電化學生物傳感器快速檢測大腸桿菌的研究進展

1、0引言水和食品中細菌的檢測，特別是致病性細菌的檢測，對于控制傳染病、保護環(huán)境衛(wèi)生和人民群眾身體健康都有著重要的意 義。在水和食品中傳播的各種致病性細菌中，大腸桿菌是最為普遍的一種。它是人 及各種動物腸道中的常居菌，常隨糞便從人及動物體內排出，廣泛散播于自然界。人 體感染了部分大腸桿菌可引起腹膜炎、出血性腸炎、膽囊炎、闌尾炎和尿道炎等疾 病，嚴重者甚至死亡12。在衛(wèi)生質量的評價和控制中，通常采用大腸桿菌作為指示菌，利用對指示菌的檢測和控制來了解水體或食品等 的受污染狀況，從而評價其質量以保證衛(wèi)生安全。大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測方法包才S多管發(fā)酵法和濾膜法等，存在操作繁瑣、檢測時 間長（一般需要12天才能

2、得到結果等缺點，難以滿足污染源快速診斷的需要。近年 來,許多基于不同檢測原理的方法已得到長足的發(fā)展 ，比如聚合酶鏈反應35、免疫 學檢測67、質譜測定8、光學測定910等等。與傳統(tǒng)方法相比，這些方法具有 一定的優(yōu)勢，但所需的檢測時間仍然較長。因此，建電化學/生物傳感器快速檢測大腸桿菌的研究進展程欲曉，金利通*（華東師范大學化學系，上海200062摘要:大腸桿菌廣泛分布于自然界中，通常被用來作為水體系統(tǒng)排泄物污染情況的 指示菌。它是大面積食物中毒的主要原因之一，嚴重感染者會引發(fā)敗血癥、腎功能衰竭等危及生命 的并發(fā)癥。電化學/生物傳感器具有獨特的優(yōu)勢，如能在渾濁溶液中操作、選擇性 好、靈敏度高、檢

3、測速度快等，因此在臨床檢測、環(huán)境保護和食品安全等領域得到了廣泛應用。該文主要對電化學/生物傳感器快速檢測大腸桿菌的研究進展進行了 簡要的綜述。關鍵詞:大腸桿菌；電化學/生物傳感器:快速檢測Development of rapid detection of escherichia coli byelectrochemical sensor and biosensorCheng Yu -xiao,Jin Li -tong *(Department of Chemistry,East China Normal University,Shanghai 200062,ChinaAbstract:Esch

4、erichia coli (E.coli,spreading abroad in natural environment,are commonly used as indicators of fecal contamination in water environments.They are one of the major causes of food-borne outbreaks and can pro -duce life -threatening complications ranging from blood diarrhea to renal failure.Electroche

5、mical sensors and biosensors have more advantages than other methods in that they can operate in turbid media and have good selec -tivity and high sensitivity.Therefore,they are applied widely in clinic diagnostics,environmental protection and food sanitation.This paper reviews briefly the recent de

6、velopment of rapid detection of E.coli by electrochemical sensors and biosensors.Key words:escherichia coli;electrochemical sensor and biosensors;rapid detection基金項目：上海市科委No.06dz05824資助項目*通訊聯(lián)系人，E-mail:ltjin .cnVol.29,No.1Mar .2009化學傳感器CHEMICALSENSORS第29卷第1期2009年3月立快速檢測大腸桿菌的新方法成為環(huán)境監(jiān)測和食品

7、衛(wèi)生領域專家和學者的一個 巨大挑戰(zhàn)。電化學/生物傳感器由于其獨特的優(yōu)勢，如能在渾濁溶液中操作、選擇性好、靈 敏度高等,在各類傳感器中占著重要的地位。其所測的信號通常是電位、電流、電 阻等的變化，可以直接測量，便于儀器自動化、小型化和智能化。近年來，應用各種電 化學/生物傳感器快速檢測大腸桿菌的方法紛紛發(fā)展起來 7,1112。1大腸桿菌及其生物學特性大腸埃希氏菌簡稱大腸桿菌，分類于腸桿菌科、埃希氏菌屬，革蘭氏染色陰性直桿菌，因德國的細菌學家Theodor Escherich 在1885年首次分離出來而得名13。大腸桿菌是兩端鈍圓的短桿菌（如圖1,長約 2.03.0以況約0.5 m mt時近似球菌

8、。大部分大腸桿菌通常沒有致病性，但是部分能產生腸毒素，導致人體腸胃炎等疾 病14。特別是O157型的大腸桿菌會引起腹瀉、出血性大腸炎和溶血尿毒癥等疾 病。當它入侵到腸道外的其它組織器官時，會引起尿道炎、膀胱炎、闌尾炎等，對于 免疫力下降的病人還可引起敗血癥。大腸桿菌的致病物質包括侵襲力、內毒素和腸 毒素，侵襲力則包含有K抗原和定居因子。K抗原具有抗吞噬、抵抗抗體和補體的 作用。定居因子也稱粘附素，目前已證實致瀉大腸桿菌的定居因子是一種特殊菌 毛。含有內毒素的大腸桿菌的細胞壁內具有內毒素活性，脂多糖層的脂類A是其毒性部位。大腸桿菌的腸毒素是某些大腸桿菌在生長繁殖過程中釋放出來的外毒素，這些菌株稱

9、為產毒性大腸桿菌。大腸桿菌是人及各種動物腸道中的正常寄居菌，常隨糞便從人和動物體內排出， 廣泛傳播于自然界，所以環(huán)境中一旦檢出有大腸桿菌的存在，則意味著直接或間接地 被糞便污染了 ；并且由于大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道病原菌相近 ，它的 出現(xiàn)也可能預示著某些腸道病原菌（如沙門氏菌和志賀氏菌等的存在。因此，從19 世紀末大腸桿菌被發(fā)現(xiàn)時，就開始被廣泛用作飲用水、牛奶或食品等的糞源性污染 衛(wèi)生學指標，在環(huán)境學上也被廣泛用作各種水體的細菌學指標 15 o2電化學/生物傳感器檢測大腸桿菌的進展2.1電流型化學/生物傳感器檢測大腸桿菌電流法（又稱安培法是電化學傳感器最常采用的一種檢測方法。它的檢

10、測原理是當工作電極的電位設定在一定值時，被測物直接或者間接的在電極表面產生電流，從而可以定量分析被測物。大腸桿菌本 身在電極表面不能直接進行電子傳遞。因此，需要氧化還原介質，根據氧化還原介質 產生的電流大小與大腸桿菌的濃度成一定的關系，間接地檢測大腸桿菌。該文課題組制備了新型納米二氧化錫電極，用該電極作為工作電極，采用計時電 流法對水體中大腸桿菌進行了快速計數(shù)研究16。由于水分子在納米二氧化錫電極表面電解產生的 OH能夠引起大腸桿菌細胞膜脂質過氧 化,從而在電極上產生氧化電流，根據氧化電流變化與大腸桿菌數(shù)量的關系，實現(xiàn)了對 大腸桿菌快速檢測 檢測限可達1X103cfu/mL。止匕外，通過大腸桿

11、菌脂質過氧化后丙 二醛含量的檢測，對大腸桿菌在納米二氧化錫電極上的電化學響應機理進行了初步 的探討。該文課題組制備物納米修飾電極，用于流動注射法快速安培檢測大腸桿菌17 o 在培養(yǎng)過程中大腸桿菌產生葡萄糖醛酸酶，該酶與底物反應后產生4-硝基酚。鈿納 米修飾電極對4-硝基酚具有較高的靈敏度，產生的電流響應與細菌的濃度成正比，從 而實現(xiàn)了大腸桿菌的快速檢測。大腸桿菌濃度在1994-2010Academic Journal Electronic Publishing House.1.5 1021M06cfu/mL 與電流響應圖1大腸桿菌的透射電鏡圖Fig.lTEM image of E.coli化學

12、傳感器29卷4成正比，檢測限達100cfu/mL,總分析時間為3h。該文課題組還制備了多種化學/生物傳感器，并基于檢測半乳糖甘酶的活性來快 速檢測水體中的大腸菌群1821。例如，課題組基于Fe3O4磁性納米顆粒-碳納米管 復合材料構筑了一種新型的酪氨酸酶生物傳感器，并將其應用于大腸菌群的快速檢 測20。細菌產生的半乳糖甘酶與底物苯基-&D-叱喃半乳糖甘反應產生苯酚，然后， 采用酪氨酸酶生物傳感器快速檢測苯酚。大腸桿菌的濃度在2X1011X105cfu/mL范圍內與電流響應呈良好的線性關系，具檢測限可達10cfu/mL。電化學阻抗譜是一種研究導電材料以及界面性質的有效手段，已經被廣泛應用

13、于電化學傳感器的開發(fā)。對于一個阻抗特性的傳感器，其電容、電感和電阻特性的 組合會產生一個特定的阻抗信號；如果傳感器周圍環(huán)境發(fā)生變化引起上述特性的任 何變化，都會造成阻抗的改變，將得到一系列新的阻抗特性，這就是基于電化學阻抗技 術的傳感器的研究基礎。電化學阻抗生物傳感器用于細菌的快速檢測具有較好的選擇性，而且與其它的 電化學方法相比，這種方法不需要標志物，簡化了傳感器的制備。Li領導的工作小組 在電化學阻抗技術檢測大腸桿菌方面已取得很多優(yōu)秀的成果2225 o如他們制備了無標志物的叉指微電極阻抗傳感器用于檢測大腸桿菌O15722,細菌吸附于ITO微電極表面，從而導致了電極阻抗發(fā)生變化，大腸桿菌的濃

14、度在4.36 X05到 4.36 108cfu/mL范圍內與阻抗的變化值成正比。止匕外，他們把金叉指電極固定于微 流動裝置里，采用納米磁珠分離牛肉中的大腸桿菌，將分離出的細菌溶液注入微流動 裝置里，通過檢測電極交流阻抗的變化來測定大腸桿菌的濃度，能在35min內檢測出160cfu/mL 大腸桿菌23 o該文課題組在金電極表面組裝了琉基乙酸，通過碳二亞酰胺法把大腸桿菌抗體 固定在金電極表面，從而制備一種新型的電化學阻抗免疫傳感器 26。把Fe(CN63- /Fe(CN64-作為氧化還原探針，考察了大腸桿菌特異性吸附到該免疫傳感器引起的阻 抗變化值，實現(xiàn)了對大腸桿菌的快速檢測。并把該生物傳感器應用

15、于河水樣品的檢 測,最低能檢測出50cfu/mL的大腸桿菌。電化學阻抗生物傳感器具有容易制備、成本低、易于封裝和快速等特點，因此在食品的微生物檢測中具有良好的前景。盡管如此，阻抗傳感器的檢測限與傳統(tǒng)方 法相比仍比較高，而且及樣品的分析系統(tǒng)還不夠完善，因此需要大量的工作使這種技 術更加成熟。2.3DNA電化學生物傳感器應用于大腸桿菌的檢測近年來，各種靈敏的DNA或RNA電化學生物傳感器已廣泛應用于環(huán)境中細 菌、病毒和各種化學物質的檢測2731。DNA生物傳感器設計的依據就是核酸雜交動力學，因此確切來說它該是核酸雜交生物傳感器的簡稱。DNA電化學生物傳感器是DNA生物傳感器中的一種，是由固定了單鏈

16、DNA(ssDNA的電極和電化學活性 識別元素構成。為了提高雜交的專一性，ssDNA片段長度范圍一般從十幾個堿基到 幾十個堿基，通常采用人工合成的短的寡聚脫氧核甘酸，其堿基序列與樣品中的靶序 列互補。首先將ssDNA片段固定到電極表面，在適當?shù)臏囟取H值和離子強度條 件下同定在電極上的ssDNA與雜交緩沖溶液中的靶基因發(fā)生選擇性雜交反應。如 果樣品中的DNA片段出現(xiàn)不互補的堿基，在電極表面就不能形成雙鏈雜交分子 (dsDNA;如果樣品中含有完全互補DNA片段，則在電極表面形成dsDNA,從而導致 電極表面結構的變化，然后通過檢測電極表面的電活性識別元素的電信號 ，達到識別 和測定靶基因的目的

17、。每個種屬生物體內都含有其獨特的核酸序列，因此檢測核酸關鍵是設計一段寡 核甘酸探針，探針一般由1030個堿基對組成，是一段單鏈核酸分子，能夠專一地與特 定靶序列進行雜交32,從而檢測出特定的生物種屬。雜交過程具有很高的特異性和 敏感性，這是核酸檢測研究的基礎，也是設計DNA生物傳感器首要和基本的條件。 把DNA電化學生物傳感器應用于大腸桿菌的檢測已有很多文獻報道3335。Baeumner等33制備DNA生物傳感器能在1520min內快速、靈敏地檢測 DNA的 濃度;通過檢測大腸桿菌提取和純化后的 DNA濃度，對水體中大腸桿菌的濃度進行 定量檢測，檢測限可達40cfu/mL。Arora等35程欲

18、曉等：電化學/生物傳感器快速檢測大腸桿菌的研究進展1期5制備了生物親和素聚苯胺修飾鋁電極，并且把帶有生物素的DNA探針通過親和 素-生物素系統(tǒng)的作用力固定于聚苯胺修飾電極上。首先將大腸桿菌經過超聲后把 目標DNA片段提取出來，然后把亞甲基藍作為指示劑、采用聚苯胺 DNA傳感器來 檢測大腸桿菌溶液的互補 DNA片段，在14min內能檢測出11cfu/mL的大腸桿菌。微生物在加入一定氧化還原介質后，能把代謝過程中產生的一些物質轉化成電 信號。目前，已報道許多電化學傳感器根據檢測代謝產物來對微生物進行快速分析 3642。這些技術都是基于直接檢測電化學傳感器上的一些物理量的變化來檢測 細菌的，例如pH

19、、耗氧量、離子濃度、電壓和電阻等電參量的變化。Fidel等43在大腸菌群溶液中加入兩種還原的介質(K3Fe(CN6和2,6- dichlorophenolindophe-nol,大腸桿菌在代謝過程中產生葡萄糖脫氫酶可以還原這兩 種介質，通過流動注射分析法檢測兩種介質在細菌代謝過程中電流響應的變化值從 而檢測大腸桿菌。這種方法檢測時間需2h,檢測限可達1.0M05cfu/mL。大腸桿菌在代謝過程中能夠產生過氧化氫酶44,該酶可以分解過氧化氫。Sippy等人45采 用Clark型的電化學傳感器檢測大腸桿菌代謝過程中消耗過氧化氫的量，可以快速檢 測出2.0 M012.0X07cfu/mL范圍內的大腸

20、桿菌。此外，大腸桿菌在有氧代謝的情況中加入水楊酸后可產生多元酚。該文課題組 46制備了雙酶電化學生物傳感器用于檢測多元酚的濃度，檢測所得的電流信號與大腸桿菌的濃度在1.6X03 1.0 107cfu/mL范圍內成線性關系，檢測過程需3 h,最低檢 測限達1000cfu/mL。基于微生物代謝產物檢測大腸桿菌的方法快速、方便，但尚存在靈敏度低、選擇性差等缺點。3展望電化學/生物傳感器所需要的儀器簡便，操作簡單，容易實現(xiàn)微型化，因此在大腸 桿菌的快速檢測中具有廣闊的應用前景。但是，要對這些檢測大腸桿菌的傳感器進 行商業(yè)化還存在一些應用上和技術上的難度。首先，要求傳感器對樣品的細菌具有選擇性，且檢測的

21、速度快，細菌不需要預培養(yǎng)。此外，在分析實際樣品中需要很高的檢 測靈敏度，比如說飲用水的國家標準是每1L飲用水不得檢出超過3個大腸桿菌。因 此,就要求制備的電化學/生物傳感器的靈敏度達3cfu/L,且檢測的耗費比較低，這樣的 傳感器才有商業(yè)化的價值。這些都是有待今后要進一步研究解決的問題。參考文獻1Altekruse S F,Cohen M L,Sherdlow D L.EmergingFoodborne DiseasesJ.Emerg.Infect.Dis.,1997,3(3: 285293.2Wang J,Rivas J,Cai X.Screen-printed electrochemica

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