實驗九底物濃度對酶促反應速度的影響

1、 底物濃度對酶促反應速度的影響底物濃度對酶促反應速度的影響 實驗目的實驗目的 1 1 了解底物濃度對酶促反應速度的影響。了解底物濃度對酶促反應速度的影響。 2 2 學習測定米氏常數(shù)的原理和方法。學習測定米氏常數(shù)的原理和方法。 實驗原理實驗原理19131913年，年，MichaelisMichaelis和和MentenMenten提出了酶促反應速度和底物濃提出了酶促反應速度和底物濃度的關系式，即米氏方程。度的關系式，即米氏方程。V VS / ( Km+S )S / ( Km+S )式中：式中： 為反應初速度為反應初速度 V V為最大反應速度為最大反應速度 SS為底物濃度為底物濃度 KmKm為米氏

2、常數(shù)為米氏常數(shù) KmKm值是酶的一個特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和值是酶的一個特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和力。力。 Lineweaver-BurkLineweaver-Burk作圖法是用實驗方法測定作圖法是用實驗方法測定KmKm值的最常用的值的最常用的方法。方法。1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)米氏常數(shù)KmKm的的測定測定n 實驗時選擇不同的實驗時選擇不同的SS，測定相對應的，測定相對應的。求。求出兩者的倒數(shù)，以出

3、兩者的倒數(shù)，以1/1/對對1/S1/S作圖，則得到一作圖，則得到一個斜率為個斜率為K Km m/V/V的直線。將直線外推與橫軸相交，的直線。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截矩為：其橫軸截矩為：1/S1/S1/ K1/ Km m，由此求出，由此求出K Km m值。值。該法比較簡便。該法比較簡便。n 本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Lineweaver-BurkLineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定雙倒數(shù)作圖法測定K Km m值。值。n 胰蛋白酶能催化蛋白質中堿性氨基酸（胰蛋白酶能催化蛋白質中堿性氨基酸（L L精精氨酸和氨酸和L L賴氨酸）的羧基所形成

4、的肽鍵水解。賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判斷水解時生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應。自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應。n甲醛滴定法甲醛滴定法 由于氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子，故不能用酸、堿滴定其含由于氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子，故不能用酸、堿滴定其含量。但氨基酸的氨基可與甲醛反應生成羥甲基和二羥甲基氨基酸，使上述平衡向右移量。但氨基酸的氨基可與甲醛反應生成羥甲基和二羥甲基氨基酸，使上述平衡向右移動，促使氨基酸分子上的一動，促使氨基酸分子上的一NH3NH3十基解離釋放出十基解離釋放出 H+H+，從而使溶液酸性增加，

5、就可以酚，從而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示劑用酞作指示劑用 NaOHNaOH來滴定。來滴定。n小知識點：小知識點：n酚酞是堿性指示劑（變色范圍是堿性），酸滴酚酞是堿性指示劑（變色范圍是堿性），酸滴堿時用堿性指示劑；反之堿滴酸時用酸性指示堿時用堿性指示劑；反之堿滴酸時用酸性指示劑比如甲基橙甲基紅。劑比如甲基橙甲基紅。 n三、器材三、器材 n 錐形瓶錐形瓶 滴定管滴定管 移液管移液管 水浴水浴鍋鍋 量筒等量筒等n四、試劑與材料四、試劑與材料n 1. 1. 酪蛋白酪蛋白n 2. 2. 胰蛋白酶胰蛋白酶n 3. 3. 甲醛甲醛n 4. 4. 酚酞酚酞n 5. 5. 氫氧化鈉氫氧化鈉 五、操作五、操

6、作 分別向分別向6 6個小錐形瓶中加入個小錐形瓶中加入5 mL5 mL甲醛溶液和甲醛溶液和1 1滴滴酚酞，并滴加酚酞，并滴加0.1 mol/L0.1 mol/L標準氫氧化鈉溶液，直至標準氫氧化鈉溶液，直至混合物呈微粉紅色。注意：每個錐形瓶中的顏色應混合物呈微粉紅色。注意：每個錐形瓶中的顏色應一致。一致。 取取100 mL100 mL酪蛋白溶液，加入另一錐形瓶中，在酪蛋白溶液，加入另一錐形瓶中，在3737水浴中保溫水浴中保溫1010分鐘。將胰蛋白酶也在分鐘。將胰蛋白酶也在37 37 水水浴中保溫浴中保溫1010分鐘。然后精確量取分鐘。然后精確量取10 mL10 mL酶液加到酪酶液加到酪蛋白溶液中

7、（同時計時）。蛋白溶液中（同時計時）。 充分混合后，隨即取出充分混合后，隨即取出10 mL10 mL反應混合物反應混合物（作為零時的樣品）吹至一含甲醛的錐形瓶中。（作為零時的樣品）吹至一含甲醛的錐形瓶中。用用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液滴定，溶液滴定，直至混合物呈微粉直至混合物呈微粉紅色，紅色，記下所用記下所用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液的溶液的mLmL數(shù)。數(shù)。 在在2 2、4 4、6 6、8 8和和1010分鐘時，分別取出分鐘時，分別取出10 mL10 mL消化消化樣品，準確照上法操作。注意：在每個樣品中滴定終樣品，準確照上法操作。注意

8、：在每個樣品中滴定終點的顏色應當一致。用增加的滴定度對時間作圖，測點的顏色應當一致。用增加的滴定度對時間作圖，測定初速度。定初速度。 配制不同濃度的酪蛋白溶液（、配制不同濃度的酪蛋白溶液（、1010、1515、2020、30 30 g/Lg/L）測定不同底物濃度時的活力。）測定不同底物濃度時的活力。 用實驗測得的結果，以以用實驗測得的結果，以以1/1/對對1/S1/S作圖，求作圖，求出出V V和和KmKm的數(shù)值。的數(shù)值。 n【注意事項】【注意事項】n1 1實驗表明，反應速度只在最初一段時間內保持恒定，實驗表明，反應速度只在最初一段時間內保持恒定，隨著反應時間的延長，酶促反應速度逐漸下降。原因隨

9、著反應時間的延長，酶促反應速度逐漸下降。原因有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對酶產(chǎn)生有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對酶產(chǎn)生抑制作用并加速逆反應的進行，酶在一定抑制作用并加速逆反應的進行，酶在一定pHpH及溫度下及溫度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應的初速部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應的初速度為準。度為準。n2 2本實驗是一個定量測定方法，為獲得準確的實驗結本實驗是一個定量測定方法，為獲得準確的實驗結果，應盡量減少實驗操作中帶來的誤差。因此配制各果，應盡量減少實驗操作中帶來的誤差。因此配制各種底物溶液時應用同一母液進行稀釋，保證底物濃度種底物溶液時應用同一母液進行稀釋，保證底物濃度的準確性。各種試劑的加量也應準確，并嚴格控制準的準確性。各種試劑的加量也應準確，并嚴格控制準確的酶促反應時間。確的酶促反應時間。n【實驗結果】【實驗結果】n1 1測定并計算酶促反應速度。測定并計算酶促反應速度。n2 2用實驗所得的反應速度，對相應的底物濃用實驗所得的反應速度，對相應的底物濃度作圖。度作圖。n【實驗報告】【實驗報告】n總結實驗結果，并回答如下問題：總結實驗結果