爾滅噴手。 關(guān)掉無菌間棚頂紫外燈，打開超凈臺風(fēng)機，關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。（三） 接種1. 坐在超凈工作臺前，用 70%酒精棉球擦拭雙手、培養(yǎng)瓶和超凈臺面。2. 待手上的酒精干了，點燃酒精燈。3. 將培養(yǎng)瓶的蓋子旋松，但不要打開，放

5、到無菌風(fēng)道側(cè)面?zhèn)溆?。將鑷子、解剖刀在酒精燈外焰上灼燒?待其冷卻后，放到培養(yǎng)皿上備用。4. 用鑷子和解剖刀取出一塊葉盤，放到平皿上，切取煙草葉芽1-2 塊，插入培養(yǎng)基。5. 用酒精燈火焰上灼燒瓶口，瓶蓋數(shù)秒（阻斷微生物進(jìn)入） ，擰上瓶蓋，不必太緊。注意：無菌操作時不要講話，以免污染。用酒精對雙手消毒時，務(wù)必待酒精徹底揮發(fā)后再靠近酒精燈火焰，以免火焰?zhèn)?。進(jìn)出無菌間關(guān)好緩沖間的推拉門。培養(yǎng) 4 周， 25，光照 16 小時，暗 8 小時，濕度 70%-80%。五 實驗結(jié)果1. 第二周生長情況擬南芥 1： 1 號擬南芥種子開始膨脹，略微膨大，但是并未發(fā)芽，無明顯變化。擬南芥 2： 2 號擬南芥中有

6、一至二個種子開始發(fā)芽，芽的形狀不規(guī)則，并且顯得略微發(fā)黃。芽只是莖的部分露出培養(yǎng)基的上方， 芽與根都在培養(yǎng)基中， 推測原因是種子相對于培養(yǎng)基的位置影響， 發(fā)芽的一面面朝培養(yǎng)基， 故芽孢向培養(yǎng)基中生長。煙草 1：生長狀態(tài)較好，發(fā)育較快，已經(jīng)占據(jù)了整個培養(yǎng)瓶的空間，莖稈粗壯，葉片綠色略帶黃色，根系較發(fā)達(dá)，伸張至整個培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基。煙草 2：生長狀態(tài)較好，同 1 號煙草。區(qū)別在于根系更發(fā)達(dá)，有部分根伸張到培養(yǎng)基的表面，暴露在空氣中。2.第三周生長情況擬南芥 1：同第二周時的狀態(tài)，無明顯變化。擬南芥 2：最初生長出的芽死了幾個，只有一個芽顯淺黃色，其它已發(fā)的顏色漸漸變深，顯現(xiàn)出與培養(yǎng)基相近的褐色。 表明

7、色素對擬南芥種子的發(fā)芽有影響， 可以滲透到萌發(fā)的芽中。煙草 1：生長情況與第二周時相同。有限的培養(yǎng)瓶生長空間與培養(yǎng)基中有限的營養(yǎng)物質(zhì)，限制了煙草苗的進(jìn)一步生長。但染料的顏色略微變淺。煙草 2：生長情況與第二周相似，只是葉片的大小有長大。最明顯的變化是培養(yǎng)基的顏色，最初的深紅色此時已成了淺紅，顏色變化較大。3.第四周生長情況擬南芥 1：依舊無萌芽，只是種子更加膨大。擬南芥 2：芽的大小與前兩周相同，無明顯變化。推測原因是溫度較低，抑制了芽的萌發(fā)于繼續(xù)生長。煙草 1：室內(nèi)培養(yǎng)兩周后，葉片開始顯得發(fā)黃，莖稈開始變細(xì)，為缺乏光照和營養(yǎng)物質(zhì)的表現(xiàn)，需要移種到外部環(huán)境中。煙草 2：葉片變小、發(fā)黃，整體狀態(tài)

8、不及前一周。染料的顏色繼續(xù)變淺，根毛的顏色加深。六 思考題1什么是細(xì)胞全能性？答：細(xì)胞的全能性是指細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后仍具有形成完整有機體的潛能或特性。具有以下兩大特點：高度分化的植物體細(xì)胞具有全能性， 植物細(xì)胞在離體的情況下， 在一定營養(yǎng)的物質(zhì)，激素和其他適宜的外界條件下，才能表現(xiàn)其全能性。高度分化的動物體細(xì)胞也具有全能性。 動物細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞） 在離體的情況下，在一定營養(yǎng)物質(zhì)、因子（包括特定轉(zhuǎn)錄因子或小分子化合物）的誘導(dǎo)下，可被重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ iPSC），并發(fā)育成新的個體。根據(jù)動物細(xì)胞全能性大小，可分為全能性細(xì)胞（如動物早期胚胎細(xì)胞） ，多能性（如原腸胚細(xì)胞），專能性（如造血干

9、細(xì)胞）；根據(jù)植物細(xì)胞表達(dá)全能性大小排列是：受精卵、生殖細(xì)胞、體細(xì)胞；全能性的物質(zhì)基礎(chǔ)是細(xì)胞內(nèi)含有本物種全套遺傳物質(zhì)。一個生活的植物細(xì)胞， 只要有完整的膜系統(tǒng)和細(xì)胞核， 它就會有一整套發(fā)育成一個完整植株的遺傳基礎(chǔ)， 在一個適當(dāng)?shù)臈l件下可以通過分裂、 分化再生成一個完整植株，這就是所謂的植物細(xì)胞全能性。這是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。出師表兩漢：諸葛亮先帝創(chuàng)業(yè)未半而中道崩殂， 今天下三分， 益州疲弊， 此誠危急存亡之秋也。然侍衛(wèi)之臣不懈于內(nèi)，忠志之士忘身于外者，蓋追先帝之殊遇，欲報之于陛下也。誠宜開張圣聽，以光先帝遺德，恢弘志士之氣，不宜妄自菲薄，引喻失義，以塞忠諫之路也。宮中府中，俱為一體；陟罰臧否

10、，不宜異同。若有作奸犯科及為忠善者，宜付有司論其刑賞，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使內(nèi)外異法也。侍中、侍郎郭攸之、費祎、董允等，此皆良實，志慮忠純，是以先帝簡拔以遺陛下：愚以為宮中之事，事無大小，悉以咨之，然后施行，必能裨補闕漏，有所廣益。將軍向?qū)?，性行淑均，曉暢軍事，試用于昔日，先帝稱之曰愚以為營中之事，悉以咨之，必能使行陣和睦，優(yōu)劣得所?！澳?”，是以眾議舉寵為督：親賢臣，遠(yuǎn)小人，此先漢所以興隆也； 親小人， 遠(yuǎn)賢臣，此后漢所以傾頹也。 先帝在時，每與臣論此事， 未嘗不嘆息痛恨于桓、 靈也。侍中、尚書、長史、參軍，此悉貞良死節(jié)之臣，愿陛下親之、信之，則漢室之隆，可計日而待也。臣本布衣，躬耕于南陽，茍全性命于亂世，不求聞達(dá)于諸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顧臣于草廬之中，咨臣以當(dāng)世之事，由是感激，遂許先帝以驅(qū)馳。后值傾覆，受任于敗軍之際，奉命于危難之間，爾來二十有一年矣。先帝知臣謹(jǐn)慎，故臨崩寄臣以大事也。受命以來，夙夜憂嘆，恐托付不效，以傷先帝之明；故五月渡瀘，深入不毛。今南方已定，兵甲已足，當(dāng)獎率三軍