口腔癌患者外周血樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性

1、口腔癌患者外周血樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性                             作者：張素欣，王士杰，單保恩，段玉芹，許艷枝 【關(guān)鍵詞】  口腔腫瘤;樹突狀細(xì)胞;表型；增殖 Biological characteristics of monocytederived dendritic cells

2、 from peripheral blood of patients with oral carcinoma 【Abstract】 AIM: To investigate the morphology, phenotype and functions of dendritic cell (DC) from peripheral blood of the healthy individuals and the patients with oral carcinoma. METHODS: Fifteen patients with oral carcinoma at stages of II or

3、 above were assigned to study group and 15  healthy volunteers to control group. Monocytes were isolated by density centrifugation, and cultured in the presence of GMCSF, IL4 and TNF for 7 d in vitro. The morphological change of the cultured cells was observed by light microscopy and electron m

4、icroscopy. The expressions of CD83, CD1a, CD86, CD80, HLADR were analyzed by flow cytometry. The ability of DC to stimulate the proliferation of lymphocyte in mixed lymphocyte reactions (MLR) was determined with the method of MTT. RESULTS: Morphologically and phenotypically typical DC was obtained i

5、n the 2 groups after culture for 7 d. The expression rates of CD83, CD1a on DC from the patients were 49.3±9.5 and 48.1±7.3 respectively，significantly lower than those from healthy volunteers (P<0.05). The DC from the patients had the lower expression levels of CD86, CD80 and HLADR (85.

6、5±8.7, 83.2±8.1 and 78.3±5.4) than healthy volunteers did (89.2±6.7, 87.7±7.2 and 82.3±4.1), but not significantly (P>0.05). Moreover, the mean fluorescence intensity of CD83, CD1a, CD80, CD86 and HLADR expressed in study group were 4.80±2.13, 3.96±1.15, 19

7、.63±8.12, 12.33±6.75 and 39.44±7.9, respectively, which were lower but not statistically different from the control group (P>0.05). In addition, DC from the study group had the ability to stimulate the proliferation of allogeneic and autogenous lymphocytes in vitro. CONCLUSION: Mon

8、ocytes in peripheral blood of the patients with oral carcinoma can be induced to differentiate into mature DC with the ability to stimulate the proliferation of lymphocytes, and so these DC might be used in immunotherapy for oral carcinoma. 【Keywords】 mouth neoplasms; dendritic cell; phenotyping; pr

9、oliferation 【摘要】 目的: 研究口腔癌患者外周血樹突狀細(xì)胞(DC)的形態(tài)、表型和功能性變化及其臨床意義. 方法： 口腔癌患者（實(shí)驗(yàn)組）及正常人（對照組）15例外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)GMCSF,IL4及TNF誘導(dǎo)培養(yǎng), 獲取成熟DC, 光鏡和電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLADR等分子的表達(dá)變化，用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測DC與自體和同種異體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中對淋巴細(xì)胞增殖的刺激能力. 結(jié)果： 正常人及口腔癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外7 d誘導(dǎo)培養(yǎng)，均誘導(dǎo)出具有典型形態(tài)和表型的DC,其中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的CD83，CD1a表

10、達(dá)率分別為49.3±9.5和48.1±7.3，與對照組兩者表達(dá)率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CD86，CD80和HLADR的表達(dá)率分別為85.5±8.7，83.2±8.1和78.3±5.4，與對照組三者表達(dá)率89.2±6.7，87.7±7.2和82.3±4.1相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組DC細(xì)胞CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表達(dá)的平均熒光指數(shù)(MFI)分別為4.80±2.13，3.96

11、7;1.15，12.33±6.75，19.63±8.12和39.44±7.9， 均低于對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);口腔癌患者來源的DC在體外具有誘導(dǎo)同種異體和自體外周血T細(xì)胞增殖的能力. 結(jié)論： 口腔癌患者外周血單核細(xì)胞來源可誘導(dǎo)成為具有功能性的成熟DC，該細(xì)胞可應(yīng)用于口腔癌的免疫治療. 【關(guān)鍵詞】 口腔腫瘤;樹突狀細(xì)胞;表型；增殖 0引言 目前，對口腔癌的治療手段仍以手術(shù)為主，由于頜面部能提供的切除面積有限，有時(shí)很難實(shí)現(xiàn)距腫瘤邊緣1.5 cm清除病灶，而且手術(shù)本身造成的面部畸形嚴(yán)重破壞了患者的口腔功能和心理健康. 因此，如何縮小手術(shù)范圍、有

12、效控制臨近亞病灶及微小病灶的發(fā)展是亟待解決的問題. 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC）是已知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，并被認(rèn)為是抗腫瘤免疫治療的一種非常有前途的方法1-3，由于DC對T細(xì)胞的活化受MHC限制，故臨床應(yīng)用的DC細(xì)胞及其疫苗必須使用腫瘤患者自身來源的DC，那么從腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中能否經(jīng)過體外誘導(dǎo)產(chǎn)生出功能性DC，口腔癌患者與健康人DC細(xì)胞的表型及其抗原提呈分子的表達(dá)以及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在為臨床以DC為基礎(chǔ)的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 1材料和方法 1.1材料RPMI培養(yǎng)基(Hyclone USA), 淋巴細(xì)胞分離液(上海恒生公司 ),

13、 重組人單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGMCSF),重組人白細(xì)胞介素4 (rhIL4), 腫瘤壞死因子(TNF)均使用美國Peprotech Asia公司產(chǎn)品. 取200505/200510來我院口腔科住院治療的口腔癌患者15例作為實(shí)驗(yàn)組，本組病例均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；對照組為健康志愿者15例. 兩組人員均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病. 1.2方法無菌采集外周血50 mL，肝素鈉抗凝. 加入等量無鈣鎂DHanks緩沖液（pH 7.4），充分混勻. 取50 mL離心管加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液20 mL后，再沿壁小心加入上述稀釋的外周血20 mL，2000 r/min， 20 min

14、離心，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞. 小心吸取中間層細(xì)胞，用DHanks洗滌細(xì)胞3次，棄上清，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個(gè)/L，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL. 于50 mL/L CO2,37條件下孵育23 h后，吸出培養(yǎng)上清和非貼壁細(xì)胞（用于其他實(shí)驗(yàn)），用預(yù)熱37的培養(yǎng)基清洗板1次，以去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞，加入含1 MU/L rhGMCSF和0.5 MU/L rhIL4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37 50 mL/L CO2進(jìn)行培養(yǎng)，孵育至第5日時(shí)，每孔加入TNF 0.2 MU/L, 7 d后得到成熟的DC4. 誘導(dǎo)培

15、養(yǎng)1，3，5，7 d時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及DC形成，在培養(yǎng)的7 d收集DC，調(diào)細(xì)胞密度為1×107/L，分為兩份，一份用10 g/L戊二醛固定30 min,梯度乙醇脫水，叔丁醇干燥，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài). 另一份用25 g/L戊二醛固定， 鋨酸后固定， 醋酸鈉、 檸檬酸鉛雙重染色， 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu). 1.2.1FACS測定細(xì)胞表型收集體外培養(yǎng)5，7和10 d的外周血單個(gè)核細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色，確定細(xì)胞活力在95%以上，分別加入直標(biāo)熒光的，如PE標(biāo)記的CD1a,CD86,HLADR,IgG1（對照），F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD83,CD80,IgG2（對照），充分均勻染

16、色(4, 避光, 30 min)后FACS行細(xì)胞表型檢測. 1.2.2混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)非貼壁細(xì)胞調(diào)整密度為2×109/L，加入96孔培養(yǎng)板中，分別按101, 201和401的比例加入上述培養(yǎng)的兩組DC（保持T細(xì)胞數(shù)為105），該DC先用25 mg/L絲裂霉素于37孵育45 min，然后調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，加入培養(yǎng)板各孔內(nèi)，總體積200 L/孔，各實(shí)驗(yàn)組分設(shè)3復(fù)孔，混勻，同時(shí)設(shè)對照組. 37，50 mL/L CO2培養(yǎng)72 h. 于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)終止前4 h，加入MTT液（5 g/L） 20 L/孔，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心培養(yǎng)板（1000 r/min, 5 min），

17、棄上清，每孔加入DMSO（二甲基亞砜） 150 L，充分混勻，靜置數(shù)分鐘，檢測每孔490 nm的A值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)指數(shù)5. 增殖指數(shù)（SI）=試驗(yàn)孔A均值/對照孔A均值. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析; 兩組樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較用方差分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1培養(yǎng)DC的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)人外周血貼壁細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞聚集成大小不等的細(xì)胞聚體， 3 d可見細(xì)胞聚集成團(tuán), 少量懸浮生長，部分細(xì)胞體積增大. 5 d懸浮細(xì)胞數(shù)量增多, 細(xì)胞表面有細(xì)小突起形成. 7 d懸浮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)顏色變深，有明顯樹突狀突起，掃描電

18、鏡觀察,表面粗糙, 胞體向周圍伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起. 透射電鏡觀察, 細(xì)胞表面伸出長短不一的突起, 線粒體致密化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池狀，溶酶體較少（圖1），呈明顯的DC細(xì)胞特征.圖1人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d DC形態(tài)TEM ×10 000略 2.2體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞的表型變化人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，實(shí)驗(yàn)組（口腔癌患者）DC細(xì)胞的CD83和CD1a的表達(dá)率較對照組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但CD86,CD80和HLADR的表達(dá)率兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組DC細(xì)胞的CD83,CD1a,CD86,CD80和

19、HLADR表達(dá)的平均熒光指數(shù)(MFI)雖然均低于對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1）. 表1口腔癌患者外周血DC表面分子的表達(dá)比較（略） 2.3DC對淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響在自體和同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中，隨著DC比例增加，實(shí)驗(yàn)組和對照組淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組自體AMLR增殖均值由1.8升至3.2，健康人自體AMLR增殖均值由2.2升至4.1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 實(shí)驗(yàn)組DC與健康人DC在同種細(xì)胞比例下，對淋巴細(xì)胞的促增殖能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2）. 圖2DC對T細(xì)胞增殖的影響略 3討論 近年來，對實(shí)體瘤的免疫生物治療稱為腫瘤防治的研究熱點(diǎn)，免

20、疫防御機(jī)制用于頭頸部癌的治療已顯示較好療效6，而DC作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞（APC）,能刺激未致敏T細(xì)胞的增殖和活化、啟動機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著重要作用. 人體內(nèi)DC大多處于不成熟狀態(tài)，激活淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較低，但具有極強(qiáng)的抗原內(nèi)吞能力. 在攝取抗原或接受某些刺激因素后DC可以分化成熟，由于體內(nèi)DC數(shù)量少而且分布廣泛，難以分離純化，怎樣通過簡單有效的方法制備出大量的功能性DC來滿足臨床需要，是亟待解決的問題.目前，體外培養(yǎng)的DC主要來源于外周血、骨髓和臍血. 我們應(yīng)用口腔癌患者和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)DC的產(chǎn)生. 因?yàn)橥庵苎杉椒ê唵我仔校菀撰@取，

21、而且與骨髓相比不易污染腫瘤細(xì)胞. 研究表明，在決定DC是否可以發(fā)育成熟的調(diào)控因素中，GMCSF，IL4和TNF是極其重要的誘導(dǎo)因子，其中GMCSF可促進(jìn)髓系細(xì)胞發(fā)育，是維持DC發(fā)育和分化的最根本的細(xì)胞因子；IL4可促進(jìn)干細(xì)胞及單核細(xì)胞分化發(fā)育成DC，并維持DC于未成熟狀態(tài)，使其具有很強(qiáng)的處理外源性抗原的能力7. 在DC培養(yǎng)過程中加入TNF可以促進(jìn)DC成熟，使其具有強(qiáng)的刺激T細(xì)胞的活性，并抑制DC凋亡8-9. 我們對口腔癌患者及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)GMCSF，IL4和TNF 3種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)分化，獲得具有典型DC細(xì)胞形態(tài)特征的DC. 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7日時(shí)兩組DC均高表達(dá)CD86，CD80

22、，HLADR，差異無顯著性，與文獻(xiàn)10報(bào)道一致. 而兩組DC之間CD83和CD1a的表達(dá)率有明顯差異. CD83是目前公認(rèn)的成熟DC標(biāo)志分子，我們考慮該差異源于兩組PBMC的貼壁率和DC轉(zhuǎn)換率不同. Onishi等11認(rèn)為晚期腫瘤患者的單個(gè)核細(xì)胞來源的DC中存在一種叫短壽命的亞群，培養(yǎng)超過7 d，較短命的亞群死亡，幸存的DC無論是表面分子表達(dá)、MLR和抗原提呈能力均與健康人相似. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，患者單個(gè)核細(xì)胞來源的DC在體外同樣具有激發(fā)自體和同種異體外周血T細(xì)胞增殖的作用，并且隨著DC數(shù)量的增加對淋巴細(xì)胞增殖能力刺激作用增強(qiáng). 我們認(rèn)為，口腔癌患者來源的MoDC在初始狀態(tài)可能與健康人有一定的

23、免疫學(xué)差異，但是通過合理的因子組合培養(yǎng)后，同樣能發(fā)揮針對自身疾病的免疫治療作用，從而避免使用他人血源的排斥反應(yīng)，怎樣針對患者自身來源的DC特性選擇更合適的培養(yǎng)手段，發(fā)揮它的特異性免疫治療效果，尚需進(jìn)一步研究. 【參考文獻(xiàn)】 1 Ponsaerts P， Van Tendeloo VFI， Berneman ZN, et al. Cancer immunotherapy using RNAloaded dendritic cells J. Clin Exp Immunol, 2003,134:378-384. 2 Griffioen M, Borghi M, Schrier P,et al. A

24、nalysis of Tcell responses in metastatic melanoma patients vaccinated with dendritic cells pulsed with tumor lysates J. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 715-722. 3 Holtl L, ZelleRieser C, Gander H, et al.  Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysatepulsed autologous d

25、endritic cells J. Clin Cancer Res, 2002,8:3369-3376. 4 Grunebach F, Muller MR, Nencioni A, et al. Delivery of tumorderived RNA for the induction of cytotoxic TlymphocytesJ. Gene Ther, 2003,10:367-374. 5 Westermann J, Korner J, Kopp J, et al. Cryopreservation of mature monocytederived human dendritic

26、 cells for vaccination: Influence on phenotype and functional propertiesJ. Cancer Immunol Immunother, 2003,52:194-198. 6 Kacani L, Wurm M, Schwentner L, et al. Maturation of dendritic cells in the presence of living, apoptotic and necrotic tumour cells derived from squamous cell carcinoma of head and neckJ. Oral Oncol, 2005,41:17-24. 7 Dauer M, Obermaier B, Herten J, et al. Mature dendritic cells derived from human monocytes within 48 hours