生物技術實驗講義

1、現(xiàn)代生物技術實驗講義 DNA重組技術與基因檢測芯片技術 動物細胞培養(yǎng)及細胞活性檢測技術 發(fā)酵工程及分離提取技術華東師范大學生命科學學院 SCHOOL OF LIFE SCIENCES , EAST CHINA NORMAL UNIVERSITY2007年9月引 言隨著生物技術的發(fā)展，生物工程的專業(yè)技術人員的需求更為迫切，特別是生物技術已經(jīng)滲透到各個行業(yè)，并已蓬勃發(fā)展。生物技術的發(fā)展不但要有深厚的理論基礎，而且要求專業(yè)技術人員具有較強的動手能力，因為該學科是一門實踐性較強的科學。在培養(yǎng)生物技術專業(yè)學生時要特別注意學生實驗能力的培養(yǎng)，尤其是專業(yè)基本操作。本專業(yè)學生的實驗課程已經(jīng)包括生物化學實驗、微

2、生物實驗、基因工程實驗、細胞工程實驗和發(fā)酵工程實驗等課程實驗。這些實驗為培養(yǎng)學生的基礎操作能力、提高學生的實際動手能力等奠定了良好的基礎，但是這些實驗都是單個的小實驗，各個實驗各自為一體，沒有系統(tǒng)地相互關聯(lián)，學生完成實驗后沒有一個完整的概念。本實驗以基因工程、細胞工程和發(fā)酵工程實驗為基礎，組成了生物工程中上游、中游和下游技術。其中每一個部分放棄了原來單獨小實驗的結構，而改為一個獨立的大實驗，增加了學生的設計性和主動性。這些實驗既注重和加強了原來各自的實驗內(nèi)容，又注意到相互聯(lián)系。本講義分為三個部分，第一部分“DNA重組技術與基因檢測芯片技術”；第二部分“動物細胞培養(yǎng)及細胞活性檢測技術”；第三部分

3、“發(fā)酵工程及分離提取技術”。這些實驗采取大實驗方法，使學生有一個完整的操作過程，對理解生物工程的上游、中游和下游技術有了感性認識。第一部分DNA重組技術與基因檢測芯片技術黃 靜 陸泉枝 編目 錄前 言31.相關基礎知識 .41.1 DNA重組技術的基本原理.41.2 基因芯片技術的基本原理.62. 實驗目的和要求 .72.1 DNA重組技術實驗目的和要求.72.2 基因芯片技術實驗目的和要求.73. 實驗材料和儀器 .83.1 實驗材料 .83.2 主要儀器設備 .83.3 實驗器皿.83.4 細菌培養(yǎng)基.83.5 分子生物學試劑.83.6 SDS-PAGE電泳試劑93.7 基因芯片試劑.10

4、4. 實驗內(nèi)容.104.1 DNA重組技術實驗內(nèi)容 .104.2 基因芯片技術實驗內(nèi)容.115. 習題.126. 參考資源.126.1參考書目126.2 參考產(chǎn)品目錄.136.3 參考網(wǎng)站.13附錄一 質粒DNA的提取14附錄二 瓊脂糖凝膠電泳.15附錄三 DNA的純度、濃度的測定.17附錄四 DNA的酶切和連接（體外重組）.18附錄五 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和重組DNA分子的轉化19附錄六 重組轉化子DNA的鑒定（籃白斑篩選法）21附錄七 重組轉化子DNA的鑒定（限制性內(nèi)切酶分析法）22附錄八 DNA的體外擴增（PCR技術）23附錄九 SDSPAGE電泳25附錄十 毛囊中DNA的提取28附

5、錄十一基因型檢測芯片檢測ACE基因多態(tài)性28前 言二十一世紀是生物學的世紀，分子生物學作為生物學最前沿的基礎學科是生物學類專業(yè)通向生物高技術的必修課程。隨著人們在分子生物學水平上的研究和學習的深入和廣泛展開，除了在分子水平上了解生物學的本質特征外，在分子水平如何進行生物學操作是生物學界共同關心并十分重視的問題?！癉NA重組技術”就是利用分子生物學的一般原理闡述在分子生物學實驗中所涉及的技術方法、原理和策略，是一門指導分子生物學實驗操作的理論與實踐相結合的課程。隨著生物科學和生物技術的日益發(fā)展，人們越來越重視對生物學研究手段的了解和掌握。作為新世紀的生命科學學院的大學本科生有必要學習DNA重組技

6、術的原理和方法，學會和掌握DNA重組技術。本實驗講義就是為基因工程操作的入門者而編寫的。基因工程技術的核心內(nèi)容就是DNA重組技術，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過載體把重組的DNA分子引入受體細胞，使外源DNA在受體細胞中進行復制與表達，按人們的需要生產(chǎn)出不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給后代。根據(jù)這一定義，基因工程技術涉及到極其廣泛的生物學新技術新方法，但它又有一個基本的操作程序。因而，我們按照DNA重組技術的操作程序來安排實驗，即從載體的選擇目的基因的制備體外DNA的重組（酶切與連接）重組DNA分子引入受體細胞

7、轉化子的篩選重組DNA分子的鑒定等步驟編排成一個綜合性大實驗。在這個綜合性實驗中，每一步實驗既相對獨立又與下一步實驗緊密相連，只有獲得第一個步驟的實驗結果才能開始第二個實驗。因此，實驗也涵蓋了所要訓練的單項技術。在實驗取材方面，我們以大腸桿菌為基本資料，建立適合于大腸桿菌的DNA重組技術實驗。我們旨在通過這些實驗，讓同學們獲得分子生物學最基本的技術訓練，掌握最基本、最常用的技術，并對DNA重組技術有一個比較全面而系統(tǒng)的概念。此外，生物芯片技術已被國際公認為是正在和將要給二十一世紀的生物科學、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領域帶來革命性變化的新技術，作為新世紀生物技術專業(yè)的大學生，有必要接觸生物芯片的一些基

8、本知識。鑒于目前實驗條件有限，本實驗教程的內(nèi)容僅涉及一種基因（ACE基因）的多態(tài)性檢測，讓同學們了解基因檢測芯片技術的一般原理和操作技術，為今后的工作和學習打下基礎。作 者2006.91. 相關基礎知識1.1 DNA重組技術的基本原理基因工程技術的核心內(nèi)容就是DNA重組技術，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過載體把重組的DNA分子引入受體細胞，使外源DNA在受體細胞中進行復制與表達，按人們的需要生產(chǎn)出不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給后代。強調(diào)外源核酸分子（一般情況下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然種的界限

9、，將來自不相關物種的基因放入一個宿主中是DNA重組技術的重要特征。另一個特征是繁殖。重組DNA技術主要包括以下幾個要素：載體；工具酶；外源DNA，即要克隆或表達的DNA片斷；原核或真核宿主細胞?；蚩寺〉幕静襟E是先用限制性內(nèi)切酶切割外源 DNA 和載體（質粒 DNA 載體或噬菌體載體），然后連接酶連接，組成DNA重組分子（重組質粒，見圖1），轉化入受體細胞，構建出基因文庫，再篩選。除了通常的克隆外，還有亞克隆。初步克隆中的外源片段往往較長，含有許多目的基因片段以外的 DNA 片段，在諸如表達、序列分析和突變等操作中不便進行，因此必須將目的基因所對應的一小段 DNA 找出來，這個過程叫“亞克隆

10、”。圖1 重組質粒構建示意圖載體的作用是把外源DNA帶進宿主細胞，并使之在細胞內(nèi)建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，在細胞內(nèi)繁殖、傳代或進行表達。質粒載體是最常見的載體，也是使用最方便的載體。它應用了質粒的復制、拷貝數(shù)及不相容性等性質。質粒載體有抗性基因、琥珀突變抑制基因等多種選擇標記和 -互補、插入失活等篩選標記。常見的質粒載體有： pBR322、 pUC18/19、 pUC118/119、 pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的質粒載體，如： pBluescriptKS（）。大腸桿菌表達載體是最常見的原核表達載體，可分為表達融合蛋白的載體和非融合蛋白表達載體。常用的標簽蛋白有谷胱甘肽轉移酶、六聚組氨酸肽、蛋

11、白質 A 和纖維素結合位點等。重組DNA所涉及的工具酶，最主要的是II型限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶。 型限制性內(nèi)切酶用來切割DNA，相當于基因工程中的“剪刀”。II型限制性內(nèi)切酶識別回文對稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ，產(chǎn)生帶 3- 羥基和 5- 磷酸基團的 DNA 產(chǎn)物，需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性。識別序列主要為 4bp6bp ，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異。如EcoRI 和 Hind 的識別序列和切割位置如下。 EcoR GAATTC Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA連接酶則是將兩段核酸連接起來的酶，

12、相當于基因工程中的“糨糊”。常用的T4DNA連接酶是在T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)和分離的，需 Mg2+ 和ATP的存在才能發(fā)揮活性。它能催化兩條匹配DNA鏈的3OH和5P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個DNA分子連接在一起。外源DNA就是需要克隆的DNA片斷，一般有四種來源。（1）限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的片斷，經(jīng)電泳分離后回收獲得；（2）大DNA分子經(jīng)人工剪切產(chǎn)生的片斷，這種片斷一般是平末端；（3）cDNA，即與mRNA互補的DNA，由真核基因的mRNA逆轉錄制備；（4）人工合成的基因，例如根據(jù)蛋白質的氨基酸順序和遺傳密碼合成的一些基因。外源DNA分子與載體（質粒）經(jīng)過相同的酶切可以產(chǎn)生相互

13、匹配的粘末端或平末端，經(jīng)DNA連接酶連接就構成了重組DNA分子（重組質粒）。質粒的轉化就是指將質?；蛞运鼮檩d體構建的重組DNA分子導入細菌（受體細胞）的過程。這一步是實現(xiàn)重組克隆的增殖。受體細胞要接納外源DNA，必須處于感受態(tài)。所謂感受態(tài)，就是細菌具有吸收周圍環(huán)境中的DNA的生理狀態(tài)。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉化效率以獲得更多的轉化子，人們摸索出了不同的方法處理細菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉化法和CaCl2法將外源DNA導入受體細胞中，并需要相應地制備電轉化感受態(tài)細胞和CaCl2感受態(tài)細胞。電轉化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔，因而使外源DNA能進入細胞，一般轉化率為 1

14、09 1010 轉化子 /g DNA；對于熱激法，是利用冰冷的 CaCl2處理對數(shù)生長期的細胞，可以誘導其產(chǎn)生短暫的 “感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉化率約106 107轉化子 /g DNA。獲得轉化子后可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。首先可根據(jù)轉化細胞的特征進行初步篩選。由于載體都具有供篩選用的遺傳標記，如抗生素，細胞轉化后獲得了這種遺傳特性，使用含適當?shù)南鄳股氐呐囵B(yǎng)基即可初步篩選出轉化的細菌。經(jīng)過培養(yǎng)初步篩選出來的細菌不一定都含有重組DNA，還需進一步對DNA進行分析。常用方法之一是進行重組質粒的抽提，然后電泳分析，觀察其分子量與原有載體相比是否增大；方法之二是將抽提的重組質粒進

15、行限制性內(nèi)切酶分析，觀察酶切下來得到的DNA片段大小是否與預計的相符；方法之三是以重組質粒為模板進行PCR鑒定，觀察PCR產(chǎn)物的大小是否與目的基因大小相符；方法之四則是將重組質粒進行DNA序列分析，直接分析重組質粒上的插入片段即目的基因的大小與序列是否正確。在確證得到核酸序列一致的基因后，接下來就要想辦法使該基因得到表達，獲得基因表達產(chǎn)物蛋白（肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對蛋白質進行量化、比較及特性鑒定。SDS-PAGE電泳不但能觀察到蛋白在電場中的泳動位置，而且還能知道蛋白的分子量大小以及由幾個亞基組成。此外，還可將電泳膠上的蛋白質條帶轉移到尼龍膜上，以親和反

16、應或免疫反應來檢測特異蛋白的存在，即所謂的Western Blotting。在基因表達產(chǎn)物也得到確證之后，就可以對表達的蛋白（肽）進行發(fā)酵和分離純化，并研究其生物學功能。1.2基因芯片技術的基本原理基因芯片（genechip）技術是自20世紀90年代初發(fā)展起來的新興技術，又稱DNA芯片（DNA chip），是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)或CCD成像掃描系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。基因芯片基本技術通常包

17、括：芯片制作、樣品制備（標記）、生物分子反應（雜交）以及數(shù)據(jù)分析（雜交信號的檢測及分析）等步驟。在本實驗教程中，我們給大家介紹單基因多人份的基因檢測芯片的基本原理和技術。本實驗教程使用的基因芯片制作是在醛基修飾后的玻璃基片上制造的。DNA探針（寡核苷酸片段，與被檢測的靶DNA互補）溶液與點樣緩沖液以1：1比例混合，通過點樣儀點到醛基基片上，然后用芯片活化液固定8小時。固定后DNA探針將與醛基玻片共價結合，形成陣列；在基因陣列周圍貼上反應艙，完成芯片制作過程。樣品制備：通過向樣本，如毛發(fā)、口腔粘膜脫落細胞、全血中加入抽提液，煮沸、離心等操作，使樣品中的細胞裂解釋放出DNA、同時使蛋白變性沉淀，完

18、成樣本DNA的抽提。抽提獲得的染色體DNA濃度太小，直接進行雜交檢測無法獲得信號。將抽提獲得的染色體DNA作為模板，進行PCR擴增。針對待檢基因序列的SNP位點，設計20bp左右的上、下游引物用于擴增靶DNA，同時，在引物的5端加上標簽序列，對擴增靶DNA進行標記。雜交反應：將擴增后的PCR產(chǎn)物變性成單鏈DNA分子，由于基因芯片上固定有與標簽序列相結合的標簽探針，可與PCR擴增產(chǎn)物通過堿基配對進行特異性雜交。這樣，芯片上的每個標簽探針都結合有一個擴增靶DNA分子。然后將芯片與經(jīng)生物素（Biotin）標記的特異性檢測探針進行雜交，就可以知道樣本DNA序列中的SNP信息，即到底是屬于野生型還是突變

19、型，是雜合子還是純合子。在雜交反應中，序列組成、靶標DNA分子和探針的長度、雜交溫度、鹽濃度等均會影響雜交效率和強度。顯色原理：采用生物素標記的堿性磷酸酶（AP）催化的NBT/BCIP顯色反應的檢測方法。首先，特異性檢測探針上的生物素先與鏈親和素堿性磷酸酶復合物（Stripavitin-AP）反應，生成新的復合物：Biotin-Stripavitin-AP，后者發(fā)生如下的顯色反應：Biotin-Stripavitin-AP + BCI-P BCI-OH + Pi （pH 7.5）BCI-OH + NBT 藍紫色沉淀 其中，BCIP為5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT為硝基四氮唑藍。檢測原理：采用C

20、CD（ Charge Coupled Device 即電荷耦合器件）原理，將芯片上的色斑信號掃描成圖像，用Array Doctor分析軟件進行分析，給出靶基因SNP信息。單基因多人份基因芯片檢測原理示意圖2實驗目的和要求2.1 DNA重組技術實驗目的和要求本實驗利用質粒載體克隆外源DNA片段，通過這個實驗大家可以掌握質粒載體的抽提、外源DNA的準備、酶切、連接及感受態(tài)細胞的制備、連接產(chǎn)物的轉化以及陽性克隆子的鑒定和驗證等。2.1.1 提取基因工程中的運載基因的載體DNA，掌握最常用的提取和純化DNA的方法。2.1.2 掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學習瓊脂糖凝膠電泳的操作。并以此法進一步區(qū)分質粒D

21、NA中染色體DNA和RNA的污染；估計出質粒DNA分子量的大??；觀察質粒DNA三種基本構象的比例；也可用此法純化DNA及計算出DNA的濃度，是基因工程實驗中最常用的實驗方法。2.1.3 學習和掌握用紫外分光光度法測定DNA的純度和濃度。2.1.4 學習和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法。了解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術的關鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方法。2.1.5 學習和掌握感受態(tài)細胞的制備過程。2.1.6 掌握質粒的轉化方法，學習把體外重組的DNA（即連接反應物）導入受體細胞（感受態(tài)細胞），使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選擇出陽性轉化子。2.1.

22、7 學習從轉化子中篩選和鑒定目的克隆的方法，掌握菌落PCR和限制性內(nèi)切酶酶切兩種鑒定方法。2.1.8 掌握PCR反應的基本原理與實驗技術，了解引物設計的一般要求。2.2基因芯片技術實驗目的和要求2.2.1 了解從毛囊中提取基因組DNA的原理和技術。2.2.2 了解在PCR擴增過程中如何對樣品進行標記。2.2.3 掌握核酸雜交反應原理，將樣品與生物素標記的探針雜交，通過檢測雜交信號得出基因的基因型。2.2.4 熟悉利用基因芯片技術檢測人染色體基因多態(tài)性的基本原理和方法。3實驗材料和儀器3.1實驗材料：菌種：大腸桿菌JM101，大腸桿菌DH5質粒：pUC18/19（Ampr）3.2主要儀器設備：超

23、凈工作臺；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器；恒溫水浴鍋；微波爐；低溫冰箱；臺式高速離心機；漩渦混合器；分析天平；脫色搖床穩(wěn)壓電泳儀；垂直/水平式電泳槽；紫外可見光分光光度計；紫外檢測儀；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)PCR擴增儀；凝膠成像分析系統(tǒng)ACE基因檢測芯片（上海百傲科技有限公司提供）BaiO生物芯片識讀儀（上海百傲科技有限公司提供）Array Doctor分析軟件（上海百傲科技有限公司提供）3.3實驗器皿：錐形瓶；試管；燒杯；量筒；三角推棒；培養(yǎng)皿；tip頭；Eppendorf管；微量移液槍（2l1000l）；微量進樣器（50l或100l）；一次性手套，牙簽。3.4細菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基蛋白胨 1

24、.0酵母膏 0.5NaCl 0.5%pH 7.5固體培養(yǎng)基加入2瓊脂。將上述培養(yǎng)基滅菌后（1.1公斤/ cm2，保溫20分鐘），加入100mg/ mL的Amp，使其終濃度為100ug/ mL。3.5分子生物學試劑：RNaseA溶液: 10mg/ mL，0.1M NaOAc pH 4.8, 0.3mM EDTA，80100加熱10分鐘，自然冷卻到室溫，分裝，20保藏。DNA Marker；限制性內(nèi)切酶EcoRI或Hind III；DNA（線狀）；質粒純化Kit；TaqDNA聚合酶，4dNTP；引物溶液I：50mM 葡萄糖；25mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA溶液II：0.

25、2N NaOH；1%(w/v)SDS溶液III：5M KAc 60mL； 冰醋酸 11.5 mL； H2O 28.5 mL核酸上樣緩沖液：50蔗糖，0.2溴酚蘭溶液（1） TBE 緩沖液（Tris-硼酸）：89 mM Tris-硼酸；2 mM EDTA（pH8.0）。（2） TAE緩沖液（Tris-HAc）：0.04M Tris-HAc，1 mM EDTA（pH8.0）。瓊脂糖：按所需濃度稱取，并用核酸電泳緩沖液配制，微波爐或煤氣加熱熔化使用。EB染液替代品：Goldernview 染料氨芐青霉素（Amp）溶液: 100mg/mL，無菌水溶解IPTG溶液（20，m/V）：20mg X-gal

26、溶于 1mL二甲基甲酰胺中，-20 避光保存X-gal溶液（20，m/V）：1g IPTG 溶于 4mL去離子雙蒸水中，定容至 5mL，過濾滅菌后，-20 保存 苯酚：氯仿：異戊醇25：24：1（V/ V/ V）70%冷乙醇（20保藏）3.6 SDS-PAGE電泳試劑：儲備液12M Tris-HCl (pH8.8),100ml21M Tris-HCl (pH6.8),100ml310%SDS,100ml450%甘油,100ml550%溴酚蘭,10ml工作液A液：100ml130%丙烯酰胺(29.2g)20.8%甲叉雙丙烯酰胺(0.8%)加蒸餾水至100ml，過濾，棕色瓶避光保存。B液：100m

27、l175ml 2M Tris-HCl(pH8.8)24ml 10%SDS1 21ml H2OC液：100ml150ml 1M Tris-HCl(pH6.8)24ml 10%SDS346ml H2O過硫酸銨，5ml0.5g過硫酸銨溶于5ml 蒸餾水。電泳緩沖液，1L13g214.4g甘氨酸31g SDS加蒸餾水定容到1L。5上樣緩沖液，10ml10.6ml 1M Tris-HCl (pH6.8)25ml 50% 甘氨酸32ml 10% SDS40.5ml 2-巰基乙醇51ml 1% 溴酚蘭染色液, 1L11g考馬斯亮藍R-2502450ml甲醇3450ml H2O4100ml乙酸脫色液，1L11

28、00ml乙醇2100ml冰醋酸3800ml H2O其它試劑均為國產(chǎn)分析純3.7基因芯片試劑：毛囊DNA提取試劑盒，Baio基因型檢測芯片試劑盒（上海百傲科技有限公司提供）4實驗內(nèi)容4.1 DNA重組技術實驗內(nèi)容4.1.1載體的制備從大腸桿菌中提取質粒作為運載外源基因的載體。并將提取到的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察質粒大小、構型和純度。為作下一步的酶切，連接及轉化試驗，還必須測定DNA的純度和濃度。將提取到的質粒用分光光度計檢測 260nm、280nm 波長吸光值，可檢測質粒純度并根據(jù)吸光值計算出濃度。4.1.2目的基因的制備根據(jù)已知基因序列，設計兩條引物，運用PCR方法擴增出目的基因片斷。將擴

29、增片斷用瓊脂糖凝膠電泳檢測，用PCR產(chǎn)物回收Kit純化PCR產(chǎn)物，為下一步酶切準備。注意，如果是真核基因，應該是用其cDNA序列進行克隆。4.1.3體外DNA的重組（酶切與連接）選擇合適的兩種限制性內(nèi)切酶對供體（目的基因）和受體（載體）同時進行酶切，產(chǎn)生相匹配的粘性末端，再利用T4DNA連接酶將基因片段與載體連接起來，在體外構建成重組DNA分子。4.1.4重組DNA分子引入受體細胞制備大腸桿菌感受態(tài)細胞。將重組DNA分子轉化入感受態(tài)細胞，抗性平板篩選并培養(yǎng)過夜觀察。4.1.5轉化子的篩選利用重組質粒的氨芐抗性和藍白斑篩選法對轉化子進行初篩。4.1.6重組DNA分子的鑒定采用菌落PCR法鑒定和限

30、制性內(nèi)切酶分析來進一步確定陽性克隆。或者通過DNA測序來直接檢驗。4.1.7目的基因產(chǎn)物的檢測將陽性克隆發(fā)酵培養(yǎng)，若是誘導表達質粒，則加入誘導物進行誘導表達，然后用SDS-PAGE分析目的基因產(chǎn)物的大小與表達量等，若有合適抗體，還可直接用Western blotting檢測目的基因是否表達。4.2 基因芯片技術實驗內(nèi)容4.2.1毛囊中DNA的抽提采集帶毛囊的毛發(fā)，經(jīng)裂解后分離出全基因組DNA。4.2.2人染色體ACE基因的PCR擴增將抽提獲得的全基因組DNA作為模板，進行PCR擴增。針對ACE基因（Angiotensin Converting Enzyme 血管緊張素轉化酶）序列的SNP位點，

31、設計20bp左右的上、下游引物用于擴增靶DNA，同時，在引物的5端加上標簽序列，對擴增靶DNA進行標記。4.2.3 ACE基因的基因型檢測芯片雜交、顯色、檢測實驗將PCR擴增產(chǎn)物進行預雜交，使PCR產(chǎn)物的標簽序列與基因芯片上的標簽探針結合。提高溫度，將基因芯片與帶有生物素標記的特異性檢測探針雜交、顯色并進行檢測分析。4.2.4檢測結果的驗證實驗（瓊脂糖凝膠電泳方法）人類ACE基因的16內(nèi)含子中，存在287bp的插入/缺失(I/D)多態(tài)性。因此通過PCR擴增再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)有490bp(I等位基因)和190bp(D等位基因)兩個片段，故可出現(xiàn)三種DNA基因型：（1）由兩個490

32、bp等位基因構成的基因型II；（2）由兩個190bp等位基因構成的基因型DD；（3）由一個490bp、一個190bp等位基因組成的基因型ID。因此，可以通過電泳驗證基因芯片的檢測結果。13圖4.1 ACE擴增產(chǎn)物的電泳結果M：分子量標記II：純合子插入型ID：雜合子插入/缺失型DD：純合子缺失型5習題1.原核表達系統(tǒng)的基本要素有哪些？2.為何真核基因在原核系統(tǒng)中表達時要用其cDNA進行克??？3.實驗小論文以“基因的克隆和表達”為題，模擬一個來源于真核生物的基因在大腸桿菌中進行表達的實驗論文。要求簡單介紹欲克隆基因的背景知識，克隆策略及重組DNA分子篩選等內(nèi)容。書寫格式請參考中國科學雜志上相關文

33、章格式。實驗小論文中應包含如下內(nèi)容：標題，摘要（中英文），關鍵詞，前言，材料，方法，結果，討論和參考文獻等。4.如何實現(xiàn)一人份多基因檢測的基因芯片設計、制備？6參考資源6.1參考書目：1. 分子克隆實驗指南（第三版），科學出版社翻譯版，20022. 基因工程原理（第二版）上冊，吳乃虎，科學出版社，19983. 基因工程原理（第二版）下冊，吳乃虎，科學出版社，20014. 現(xiàn)代基因操作技術，胡福泉主編，人民軍醫(yī)出版社，20005. 基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學出版社，19996. 基因工程實驗技術（第二版），彭秀玲編著，湖南科學技術出版社，19987. 生物芯片技術實驗教程，邢婉麗，程

34、京主編，清華大學出版社，20066.2參考產(chǎn)品目錄：很多分子克隆技術是由一些知名公司開發(fā)出來的，其分子生物學產(chǎn)品目錄產(chǎn)品介紹部分有很多值得我們學習的信息。她既對產(chǎn)品所涉及的基因操作原理作出論述，也對產(chǎn)品的技術參數(shù)作出詳細的比較介紹。其工作原理、操作步驟深入淺出，圖文并茂，幫助初學者對操作原理和實驗步驟的理解。其附件、附表等參考信息欄目對研究工作者也有很強的借鑒意義。如 New England Biolabs 公司在分子生物學試劑方面， Bio-Rad公司在分子生物學儀器方面 都有很深的造詣。1.Invitrogen公司分子生物學產(chǎn)品目錄2.New England Biolabs 公司分子生物學

35、產(chǎn)品目錄 3.Promage公司分子生物學產(chǎn)品目錄 4.TAKARA公司分子生物學產(chǎn)品目錄 6.3參考網(wǎng)站：互聯(lián)網(wǎng)上有很多關于分子生物學以及生物芯片的網(wǎng)站，這里僅僅羅列了一部分。 生物谷 中國生物論壇 中文分子生物學個人交流網(wǎng) 冷泉港實驗室 美國國立生物信息中心上海百傲科技有限公司附錄.附錄一 質粒DNA的提取質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。

36、本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。一、原理：從細菌如大腸桿菌或枯草桿菌中提取DNA的方法很多，其分離原理可根據(jù)DNA分子大小的不同、堿基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結構的特點來進行。目前常用的有堿變性提取法、酸酚法；PEG法、煮沸法以及溴化乙錠氯化銫梯度離心法。這些方法各有利弊，有的操作繁瑣，難以控制，有的純度不夠，有的需要昂貴的儀器。而堿變性法被認為是一種既經(jīng)濟，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用這種方法提取的DNA可用于酶切、連接和轉化。堿變性法提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。在pH高達12.6的堿性條件下，

37、染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)結構的兩條互補鏈不能完全分離，當以pH4.8的NaAC緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，保存于溶液中，而染色體DNA不能復性，形成纏連的網(wǎng)狀結構，通過離心與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白SDS復合物等一起沉淀下來而去除，從而達到分離的目的。二、操作步驟：1. 挑取大腸桿菌JM101（pUC19）單菌落接種于20mLLB液體培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素100ug/ mL），于37振蕩搖床中培養(yǎng)過夜（1012小時）。2. 取1.2mL培養(yǎng)物入一1.5mL Eppendorf管中，12000

38、 rpm，離心20s，棄盡上清。3. 往沉淀中加100ul溶液I，旋渦器上振蕩使菌體重懸，37水浴15min。4. 往3中溶液加200ul溶液II，輕柔混勻至溶液澄清，冰浴5min。5. 往4中溶液加150ul溶液III，輕柔顛倒2次，冰浴10min；12000rpm，離心15min。吸上清，轉入一新的1.5mL Eppendorf管中。6. 往5中上清加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）混合物，用力混勻成乳狀不分層；12000rpm，離心10min。7. 吸6中上清，轉移至新的1.5mL Eppendorf管中，加入等體積氯仿，用力混勻；12000rpm，離心5min。8. 吸7中

39、上清至新的無菌1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，室溫放置15分鐘；或加入兩倍體積的無水乙醇；-20 靜置30min。12000rpm，離心15min。9. 小心棄去上清，加入1mL -20預冷的70%乙醇，顛倒3次，12000rpm，離心2min；棄盡液體，室溫干燥至沉淀變透明。10. 加入20ul無菌水溶解沉淀；RNaseA（10mg/mL） 1ul（1/20體積加入，終濃度0.5 mg/mL），37水浴15分鐘。-20保藏。pUC19質粒示意圖附錄二 瓊脂糖凝膠電泳一、原理： 溴化乙錠（EB）在紫外光照射下能發(fā)出熒光。當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB就插入DNA分子中形成熒

40、光絡合物，使發(fā)射的熒光增強幾十倍。而熒光的強度正比于DNA含量，如將已知的標準樣品做電泳對照，就可估計出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂糖凝膠直接在紫外燈下拍照，只需510ng（1ng=10-9g）DNA，就可從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測0.05g0.01g的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值呈反比關系?？梢砸源颂卣鲄^(qū)別染色體DNA、質粒DNA和RNA，若用小刀取下含質粒DNA的凝膠帶經(jīng)電泳洗脫則可得純DNA。若將質粒DNA用單一切點的酶消化后，與已知分子量大小的標準DNA片段進行電泳對照，觀察其遷移距離就可估計出該樣品分子量的大小。DNA分子在凝膠中泳動的速度還與

41、DNA分子本身的構型有關，共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）,一條鏈斷開的開環(huán)DNA（ocDNA）,兩條都斷開的線狀DNA（LDNA）在電泳中的遷移速率不同，一般cccDNA泳動最快，LDNA次之，ocDNA最慢，因而可以通過電泳來區(qū)別質粒DNA的構型。二、操作步驟： 1、選擇適當大小的電泳槽（大、中、小、微等類型）。 2、選擇適當大小的點樣梳其底部離電泳槽水平面的距離為12mm。 3、制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子量的大小，決定凝膠中瓊脂糖的含量。一般可參照下表：瓊脂濃度（%）2.0分離線型DNA分子的有效范圍（Kb）5601200.8100.570

42、.460.240.13 4、稱取1%濃度的瓊脂糖，加入TBE（或TAE）緩沖液，在微波爐中熔解，待凝膠冷卻到50左右時，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。 5、待凝膠冷卻至凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，使其正好漫過凝膠表面，然后取出點樣梳，保持點樣孔的完好。 6、在待測樣品中加入1/5體積的上樣緩沖液，混勻后小心地進行點樣。每孔加樣1015l,一般不超過20l。 7、打開電源開關，最高電壓不超過5V/cm,即小電泳槽不得超過50V,當瓊脂糖濃度低于0.5%時，電泳溫度不能太高。 8、電泳時間隨實驗具體要求而定，一般待DNA帶分開后即可停止，當溴酚藍泳動至2/3凝膠時可停止電泳，約需1.5小

43、時左右。 9、電泳結束后，小心取出凝膠，放入染色液中染色15左右。 10、將凝膠放在紫外觀察燈下觀察電泳結果。質粒構型觀察示意圖附錄三 DNA的純度、濃度的測定紫外分光光度法一、原理：核酸具有吸收紫外光線的能力，在波長為260nm的條件下具吸收峰值，而蛋白質在280nm時具有吸收峰值。根據(jù)經(jīng)驗數(shù)據(jù)，純核酸溶液OD260=1.82.0時，認為已達到所要求的純度。在樣品中含有蛋白質等雜質時，會使OD260/OD280的比值下降。用此法測定時，只能區(qū)別核酸和蛋白質，而無法區(qū)別質粒DNA與染色體DNA及RNA。二、計算DNA濃度（g/mL）=OD260稀釋倍數(shù)/0.026LDNA純度= OD260/

44、OD280（要求比值在1.82.0范圍內(nèi)）注：L為比色杯厚度（cm,一般為1cm。）核酸和蛋白質的吸光度蛋白質/%核酸/%OD260：OD280蛋白質/%核酸/%OD260：OD28010000.5745551.899551.0640601.9190101.3235651.9385151.4830701.9480201.5925751.9575251.6720801.9770301.7315851.9865351.7810901.9860401.815951.9955451.8401002.0050501.87三、操作步驟：1、取石英杯兩只，分別加入TE緩沖液2990l。2、在對照杯中加入10

45、l TE buffer,在樣品杯加入10l樣品。蓋上蓋子，上下幾次搖勻。3、放入751型分光光度計的比色槽中，使用氫燈，分別測出OD260和OD280的值。4、按上述計算公式算出你所制備的DNA的純度和濃度。附錄四 DNA的酶切和連接（體外重組）一、原理：各種限制性內(nèi)切酶能專一的識別和切開特定的堿基順序：Hind III酶識別和切割順序為：5AAGCTT33TTCGAA5Hind III在載體pUC19上只有一個酶切點，用Hind III酶切載體pUC19時，就產(chǎn)生帶有AGCTT的5粘性末端的線型DNA分子。用Hind III切DNA（48.5kb），則產(chǎn)生23130，9416，6557，43

46、61，2322，2027，564，125bp大小8個片段。由于采用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切質粒pUC19和DNA，在T4DNA連接酶的作用下，pUC19（載體）和DNA（供體）不同大小片段的DNA粘性末端共價結合，產(chǎn)生一個線型的重組DNA分子。在T4DNA連接酶的繼續(xù)作用下，重組DNA分子兩端的粘性末端又共價結合，自身環(huán)化成為一個重組的環(huán)形DNA分子。二、操作步驟：1、酶切反應：按順序在滅菌的1.5mLEppendorf管中加入（1） 無菌去離子水（2） 10酶切緩沖液（3） DNA或質粒pUC19（4） 限制性內(nèi)切酶EcoRI或Hind III（在冰浴中進行，防止酶失活）。蓋緊上述兩只Eppe

47、ndorf管蓋子，用手指彈幾次使混合均勻。在離心機上離心5s，使樣品溶液集中到Eppendorf管底部。于37水浴酶解2小時后，取上述兩個樣品的酶切反應物溶液各4l，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切反應情況。剩余的樣品繼續(xù)在37水浴中酶切2小時。待電泳觀察酶切反應完全后，將上述反應液置65水浴中保溫10-15分鐘，中止酶切反應。2、連接反應：按順序在滅菌的1.5mLEppendorf管中加入（1） 無菌去離子水（2） 10T4DNA連接酶緩沖液（3） 供體：DNA酶切（純化）產(chǎn)物（4） 載體：質粒pUC19酶切（純化）大片段（5） T4DNA連接酶（在冰浴中進行，防止酶失活）注意：為取得較好的轉化

48、效率，供體和載體的摩爾比應控制在310：1。 將連接反應管中搖勻后放入12條件下連接反應過夜或16下連接反應2-3小時。操作中的注意事項：1、基因工程是微量操作技術，DNA樣品與內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的標準性。2、要注意酶切時加樣的次序，各項試劑加好后，最后再加酶液。待用的內(nèi)切酶要放在冰中，用后立即放回-20冰箱，防止內(nèi)切酶失活。3、凡用在酶切和連接反應中的一切塑料器皿（Eppendorf管，吸頭等），都要反復用水洗干凈，最后用ddH2O清洗，濕熱滅菌，置50溫箱中烘干，使用前打開包裝，用鑷子夾取，不直接用手去拿，嚴防手上雜酶污染。4、當樣品在37與65保溫時，請注意防止因蓋子

49、未蓋嚴密使水汽進入管內(nèi)，使溶液體積大量增加而造成實驗失敗。同時要防止由于標簽脫落而分不清樣品類型。附錄五 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和重組DNA分子的轉化一、原理：重組DNA轉化不同細菌有不同的轉化效率。轉化效率的高低與受體菌的感受態(tài)有關。所謂感受態(tài)，就是細菌具有吸收周圍環(huán)境中的DNA的生理狀態(tài)。關于感受態(tài)的本質與存在，說法很多，目前主要兩種假設：1、局部原生質體化假說，即認為是由于細菌表面的細胞壁結構發(fā)生變化局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA分子能通過細胞膜進入細胞；2、酶受體假說，認為感受態(tài)細胞的表面形成一種感受態(tài)的細胞使極少數(shù)。而只有感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定地收取外源DNA分子。而且感受

50、態(tài)是在短暫時間內(nèi)發(fā)生地。一般出現(xiàn)在細菌對數(shù)生長的后期。作為基因工程的受體菌必須是基因重組缺陷突變體，必須能同外來DNA分子發(fā)生遺傳重組，同時它們又必須是限制系統(tǒng)缺陷或限制與修飾系統(tǒng)均缺陷的菌株。使外來基因（DNA）不受其限制酶的降解，這樣才能進行遺傳操作。受體菌的感受態(tài)往往通過CaCl2處理而獲得。DNA分子轉化的復雜過程如下：1、吸附：完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌的表面；2、轉入：雙鏈DNA分子解鏈。單鏈DNA分子進入受體菌，另一條鏈被降解；3、自穩(wěn)：外源質粒DNA分子在受體菌內(nèi)又復制成雙鏈環(huán)狀DNA；4、表達：外源基因隨同復制子同時復制，并被轉錄翻譯。對DNA分子來說，成功轉化的比率極

51、小，僅占DNA分子的0.01%。二、操作步驟：（一）大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法) 1、從新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一單菌落，接種于35mL LB液體培養(yǎng)中，37振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以1:1001:50轉接于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030min測一次OD600nm，至OD600nm0.5時停止培養(yǎng)；2、每組取培養(yǎng)液2個1.5mL轉入1.5mL離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4，4000rmin離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進行，速度盡量快而穩(wěn)）；3、倒凈上清培養(yǎng)液，用

52、1mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴；4、04，4000rmin離心10min；5、棄去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細胞。04，4000rmin離心10min；6、棄去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液；7、制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積15左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5mL離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。（二）細胞轉化1、分別取3個100l感受態(tài)細胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作)，第一組，加入10 l重組質粒DNA(體積不超過10l)+ 100l感受態(tài)細胞，此管為轉化實驗組。第二組，插入DNA片段對照組，即酶切后DNA片段25ng+100l感受態(tài)細胞懸液；第三組，質粒DNA對照組，即1ng 未