特定序列脫氧核糖核酸電化學(xué)生物傳感器進(jìn)展

1、特定序列脫氧核糖核酸電化學(xué)生物傳感器進(jìn)展楊麗菊彭圖治3(浙江大學(xué)西溪校區(qū)化學(xué)系,杭州310028摘要對(duì)當(dāng)今電分析化學(xué)中的研究熱點(diǎn)之一脫氧核糖核酸(DNA 的電化學(xué)生物傳感技術(shù)的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述,評(píng)述了其發(fā)展前景。關(guān)鍵詞脫氧核糖核酸,電化學(xué)生物傳感器,評(píng)述2000202227收稿;2000207230接受本文系國(guó)家自然科學(xué)基金(N o.29975024和浙江省自然科學(xué)基金及分析測(cè)試基金資助項(xiàng)目1引言脫氧核糖核酸(DNA 是遺傳信息的承擔(dān)者,具有貯存和傳遞信息的功能。絕大多數(shù)生物體的遺傳信息儲(chǔ)存在DNA 分子中,DNA 的復(fù)制構(gòu)成了遺傳的分子基礎(chǔ)。DNA 是多聚脫氧核苷酸,其組成可簡(jiǎn)述如下 :D

2、NA 分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)是核苷酸通過(guò)3,52磷酸二酯鍵連接成沒(méi)有支鏈的直線形或環(huán)形結(jié)構(gòu)。1953年,Wats on 和Crick 提出了DNA 雙螺旋模型的二級(jí)結(jié)構(gòu),即DNA 分子是由兩條多脫氧核糖核酸鏈組成,鏈的內(nèi)側(cè)是堿基,兩條鏈以反平行方向盤(pán)繞同一條軸形成右旋的雙螺旋結(jié)構(gòu),兩條鏈上的堿基是匹配的,稱(chēng)為堿基互補(bǔ),腺嘌呤和胸腺嘧啶以兩個(gè)氫鍵連接,鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶以3個(gè)氫鍵連結(jié)。在DNA 分子中互補(bǔ)堿基的含量相等。在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,DNA 分子還可以扭曲或卷曲形成超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)1。DNA 被稱(chēng)為生命體內(nèi)的基因物質(zhì),人類(lèi)基因組含有3109個(gè)堿基對(duì),它的全序列的測(cè)定已經(jīng)提前完成,這一宏偉目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)不僅能

3、使人們從根本上對(duì)人體的所有生命活動(dòng)有全面的了解,而且會(huì)對(duì)某些現(xiàn)在還不能控制的疾病,找到根本的治療方法2。研究發(fā)現(xiàn),DNA 分子中堿基序列的變異與人類(lèi)的許多遺傳疾病有關(guān),這些變異的復(fù)雜程度各不相同3。例如,2珠蛋白基因的點(diǎn)突變中,一個(gè)胸腺嘧啶被腺嘌呤替代,從而引起氨基酸替代,導(dǎo)致鐮狀紅血球盆血癥4。70%的囊性纖維變性病人和攜帶者與轉(zhuǎn)移膜控制蛋白質(zhì)基因編碼中的一種三堿基殘缺有關(guān)5。亨廷頓氏癥是因?yàn)檎；虿迦肓酥貜?fù)的多堿基單位而增長(zhǎng)6。因此,對(duì)人體的血液、組織及體液等樣品中所含的特定DNA 序列的測(cè)定結(jié)果,可用于確證感染疾病的細(xì)菌和病毒根源。檢測(cè)與疾病有關(guān)的變異對(duì)基因篩選、遺傳疾病的早期診斷和治

4、療具有十分深遠(yuǎn)的意義。由于DNA 序列測(cè)定的傳統(tǒng)方法操作繁瑣費(fèi)時(shí),且使用放射性同位素作標(biāo)記7,已不適用于常規(guī)分析。各種新的技術(shù)不斷發(fā)展,并逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)分析法,其顯著改進(jìn)在于采用了非放射性的生物素、地谷新配基及熒光染料作標(biāo)記物810。基于熒光信號(hào)的測(cè)定是目前DNA 測(cè)定的最準(zhǔn)確方法,但所需的儀器昂貴,且難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。此外,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR 也已廣泛用于感染病毒的測(cè)定11。該方法雖具第29卷2001年3月分析化學(xué)(FE NXI H UAX UE 評(píng)述與進(jìn)展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第3期355360有很高的靈敏度,但需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過(guò)

5、程,分析時(shí)間較長(zhǎng),且難以定量測(cè)定目標(biāo)基因。各國(guó)專(zhuān)家和學(xué)者投入這一領(lǐng)域12。2DNA 生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)及類(lèi)型DNA 生物傳感器的基本組成包括一個(gè)DNA 探針和一個(gè)換能器。DNA 探針是合成的DNA 片段,其堿基序列與被測(cè)DNA 片段的堿基序列互補(bǔ)。換能器的功能是將DNA 雜交信息轉(zhuǎn)換為可測(cè)定信號(hào),且對(duì)固定化的單鏈DNA (ssDNA 和雙鏈DNA (dsDNA 具有選擇性響應(yīng)。換能器的不同形成了各種DNA 生物傳感器。其一大類(lèi)型是采用質(zhì)量敏感性換能器,包括表面聲波(S AW 13,14和基于壓電效應(yīng)的石英晶體微天平(QC M 15,16。表面聲波直接測(cè)定法是將單鏈DNA 直接或間接地固定在換

6、能器的表面,這些換能器對(duì)雜交后雙鏈DNA 而引起的其表面質(zhì)量的增加相當(dāng)敏感。間接測(cè)定法是在導(dǎo)波器表面采用一個(gè)只能與雙鏈DNA 結(jié)合的熒光團(tuán),由此感應(yīng)DNA 的雜交信息17。石英晶體微天平能檢測(cè)因多相混合物中的質(zhì)量變化而引起的頻率改變。Y.Okahata 等16以低聚核苷酸修飾的噴金QC M 檢測(cè)DNA 的雜交反應(yīng)。目前,這些換能器很難檢測(cè)小于10-9g 的質(zhì)量變化,因此,與臨床醫(yī)學(xué)所需的要求尚有差距。另一大類(lèi)型是采用光學(xué)換能器,即DNA 光學(xué)傳感器1821?？刹捎冒l(fā)光法、橢圓光度法及假布儒斯物角反射法等作為光學(xué)檢測(cè)手段。Bard 等18采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)了DNA 在烷基二磷酸鋁Al 2(C 4B

7、P 膜電極表面的固定化程度和雜交程度。他們將未標(biāo)記的ssDNA 先固定到Al 2(C 4BP 膜電極表面,然后將電極浸入含有已用Ru (bpy 2+3的標(biāo)記的互補(bǔ)DNA (cDNA 的溶液中,由于雜交作用而使電極表面形成標(biāo)記了Ru (bby 2+3的dsDNA ,通過(guò)測(cè)定在含有三正丙胺溶液中(Ru (bpy 2+3的氧化產(chǎn)生的電致化學(xué)發(fā)光而檢測(cè)DNA 的雜交程度。第三大類(lèi)型是采用電化學(xué)換能器。即DNA 電化學(xué)生物傳感器。其基本原理是:當(dāng)一條ssDNA 與樣品中與之互補(bǔ)的另一條cDNA 相遇時(shí),兩者發(fā)生雜交反應(yīng),反應(yīng)體系的電壓、電流或電導(dǎo)等電化學(xué)信號(hào)會(huì)發(fā)生變化,通過(guò)對(duì)此類(lèi)變化的檢測(cè)可對(duì)樣品中DN

8、A 的結(jié)構(gòu)和含量等信息加以測(cè)定。這是目前人們寄信號(hào)代替熒光對(duì)DNA 雜交進(jìn)行快速測(cè)定不僅可行,并且極具優(yōu)勢(shì)。因?yàn)椴还軜悠返那宄夯蚧鞚?電信號(hào)都可以被測(cè)定,且不需要激光誘導(dǎo)或分光檢測(cè)器。F.G arnier 認(rèn)為:用直接的電信號(hào)來(lái)分析DNA 序列,將更加精確,更加靈敏。3DNA 電化學(xué)生物傳感器的研究現(xiàn)狀311DNA 電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計(jì)DAN 電化學(xué)生物傳感器測(cè)定DAN 的整個(gè)過(guò)程包括以下四步:一是DNA 探針的固定,這是一個(gè)有關(guān)表面的問(wèn)題,即要將ssDNA 連接或者固定到一個(gè)固體電極的表面,形成DNA 探針電極。二是雜交過(guò)程,DNA 探針電極放入被測(cè)溶液,當(dāng)互補(bǔ)的目標(biāo)ssDNA 與之相遇時(shí)

9、,它們將在電極表面雜交形成dsDNA ,這一過(guò)程中必須控制合適的雜交條件。三是雜交的指示,即如何將雜交信息轉(zhuǎn)化為可測(cè)定的電化學(xué)信號(hào)。四是電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè),可將電流、電壓或電導(dǎo)作為檢測(cè)信號(hào)。DNA 探針的固定和雜交的指示是此類(lèi)傳感器的兩大關(guān)鍵問(wèn)題。653分析化學(xué)第29卷312DNA 探針的固定方法DNA 探針的固定是DNA 電化學(xué)傳感器制作中的首要問(wèn)題,固化量和活性直接影響傳感器的靈敏度,為了把DNA 牢固連結(jié)在電極表面,往往需要借助有效的物理或化學(xué)方法。就目前研究者所采用的DNA 探針固定方法而言,大致可以分為以下4類(lèi)。(1共價(jià)鍵合法這種方法中大多采用碳質(zhì)電極作為基體電極,其優(yōu)點(diǎn)是表面易于產(chǎn)生

10、各種功能硬脂酸,然后在高濃度DNA 的水溶性碳化二亞胺體系中,使DNA 鍵合到電極表面,由此制成DNA 探針電極,檢測(cè)了囊性纖維變性基因F 508的序列。他們還曾以玻碳電極為基體23,24,用1232二甲胺2兩基232乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N 2羥基硫代琥珀酰胺活化電極,使其與脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷殘基結(jié)合,從而使DNA 連結(jié)電極表面。方禹之等2527用乙基2(32二甲基丙基碳二亞胺鹽酸鹽和羥基丁二酰亞胺活化已被氧化的光譜純石墨電極,將含75個(gè)堿基的DNA 共價(jià)固定到電極表面。(2吸附法這種方法是將DNA 直接或恒電位吸附到電極表面。J.Wang 等28,29采用恒電位吸附法將DNA 固定到碳糊電極(

11、CPE 上,CPE 先在含有DNA 探針或肽核酸(PNA 探針的011m ol/L pH5乙酸緩沖液中117V 預(yù)處理1min ,隨后在20110V 吸附PNA 探針2min ,或在015V 吸附DNA 探針2min ,再用0101m ol/L 的磷酸緩沖液清洗電極,即可分別固定PNA 和DNA 至電極表面,對(duì)腫瘤抑制基因p53進(jìn)行檢測(cè),獲得了滿意的結(jié)果。K.Hashim oto 等30,31將拋光處理后的平面熱解石墨電極直接放入100的含有DNA 探針NaCl 溶液中30min ,DNA 即被吸附至石墨電極表面,再用100的水洗去多余的DNA 。(3自組裝法一般以金電極為基體電極,并在DNA

12、 探針?lè)肿由辖由狭虼蓟鶊F(tuán),利用-SH 基團(tuán)可自組裝至電極表面。K.Hashim oto 等32將預(yù)處理過(guò)的金電極浸入與v -myc 致癌基因互補(bǔ)的含有20個(gè)堿基且連有巰基已基的DNA 探針溶液中,在4時(shí)持續(xù)12h ,制成的DNA 電極對(duì)目標(biāo)DNA 的檢測(cè)限達(dá)10-13m ol/L 。(4電聚合法利用導(dǎo)電化合物在電極表面的電聚合作用將DNA 探針固定在電極表面。F.G arnier 等33以聚(32乙酸吡咯/(32N 2羥基苯鄰二甲酰亞胺吡咯為前體共聚物,將帶有胺基的含有14個(gè)堿基的DNA 或低聚核苷酸(ODN 嫁接到電極表面,對(duì)目標(biāo)ODN 片段的測(cè)定靈敏度達(dá)1000A/m ol ,檢測(cè)限為10

13、-11m ol/L 。313雜交的指示在合適的條件下,DNA 探針電極浸入含有目標(biāo)cDNA 鏈的溶液時(shí),cDNA 即與電極表面的DNA 探針雜交形成dsDNA ,為了檢測(cè)所發(fā)生的雜交信息,必須采用一種電活性分子,稱(chēng)之為雜交指示劑,它能選擇性地與dsDNA 結(jié)合,且仍然保持電活性,能在電極上產(chǎn)生某種可被測(cè)定的電信號(hào)從而反映DNA 的雜交信息。DNA 電化學(xué)生物傳感器的靈敏度直接依賴于雜交指示劑對(duì)dsDNA 的選擇性。就目前研究者所采用的雜交指示劑與DNA 的作用方式而言,基本上可分為以下幾類(lèi)。(1嵌入劑(Intercalator 通常是具有電活性的小分子物質(zhì),它們能選擇性地與電極表面的dsDAN

14、 結(jié)合。通常是將雜交反應(yīng)后的電極浸入含有嵌入劑的溶液中反應(yīng)一定時(shí)間,或在雜交反應(yīng)之前,先加入一種電活性分子再進(jìn)行雜交,然后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè),所得信號(hào)的大小或變化值可以反映電極表面dsDNA 的多少,從而測(cè)定被測(cè)溶液中目標(biāo)DNA 片段的含量。嵌入劑與DNA 分子的作用一是通過(guò)分子嵌入dsDNA 雙螺旋的堿基之間,二是通過(guò)分子與DNA 骨架上的磷酸基團(tuán)之間的靜電作用。K.Hashim oto等33對(duì)二十多種不同類(lèi)型的染料、抗體、抗菌素、金屬離子絡(luò)合物及其他分子作為嵌入劑的性質(zhì)作了研究。許多DNA 電化學(xué)傳感器研究者已采用了多種分子作為嵌入劑2223,2629。J.Wang 等28,29采用C o(p

15、hen 2+3作為雜交指示劑,將雜交后的電極先在0102mol/L pH710的Tris 2HCl 溶液中清洗10s ,然后插入含有012m ol/L C o (phen 2+3的Tris 2HCl 溶液中,在015V 反應(yīng)1min ,C o (phen 2+3即與電極表面的dsDNA 結(jié)合,采用計(jì)時(shí)電位法檢測(cè)雜交前后C o (phen 2+3的峰面積變化,從而測(cè)得特定序列DNA 的含量。也有采用吖啶橙等染料、柔毛霉素等抗菌素作嵌入劑34。由于這些嵌入劑與DNA 分子之間存在上述兩種作用,因此,它們往往可以同時(shí)與ssDNA 和dsDNA 相結(jié)合,只是結(jié)合力大小不同,因此,嵌入劑作為雜交指示劑其

16、選擇性并不十分理想。例如用伏安法測(cè)定柔毛霉素對(duì)電極上dsDNA 和ssDNA 的選擇性753第3期楊麗菊等:特定序列脫氧核糖核酸電化學(xué)生物傳感器進(jìn)展紋型的嵌入劑3538。例如,他們將萘二酰亞胺的兩端分別接上兩個(gè)電活性的二茂鐵基團(tuán),利用萘二酰亞胺與dsDNA 分子形成穩(wěn)定的化合物,而所帶的二茂鐵基團(tuán)可在電極發(fā)發(fā)生氧化還原而產(chǎn)生可被檢測(cè)圖1兩端帶二茂鐵基團(tuán)的萘二酰亞胺螺紋型嵌入劑Fig.1Threading intercalator with ferrocenyl groups at each end的電化學(xué)信號(hào),其結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于這種分子兩端所帶的兩個(gè)體積龐大的二茂鐵基團(tuán),使其從DNA 分子

17、上脫開(kāi)的速度大大減慢,因而易于電化學(xué)信號(hào)的測(cè)定,能獲得更高的靈敏度36。(2DNA 分子小溝結(jié)合劑(DNA minor groovebinder 這類(lèi)物質(zhì)的作用與嵌入劑相類(lèi)似,但是它們與DNA 分子結(jié)合的方式與上述嵌入劑有所差別,它們并不嵌入dsDNA 分子的堿基中間,而是與DNA分子扭曲區(qū)的小溝相結(jié)合。這種小溝只存在于dsDNA 分子中,ssDNA 并不具備,因此,這種結(jié)合劑對(duì)dsDNA 的選擇性優(yōu)于上述嵌入劑。這類(lèi)物質(zhì)大多是一類(lèi)平面結(jié)構(gòu)的藥物分子,如紡綞素、偏端霉素等,或是二苯并酰亞胺類(lèi)染料32,39。各種小分子與DNA 分子相互作用的電化學(xué)研究是上述嵌入劑和小溝結(jié)合劑的選擇基礎(chǔ),這類(lèi)研究

18、在國(guó)內(nèi)外已有不少文獻(xiàn)報(bào)道4047。(3電活性DNA 標(biāo)記物直接在DNA 鏈上引入導(dǎo)電性分子作為標(biāo)記物。G arnier 等已在這方面進(jìn)行了多年的研究。最近的研究中33,他將一個(gè)含13個(gè)堿基的低聚核苷酸連接到聚吡咯上,這樣不僅可以增加電導(dǎo),還使其在水溶液中具有更高的電活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)雜交反應(yīng)發(fā)生時(shí),電流強(qiáng)度會(huì)降低,并且他認(rèn)為這是由于聚合物骨架形態(tài)的改變而引起的。目前,這種方法的靈敏度為10-13m ol/L 。法國(guó)的一家生物醫(yī)藥公司對(duì)此很有信心,正在發(fā)展一個(gè)基于此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原型裝置。P.Bauerle 等48已在實(shí)驗(yàn)中觀察到當(dāng)連結(jié)在聚噻吩的冠醚與堿金屬離子絡(luò)合時(shí),有電信號(hào)的改變。他們首先研究了

19、單個(gè)堿與聚噻吩作用的效果。目前,他們正在研制在水中具有更好電活性的聚噻吩,以試驗(yàn)它與15個(gè)堿基DNA 的作用情況,并認(rèn)為此項(xiàng)研究的前景非常樂(lè)觀。方禹之等49研制了醛基二茂鐵標(biāo)記的DNA 探針,對(duì)小牛胸腺DNA 有良好的響應(yīng)。314DNA 電化學(xué)傳感器的新動(dòng)向(1提高選擇性J.Wang 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了一些新的試驗(yàn),期望能有效地增加選擇性。他們采用肽核酸(PNA 而不是DNA 作探針,PNA 可以和DNA 進(jìn)行堿基配對(duì),并且由于它是中性的、具有類(lèi)肽骨架,因此它甚至能比DNA 更好地選擇性識(shí)別特定的DNA 鏈28,29。(2提高靈敏度為了取得更高的靈敏度,J.Wang 使用具有樹(shù)叉狀支鏈的DNA 代替

20、ssDNA 連接到電極上,制成探針。目前,用了含有30個(gè)臂的樹(shù)叉狀DNA ,已將信號(hào)增加10倍,而且大大擴(kuò)展了線性范圍。設(shè)計(jì)具有數(shù)百個(gè)臂的樹(shù)叉狀DNA 也是完全可能的50。(3無(wú)雜交指示劑或標(biāo)記物這類(lèi)傳感器的基本依據(jù)是:DNA 堿基中的鳥(niǎo)嘌呤很容易被氧化,由此引起的電信號(hào)的變化可用于直接檢測(cè)雜交的發(fā)生。這一技術(shù)已與一次性碳纖維電極和便攜式分析儀結(jié)合應(yīng)用51。(4傳感器的微型化加州臨床微傳感器(C MS 公司在1998年美國(guó)創(chuàng)新尖端技術(shù)大會(huì)上首次展示了手提式DNA 傳感器的原型。含有細(xì)胞和病毒的樣品可以直接加到所設(shè)計(jì)的裝置中被測(cè)定。由于采用自組裝烷烴硫醇單分子絕緣層于電極表面,已標(biāo)記的DNA 采

21、用苯乙炔導(dǎo)線分子透過(guò)絕緣層連接到電極表面。由于絕緣保護(hù)層的存在,使金電極免除溶液中其它氧化還原類(lèi)物質(zhì)的干擾,可在血液等很復(fù)雜的環(huán)境中直接進(jìn)行測(cè)定,操作簡(jiǎn)單省時(shí),而且具有極高的靈敏度。853分析化學(xué)第29卷4DNA 電化學(xué)生物傳感器的問(wèn)題與展望采用電化學(xué)生物傳感器測(cè)定DNA 時(shí),主要干擾在于:部分ssDNA 與其它物質(zhì)相結(jié)合,形成雜交假象,因此必須十分仔細(xì)地防止這種現(xiàn)象的出現(xiàn),這些干擾的物質(zhì)必須除去。另外,溫度也是影響選擇性的一個(gè)重要因素。有些DNA 鏈可能會(huì)與不完全互補(bǔ)的DNA 鏈結(jié)合,但是其產(chǎn)物的穩(wěn)定性比與互補(bǔ)DAN 結(jié)合產(chǎn)物的穩(wěn)定差得多,并且受溫度影響很大12。因此,合適的溫度,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

22、很重要。DNA 電化學(xué)生物傳感器的研究將不斷的深入,其主要發(fā)展目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)在醫(yī)學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用,這要求傳感器具有快速、靈敏、價(jià)廉、便攜等特點(diǎn)。因此,電化學(xué)DNA 芯片技術(shù)的研究將是一大發(fā)展方向,這要求傳感器具有小型和多道化的特點(diǎn),可同時(shí)獲得數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的信號(hào)。R eferences1Jin Wenrui (金文睿,Wang Naixing (汪乃興,Peng Tuzhi (彭圖治,Zhao X in (趙昕.Bioelectroanalytic Chemistry (生物電分析化學(xué).Jinan (濟(jì)南.Shandong University Press (山東大學(xué)出版社,1994:194

23、2Peng yinxiang (彭銀祥.Molecular Biophysics (分析生物物理學(xué).H ong K ong (香港.Hongkong Zhonghua Scientifical Technology Press (香港中華科技出版社,1992:276MacD onald M E ,Ambrose C M ,Duyao M P ,Myers R H.Cell ,1993,72:97112Wils on E.C &EN ,1989,76(21:4724Millan K M ,S purmanis A J ,Mikkelsen S R.Electroanalysis ,1992,4:

24、92925Liu Shenghui (劉盛輝,Sun Changlin (孫長(zhǎng)林,He Pingang (何品剛,Fang Y uzhi (方禹之.Chinese journal o f AnalyticaChemistry (分析化學(xué),1999,27(2:1301996,17(8:1222Acta ,1993,344:111118:7667 360 分析化學(xué) 第 29 卷 31 Hashimoto K,Miwa K,Ishimori Y. Supramol . Chem . , 1993 ,2 :265 32 Hashimoto K,Ito K,Ishimori Y. Anal . Chem

25、 . , 1994 ,66 :3830 33 K - Y orri oussoufi H , Garnier F , Srivastava D , G odillot P , Yassar A. J . Am . Chem . Soc. , 1997 ,119 :7388 34 Kapuscinski J ,Darzynkiewicz Z ,Melamed M R. Biochem . Pharmacol . , 1983 ,32 :3679 35 Tanious F A , Yen S - F , Wilson W D. Biochemistry , 1991 ,30 :1813 36 Ta

26、kenaka S , Uto Y, Saita H , Y okoyama M , K ondo H , Wilson W D. Chem . Commun. , 1998 :1111 37 Takenaka S , Takagi M. Bull . Chem . Soc. Jpn. , 1999 ,72 (3 :327 38 Takenaka S , Takagi M , Uto Y, K ondo H. Nucleic Acids Symposium Series , 1998 ,39 :107 39 Carrondo M , Coll M ,Aymami J , Wang A , Mar

27、el G,Boom J ,Rich A. Biochemistry , 1989 ,28 :7849 40 Rodriguez M , Bard A J . Anal . Chem . , 1990 ,62 :2658 41 Johnston D H , G lasgow K C , Thorp H H. J . Am. Chem . Soc. , 1995 ,117 :8933 42 Johnston D H , G lasgow K C , Thorp H H. J . Am. Chem . Soc. , 1995 ,117 :8933 43 Zhang Rongying ( 張蓉穎 ,

28、Pang Daiwen ( 龐代文 , Cai Ruxiu ( 蔡汝秀 . Chem . J . Chinese Universities ( 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào) 1999 ,20 :1210 44 Zhang Huimin ( 張慧敏 , Zhu Zhiwei ( 朱志偉 , Li Nanqiang ( 李南強(qiáng) . The Progress of Electroanalytical Chemistry ( 電分析化 學(xué)進(jìn)展 . Xi ( 西安 :Xi Map Press ( 西安地圖出版社 ,1999 :78 an an 45 Junjie ( 朱俊杰 ,Zhang Jinjie ( 張金杰

29、, Gu Kai ( 顧 凱 ,Chen Hongyuan ( 陳洪淵 . The Progress of Electroanalytical Zhu Chemistry ( 電分析化學(xué)進(jìn)展 . Xi (西安 :Xi Map Press ( 西安地圖出版社 ,1999 :60 an an 46 Zhao Guangchao ( 趙廣超 ,Zhu Junjie ( 朱俊杰 ,Chen Hongyuan ( 陳洪淵 . The Progress of Electroanalytical Chemistry ( 電分析 化學(xué)進(jìn)展 . Xi ( 西安 :Xi Map Press ( 西安地圖出版社 ,1999 :62 an an 47 Wang Hongen ( 王洪恩 ,Wen Xinmin ( 溫新民 ,Chen Zhongdao ( 陳鐘道 , Hou Shifeng ( 侯士峰 ,Sun Qinshu ( 孫勤樞 . The Progress of Electroanalytical Chemistry ( 電分析化學(xué)進(jìn)展 . Xi ( 西安 :Xi Map Press ( 西安地圖出版社 ,1999 :286 an an 48 Bauerle P ,Emge A. Adv. Mat .