懷化醫(yī)專《微生物學檢驗》教案 編號

1、 懷化醫(yī)專微生物學檢驗教案 編號：2010年上學期授課教師桂 芳教研室主任審核簽名李爭鳴教學課題厭氧性細菌及檢驗課時授課時間月 日 月 日 月 日 月 日 月 日 月 日2星期星期星期星期星期星期授課對象檢驗專業(yè)班級目的要求【掌握】厭氧菌的種類，常見有芽胞和無芽胞厭氧細菌的生物學特性和微生物學檢查法?！臼煜ぁ繀捬蹙谡Ｈ梭w的分布和感染情況，厭氧菌感染的臨床及細菌學指針。教學重點及難點重點： 1、厭氧菌的特點及分類2、厭氧性細菌的微生物學檢驗3、主要厭氧芽胞羧菌的生物學特性及微生物學檢驗4、各種無芽胞厭氧菌的鑒別難點： 厭氧菌的微生物學檢驗法。教法與學法講授法、比較、歸納課型理論課教學手段多媒

2、體教學內容與時間分配1、概述 (5min)2、厭氧性細菌的微生物學檢驗（25min）3、厭氧芽胞梭菌：破傷風梭菌、產氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌。（40min）4、革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌 （10min）5、革蘭陽性無芽胞厭氧桿菌 （10min）6、厭氧性球菌 （10min）復習思考題厭氧性細菌檢驗的標本采集應注意哪些問題？參考資料1、張卓然主編 臨床微生物學與微生物檢驗人衛(wèi)出版社 第3版 2006.112、倪語星主編 臨床微生物學與檢驗 人衛(wèi)生出版社 第4版， 2007年3、李凡主編 醫(yī)學微生物學 人衛(wèi)出版社 第7版 2008.1自評本次課講解條理清楚，重點突出，難點分析透徹，多媒體課件使用

3、效果較好。厭氧性細菌及檢驗(anaerobic bacteria)第一節(jié) 概 述厭氧性細菌指一群必須在無氧條件下才能生長繁殖的細菌。一、厭氧菌的分類 分為兩類：（P285表）一類為有芽胞厭氧菌，只有一個屬，即梭菌屬，共有130個種。以芽胞形式存于體外。 另一類為無芽胞厭氧菌，包括40多個屬，300多個菌種和亞種；多為體內正常菌群，存在于皮膚、口腔、上呼吸道、腸道和泌尿生殖道。易引起這些部位的內源性感染，而不易診斷。 二、厭氧菌感染 （占臨床感染的60%）（一）厭氧菌在正常人體的分布厭氧菌與需氧菌一起組成了人體的正常菌群。人體許多部位厭氧菌在種類和數量上遠多于需氧菌，如在結腸中99%的細菌都是厭

4、氧菌。臨床厭氧菌感染中，由正常菌群的無芽胞厭氧菌的感染最為多見。（二）厭氧菌感染的原因 1. 局部組織的氧化還原電勢降低 如血管損傷、燒傷、動脈硬化、腫瘤壓迫、組織壞死等，可造成局部組織的缺血、缺氧，使E降低；此外，大面積外傷伴有需氧菌感染消耗了氧，為厭氧菌感染提供了條件。 2 . 機體免疫功能下降如接受免疫抑制劑、放療或化療的患者；糖尿病、慢性肝、腎疾病病人及老人、嬰幼兒、早產兒等，因免疫力下降易併發(fā)厭氧菌感染。3. 機體局部屏障破壞，使厭氧菌進入周圍組織和血液引起感染。（三）厭氧菌感染的臨床及細菌學指征1.局部有氣體產生為重要指征之一 2.發(fā)生在粘膜附近的感染 3.深部外傷 4.有特殊的分

5、泌物如有惡臭，暗紅血色或在紫外光下發(fā)出紅色熒光。如分泌物或膿汁中有硫磺顆粒即為放線菌感染。5.某些抗生素治療無效的感染。 6.細菌形態(tài)培養(yǎng)有特征性變化 如革蘭染色著色不均、形態(tài)奇特、呈明顯多形性；或鏡檢查見細菌而需氧培養(yǎng)為陰性者。第二節(jié) 厭氧菌的微生物學檢驗一、標本的采集與運送（一）標本采集標本種類：血液、關節(jié)液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液等體液；深部膿腫滲出液、肺部滲出液、其他組織穿刺液。厭氧菌培養(yǎng)最好的標本是組織標本，厭氧菌在其中更易生長。 采集注意事項：避免正常菌群污染，盡量避免接觸空氣。有些標本如鼻咽拭子、痰液、流出的膿液、陰道分泌物、糞便等因含大量的正常菌群，故不宜作厭氧菌培養(yǎng)。采集

6、方法：采取深部的組織標本：需經碘酒消毒皮膚后，用注射器插入病變部位深部，抽取數毫升后，棄去一滴于酒精棉球上。（不同標本采集見P291表）（二）標本的運送與處理 注意盡快送檢，避免干燥，避免接觸空氣1. 針筒運送法 適宜液體標本。標本抽取后排盡空氣，并將針頭插入無菌橡皮塞中即可送檢。2. 無氧小瓶運送法 常用于少量膿液標本的運送。用無菌青霉素小瓶，瓶內裝入0.5的心腦浸液(含有0.0003%的刃天青-氧化還原指示劑),加橡皮塞后,鋁蓋密封，真空泵抽出瓶中空氣，充入N2，連續(xù)充抽3次，最后充以CO2，高壓滅菌備用。如有氧滲入小瓶，培養(yǎng)基則顯粉紅色，應棄去。運送時挑選無色小瓶，將標本用無菌注射器注入

7、瓶中即可。 3. 標本充盈法送檢 適宜于大量液體標本運送。將液體標本裝滿標本瓶，加蓋密封，可驅除瓶中空氣。 4. 組織塊運送法 將組織塊放在密封的厭氧罐中運送。罐內放入經酸化硫酸銅浸泡過的鋼絲絨，其表面即有金屬銅，具強還原性，能迅速吸氧，造成厭氧罐中無氧狀態(tài)。5. 厭氧袋運送法6. 棉拭運送法 （略）應在2030min內處理完畢，最遲不超過2h，防止標本中兼性厭氧菌過度生長，抑制厭氧菌的生長。如不能及時接種，應將標本保存于室溫（因冷藏對厭氧菌有害）。二、檢驗程序三、檢驗方法（一）肉眼觀察 應觀察標本的性狀，如是否為膿性、帶血，有無黑色壞死組織或黑色分泌物，有無硫磺樣顆?；驉撼魵馕兜?。這些有助于

8、厭氧菌的鑒定和培養(yǎng)基的選擇。（二）直接鏡檢 在接種前除血液外，各種臨床標本均需直接涂片染色、鏡檢，以了解標本中細菌的數量、形態(tài)及染色性，便于選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，還可驗證培養(yǎng)結果的成功與失敗。（三）分離培養(yǎng)1、初代培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基的選擇：1）非選擇培養(yǎng)基以牛心腦浸液及布氏肉湯為基礎，補充0.5%酵母浸出液，5g/ml氯化血紅素、10 g/ml維生素K1及5%10%的脫纖維血的強化血平板。2）選擇培養(yǎng)基常用的有: 七葉苷膽汁平板（BBE，用于脆脆弱類桿菌） 卡那萬古凍溶血平板（KVLB，可抑制大多數兼性厭氧菌，使產黑色素普雷沃菌早期產生黑色素）FS培養(yǎng)基（梭桿菌選擇培養(yǎng)基） VS培養(yǎng)基（韋

9、榮球菌選擇培養(yǎng)基） CCFA培養(yǎng)基（艱難梭菌）上述培養(yǎng)基使用注意：盡量使用新鮮培養(yǎng)基，2 4內用完；使用前放入無氧環(huán)境，預還原處理24 48；也可采用預還原滅菌法制備的培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基應煮沸10min，驅除溶解氧，并迅速冷卻，立即接種。（2）標本接種 初代培養(yǎng)應同時接種固體和液體兩種培養(yǎng)基，且每份標本應同時接種3個平板，分別置有氧、無氧和含510%CO2環(huán)境培養(yǎng)。 如只要求厭氧培養(yǎng)，只需種一個厭氧血平板，并將其分為三個區(qū)，在第一、二區(qū)交界處貼放一枚滅滴靈，如紙片周圍出現抑菌圈，表明有厭氧菌存在。（3）培養(yǎng)方法 原理是通過物理、化學或生物學等方法，創(chuàng)造一種無氧的環(huán)境。1）厭氧罐培養(yǎng)法：即利用物

10、理或化學的方法在一個密閉的罐子里造成無氧的環(huán)境。有抽氣換氣法和冷觸媒法。 抽氣換氣法：將種好的培養(yǎng)基放于罐內，放入經烘烤的催化劑（鈀粒）盤，蓋子擰緊。通過罐蓋上的三通管，用真空泵抽盡罐內空氣，再用N2反復充氣與抽氣3次，最后充入含80%N2、10%H2、10% CO2的混合氣體。 鈀粒用過既失活，再次使用前需將其加熱至灼紅。如此反復使用： 2H2+O2 2H2O 冷觸媒法： 利用化學方法產生H2和CO2，產生的H2在觸媒的作用下，與罐內的氧結合生成水，將氧消耗掉，造成無氧環(huán)境。使用時同抽氣換氣法將鈀粒和接種好的平板放于厭氧罐內，然后將配套的氣體發(fā)生袋剪去一角，加入10ml 水，立即放于罐內，密

11、封厭氧罐即可。 2) 厭氧氣袋法： 原理與冷觸媒法相同，只是用無毒的塑料薄膜制成的特殊氣袋取代厭氧罐。 優(yōu)點：簡便易行，攜帶方便，尤適宜于床邊接種，和基層醫(yī)院使用。3）厭氧手套箱：為國際公認的厭氧菌培養(yǎng)的最佳設備。為一個密閉的大型金屬箱，由手套操作箱和傳遞箱兩個部分組成，操作箱內還附有小型恒溫培養(yǎng)箱，通過自動化裝置自動抽氣、換氣，保持箱內的厭氧狀態(tài)。 優(yōu)點：因接種、培養(yǎng)和鑒定等都是在無氧狀態(tài)下進行，提高了檢驗的陽性率；缺點：設備昂貴，耗氣。4)皰肉培養(yǎng)法：肉渣加適量液體培養(yǎng)基，表面蓋以凡士林。肉渣含不飽和脂肪酸，可吸收氧，并含谷光甘肽，可降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢。 適用于所有厭氧菌的培養(yǎng)和菌種

12、保存(4)結果觀察厭氧菌的初代培養(yǎng)生長較慢，故應在48后才能初步觀察，如疑為放線菌則應延長至7296。 觀察時應注意：厭氧菌在對數生長期對氧非常敏感，故在培養(yǎng)的48不應使細菌暴露于空氣中；標本鏡檢陽性，但培養(yǎng)48卻無菌生長，應繼續(xù)培養(yǎng)57。2. 次代培養(yǎng)和厭氧菌的確定初代厭氧培養(yǎng)有細菌生長時，需做耐氧試驗，確定是否為厭氧菌。方法是：從每個平板上挑取45個不同性狀的菌落，每個菌落分別接種3個平板（每個平板分46個區(qū)，可同時做46個菌落的次代培養(yǎng)）。分別放有氧、無氧和含5%10%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48，如只在厭氧環(huán)境中生長的細菌，即為厭氧菌。四、鑒定試驗初步鑒定：菌體形態(tài)、染色反應、菌落性狀、對某些

13、抗生素的敏感性；最后鑒定：依據生化反應和終末代謝產物。1. 形態(tài)與染色：對其鑒定較為重要。2. 菌落性狀：包括其形態(tài)、大小、色素、熒光及溶血等。（1）色素：產黑色素普雷沃菌、不解糖紫單胞菌210天黑色素 齲齒放線菌 34天粉紅色色素 奈氏放線菌 培養(yǎng)時間延長 黃褐色（2）溶血： 產氣莢膜芽胞梭菌 血平板）形成雙溶血環(huán)（3）熒光： 產黑色素普雷沃菌、不解糖紫單胞菌某些株在紫外線照射下紅色熒光梭桿菌黃綠色熒光；艱難梭菌綠色熒光3. 抗生素敏感鑒定試驗常用抗生素：卡那霉素、萬古霉素、多黏菌素；一般抑菌環(huán)直徑10mm為耐藥。 分梭桿菌屬對卡那霉素（敏感）類桿菌（多數不敏感） 革蘭陽性厭氧菌對萬古霉素（

14、敏感），對黏菌素耐藥。4. 聚茴香腦磺酸鈉（SPS）敏感試驗 用于鑒定厭氧消化鏈球菌（特別敏感）。5. 生化試驗 糖發(fā)酵、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸媒試驗等?？捎米詣游⑸镨b定系統(tǒng)如：VITEK-ANT Microscan-ANI等； 胞外酶快速鑒定試驗：利用厭氧菌產生的酶，與少量的生化基質反應，不需培養(yǎng)，只需濃菌液即可，4小時可觀察結果。6. 氣液相色譜技術第三節(jié) 厭氧芽胞梭菌屬（Clostridium）簡稱梭菌屬，又稱厭氧芽胞桿菌，革蘭氏染色陽性，都能產生芽胞，芽胞直徑大多比菌體寬，使菌體膨大成梭形，故得名。芽胞的形狀和位置在鑒別上有意義。除產氣莢膜梭菌外，均無莢膜。大多數為嚴格厭氧；能

15、產生多種外毒素和侵襲性酶，致病性強。本屬細菌主要包括破傷風桿菌、產氣莢膜桿菌、肉毒桿菌等。一、破傷風梭菌（Clostridium tetani）是引起破傷風的病原菌，大量存在于人和動物腸道中，由糞便污染土壤，經傷口感染引起疾病。（一）生物學性狀1、形態(tài)：菌體細長，有周身鞭毛，芽胞呈圓形，位于菌體頂端，比菌體寬大，似鼓槌狀，是本菌形態(tài)上的特征。繁殖體為革蘭氏陽性，帶上芽胞的菌體易轉為革蘭氏陰性。2、培養(yǎng)特性：為專性厭氧菌，營養(yǎng)要求不高。血平板：呈移行生長，菌落：d24mm，扁平，半透明，灰白色，邊緣不齊，周邊呈羽毛狀，有溶血。在普通瓊脂平板上培養(yǎng)2448小時后，可形成直徑1mm 以上不規(guī)則的菌落

16、，中心緊密，周邊疏松，似羽毛狀菌落，易在培養(yǎng)基表面遷徒擴散。在皰肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)，肉湯渾濁，肉渣部分被消化，微變黑，產生氣體，生成甲基硫醇（有腐敗臭味）及硫化氫。3、生化反應：一般不發(fā)酵糖類，能液化明膠，產生硫化氫，形成吲哚，不能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。對蛋白質有微弱消化作用。 4、抵抗力：本菌繁殖體抵抗力與其他細菌相似，但芽胞抵抗力強大。在土壤中可存活數十年，能耐煮沸4050分鐘。對青霉素敏感，磺胺類有抑菌作用。（二）致病性1、致病條件：由傷口侵入人體，一般傷口中不能生長，傷口的厭氧環(huán)境是破傷風梭菌感染的重要條件。窄而深的傷口（如剌傷），有泥土或異物污染，或大面積創(chuàng)傷、燒傷、壞死組織多，局部組織

17、缺血或同時有需氧菌或兼性厭氧菌混合感染，均易造成厭氧環(huán)境，局部氧化還原電勢降低。有利于破傷風桿菌生長。2、致病因素：產生強烈的外毒素，即破傷風痙攣毒素（Tetanospasmin）或稱神經毒素 (Neurotoxin)。為蛋白質，不耐熱，可被腸道蛋白酶破壞，故口服毒素不起作用。毒性非常強烈，僅次于肉毒毒素。毒素能與神經組織中的神經節(jié)苷脂結合，封閉了脊髓抑制性突觸末端，阻止釋放抑制沖動的傳遞介質甘氨酸和氨基丁酸，從而破壞上下神經原之間的正常抑制性沖動的傳遞，導致超反射反應（興奮性異常增高）和橫紋肌痙攣。3、癥狀：破傷風潛伏期不定，平均714天。潛伏期越短，病死率越高。發(fā)病早期有發(fā)熱、頭痛、不適、

18、肌肉酸痛等前驅癥狀，局部肌肉抽搐，出現張口困難，咀嚼肌痙攣，患者牙關緊閉，呈苦笑面容。繼而頸部、軀干和四肢肌肉發(fā)生強直收縮，身體呈角弓反張，面部紫鉗、呼吸困難，最后可因窒息而死。病死率約50%，新生兒和老年人尤高。新生兒破傷風（俗稱臍風）尤為常見。（三）微生物學檢查破傷風梭菌分布廣泛，如果病人無臨床癥狀，即使傷口找到破傷風梭菌也不能作為診斷的依據。故破傷風的診斷主要根據有無創(chuàng)傷病史和臨床癥狀，一般不需要作微生物檢驗，僅在必要時才進行檢驗。（四）特異防治破傷風一旦發(fā)病，治療困難，應以預防為主。1人工自動免疫 對戰(zhàn)士、建筑工人等接種吸附精制破傷風類毒素全程基礎免疫，以刺激機體自動產生抗毒素。兒童則

19、注射白喉、破傷風類毒素混合制劑。當受傷后有可能感染時，應加強免疫一次吸附精制破傷風類毒素。2人工被動免疫（1）緊急預防 如遇嚴重污染創(chuàng)傷或受傷前未經全程基礎免疫者，除用類毒素加強免疫外，可再注射破傷風抗毒素（Tetanus antitoxin,TAT）。即在一臂注射抗毒素，另一臂注射類毒素，612周后再注射一針類毒素。實踐證明，同時注射抗毒素和類毒素，預防效果好，（2）特異治療 一旦發(fā)現病人，應立即注射破傷風抗毒素，要早期足量，每次可肌肉或靜脈注射610萬單位，注射前必須作皮膚試驗，防止馬抗毒素血清過敏性休克的發(fā)生。大劑量的青毒素（或四環(huán)毒）能有效地抑制破傷風梭菌在局部病灶中繁殖，并且對混合感

20、染的其他細菌也有作用，故亦可用于治療。二、產氣莢膜梭菌（Cl.perfringens）是氣性壞疽的主要病原菌。與破傷風梭菌不同，除具有外毒素外，還有多種侵襲性酶及莢膜構成強大的侵襲力，因此入侵創(chuàng)口后造成嚴重局部感染及全身中毒因局部組織出現壞死、水腫、產氣，臨床稱為氣性壞疽。氣性壞疽是戰(zhàn)時多見的一種嚴重的創(chuàng)傷感染，以局部水腫、產氣、肌肉壞死及全身中毒為特征。病原菌約有69種之多，常為混合感染。以產氣莢膜梭菌為最多見（約占6090%），其次是水腫梭菌和敗毒梭菌，其他還有產芽胞梭菌、溶組織梭菌和雙酶酸菌等。（一）生物學性狀1、形態(tài)染色： G+大桿菌，芽胞卵圓形，位于菌體次極端，不大于菌體寬度。有莢膜

21、。無鞭毛2、培養(yǎng)特性： 專性厭氧。 血平板：菌落較大、灰白色、不透明，邊緣呈鋸齒狀，多數菌株有雙層溶血環(huán)。內環(huán)是毒素的作用，而外環(huán)不完全溶血是a毒素所致。 皰肉培養(yǎng)基：不消化肉渣，有時呈肉紅色。牛乳培養(yǎng)基：分解乳糖可使酪蛋白凝固，同時產生大量氣體，沖破凝固的酪蛋白，可將覆蓋在培養(yǎng)基上層的凡士林沖至試管頂部，甚至沖開管口棉塞，氣勢洶猛，稱為“洶涌發(fā)酵”。、生化反應能分解多種糖類，如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，產酸產氣，不發(fā)酵甘露糖或水楊苷，能液化明膠，產生硫化氫，不能消化已凝固的蛋白質和血清。（二）致病性1、致病物質致病條件與破風梭菌相似。既能產生強烈的外毒素，又有多種侵襲性酶，并有莢膜，構成其

22、強大的侵襲力。毒素種類多，外毒素有、等12種，具多種毒性酶，如卵磷脂酶、纖維蛋白酶、透明質酸酶、膠原酶和DNA酶等，構成強大的侵襲力。在各種毒素和酶中，以毒素最為重要，毒素是一種卵磷脂酶，能分解卵磷脂，人和動物的細胞膜是磷脂和蛋白質的復合物，可被卵磷脂酶所破壞，故毒素能損傷多種細胞的細胞膜，引起溶血、組織壞死，血管內皮細胞損傷，使血管通透性增高，造成水腫。此外，毒素有溶血和破壞白血球的作用，膠原酶能分解肌肉和皮下的膠原組織，使組織崩解，透明質酸酶能分解細胞間質透明質酸，有利于病變擴散。2、臨床表現（1）氣性壞疽 以局部劇痛、水腫、脹氣、組織迅速壞死、分泌物惡臭，以伴有全身毒血癥為特征的急性感染

23、。潛伏期較短，一般只有848小時。由于本菌分解組織中的肌糖，產生大量氣體充塞組織間隙，造成氣腫，擠壓軟組織，阻礙血液循環(huán)，進一步促使肌肉壞死。同時毒素還可引起血管壁通透性增高，漿液滲出，形成擴散性水腫，以手觸壓腫脹組織可發(fā)生“捻發(fā)音”。疼痛劇烈，蔓延迅速，最后形成大塊組織壞死。細菌一般不侵入血流，局部細菌繁殖產生的各種毒素以及組織壞死產生的毒性物質被吸收入血，引起毒血癥而死。（2）食物中毒（3）急性壞死性腸炎（三）微生物學檢驗發(fā)病急劇，后果嚴重，及早診斷甚為重要。由于本菌分布廣泛，所以單憑創(chuàng)口發(fā)現此菌還不足以診斷。尚需結合臨床表現，才能確診。1直接涂片鏡檢 從傷口深部取材涂片，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陽性大桿菌，并有莢膜，常伴有其他雜菌，白細胞甚少，形態(tài)不規(guī)則，這是氣性壞疽標本涂片的特點。2分離培養(yǎng)與鑒定 取壞死組織制成懸液，接種于血平板上或皰肉培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，觀察生長情況。取細菌培養(yǎng)物涂片鏡檢，并進一步用生化反應鑒定。3動物實驗 取培養(yǎng)液0.51ml給