體外分析-核醫(yī)學(xué)-2016

1、 待測物質(zhì)濃度與檢測手段待測物質(zhì)濃度與檢測手段 臨床化學(xué)分析臨床化學(xué)分析10-1210-910-610-310-0pg/Lng/Lm mg/Lmg/Lg/L免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins常量常量微量微量超微量超微量定定 義：義：利用利用放射放射分析方法或其派生的相關(guān)技分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)，測定生物樣品中術(shù)，測定生物樣品中微量生物活性物微量生物活性物質(zhì)質(zhì)含量含量檢測檢測：激素：激素 腫瘤

2、標(biāo)志物腫瘤標(biāo)志物 藥物濃度藥物濃度 受體受體分分 類類：Click to add title in here 423(IRMA) Ag Ab+Ag-Ab一一. RIA. RIA基本原理基本原理* * 抗原和標(biāo)記抗原對抗體具有完全相同抗原和標(biāo)記抗原對抗體具有完全相同 的免疫活性的免疫活性2. 抗體只有一種抗原結(jié)合位置抗體只有一種抗原結(jié)合位置 1+1=1反應(yīng)反應(yīng)3. 反應(yīng)符合質(zhì)量作用定律反應(yīng)符合質(zhì)量作用定律 Ag+Ab AgAb 一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *V1V2 AgAbAg AbK=一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *（一）競爭抑制免疫結(jié)合反應(yīng)：（一）競爭抑制免疫

3、結(jié)合反應(yīng)： 過量的過量的放射性標(biāo)記抗原（放射性標(biāo)記抗原（*Ag）與非標(biāo)記抗原（即待測抗原，與非標(biāo)記抗原（即待測抗原，Ag）同時(shí)與同時(shí)與限限量的量的特異性抗體（特異性抗體（Ab）進(jìn)行競爭抑制免疫結(jié)進(jìn)行競爭抑制免疫結(jié)合反應(yīng)合反應(yīng) （三種成份）（三種成份） Ag-Ab + Ag *Ag Ab+*Ag-Ab(B)(F) +Ag+ *Ag（過量部分）（過量部分）*Ag:標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原 Ag:非標(biāo)記抗原非標(biāo)記抗原 Ab:特異性抗體特異性抗體*Ag-Ab:標(biāo)記的抗原標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物 Ag-Ab:非標(biāo)記的抗原非標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *一一

4、. RIA. RIA基本原理基本原理* *RIA原理示意圖原理示意圖一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *（二）（二） 劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線/標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線： 定量基礎(chǔ)：定量基礎(chǔ)： *Ag-Ab的量（因變量）與的量（因變量）與Ag的量的量（自變量）之間存在競爭性抑制數(shù)量關(guān)系（自變量）之間存在競爭性抑制數(shù)量關(guān)系函數(shù)關(guān)系函數(shù)關(guān)系：二次函數(shù)關(guān)系：二次函數(shù)關(guān)系 用標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線（簡稱標(biāo)準(zhǔn)曲線）替代用標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線（簡稱標(biāo)準(zhǔn)曲線）替代一一. . RIARIA的基本原理的基本原理* *標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一一. . RIARIA基本原理基本原理* *標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線一一. RI

5、A. RIA基本原理基本原理* *（三）未知樣品的檢測（三）未知樣品的檢測:同等條件下同等條件下 + 溫育溫育 分離分離B和和F 測量放射性活度測量放射性活度 查標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度查標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度一一. . RIARIA基本原理基本原理* *一一. . RIARIA基本原理基本原理* *未知樣品的檢測未知樣品的檢測Ag未知樣品的檢測未知樣品的檢測一一. . RIARIA基本原理基本原理* *完整的試劑盒（商品化）包括：完整的試劑盒（商品化）包括： 1. 抗體抗體 2. 標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原 3. 標(biāo)準(zhǔn)抗原標(biāo)準(zhǔn)抗原 4. 質(zhì)控品質(zhì)控品 5. 沉淀劑沉淀劑二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（一）

6、抗體（一）抗體（Antibody,Ab） IgG類類 “三高三高”: 1 親和力親和力 以親和常數(shù)以親和常數(shù)K表示表示 2 特異性特異性 以交叉反應(yīng)率表示以交叉反應(yīng)率表示 3 滴度滴度 以抗體最適稀釋度表示以抗體最適稀釋度表示二二. . RIARIA基本試劑基本試劑 AgAbAg AbK= 抗體的制備抗體的制備： 多克隆抗體多克隆抗體 免疫動物所得抗血清免疫動物所得抗血清 單克隆抗體單克隆抗體 雜交瘤技術(shù)所得抗體雜交瘤技術(shù)所得抗體 二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（二）標(biāo)記抗原（二）標(biāo)記抗原（* Antigen,*Ag）抗原分子中一個(gè)或數(shù)個(gè)原子被放射性抗原分子中一個(gè)或數(shù)個(gè)原子被放射性核

7、素所取代核素所取代 標(biāo)記的放射性核素有標(biāo)記的放射性核素有3H 14C 125I等等 125I 比活度高比活度高 半衰期合適（半衰期合適（60天）天） 利用酪氨酸的利用酪氨酸的“嗜碘性嗜碘性”標(biāo)記標(biāo)記 二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（二）標(biāo)記抗原（二）標(biāo)記抗原（* Antigen,*Ag） 要求：要求： 1. 同質(zhì)性同質(zhì)性 2. 高放射性比活度（高放射性比活度（kBq/ug) 3. 放射化學(xué)純度放射化學(xué)純度 95% 4. 免疫活性高免疫活性高二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（三）標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）（三）標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）高濃度的純品物質(zhì)高濃度的純品物質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品 結(jié)構(gòu)

8、清楚結(jié)構(gòu)清楚 物理化學(xué)方法可測定物理化學(xué)方法可測定 質(zhì)量單位質(zhì)量單位(ng/L)生物標(biāo)準(zhǔn)品生物標(biāo)準(zhǔn)品 不能用物理化學(xué)方法測定不能用物理化學(xué)方法測定 采用與采用與 被測物質(zhì)相似分子形式的物質(zhì)被測物質(zhì)相似分子形式的物質(zhì) 生物單位生物單位(mIU/L)要求：要求：1. 均質(zhì)性均質(zhì)性 2. 純度高純度高 3. 定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確 二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（四）待測樣品（四）待測樣品血漿血漿 血清血清 體液體液 組織液組織液要求要求：符合放射性檢測方法的要求符合放射性檢測方法的要求 去除可能存在的干擾成份去除可能存在的干擾成份二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（五）檢測儀器（五）檢測

9、儀器計(jì)數(shù)儀：計(jì)數(shù)儀：125I 檢測檢測射線射線閃爍計(jì)數(shù)器：閃爍計(jì)數(shù)器：3H或者或者14C 檢測檢測射線射線二二. . RIARIA基本試劑基本試劑（一）理想的分離方法：（一）理想的分離方法： 1. 完全分離完全分離 2. 不影響反應(yīng)的平衡不影響反應(yīng)的平衡 3. 不受外界或其它試劑的干擾不受外界或其它試劑的干擾 4. 操作簡便操作簡便 重復(fù)性好重復(fù)性好 5. 來源方便來源方便 價(jià)格低廉價(jià)格低廉三三. . RIARIA分離方法分離方法（二）常用分離方法的比較：（二）常用分離方法的比較：分離方法分離方法 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 缺缺 點(diǎn)點(diǎn)三三. . RIARIA分離方法分離方法分離快分離快 適用于任何溫育體適用

10、于任何溫育體積積 沉淀易于觀察沉淀易于觀察 便宜便宜組分介質(zhì)及損傷組分的分析組分介質(zhì)及損傷組分的分析 新方法的研究和建立新方法的研究和建立分離快，適用于任何溫育體分離快，適用于任何溫育體積，蛋白質(zhì)含量較低的分離積，蛋白質(zhì)含量較低的分離介質(zhì)蛋白質(zhì)濃度影響小，通介質(zhì)蛋白質(zhì)濃度影響小，通用，特異性高，分離完全用，特異性高，分離完全分離快，簡易，適用于大批分離快，簡易，適用于大批樣品的檢測樣品的檢測條件不易掌握，分離不完全，條件不易掌握，分離不完全，對蛋白質(zhì)敏感對蛋白質(zhì)敏感點(diǎn)樣量少，不能處理大量樣品，點(diǎn)樣量少，不能處理大量樣品，測定體積受限，特殊設(shè)備測定體積受限，特殊設(shè)備對蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度及對蛋白

11、質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度及PH都敏感，沉淀不穩(wěn)定都敏感，沉淀不穩(wěn)定二抗價(jià)格高、流程長，二次溫二抗價(jià)格高、流程長，二次溫育可能建立新的平衡育可能建立新的平衡依賴商品供應(yīng)，抗體用量大，依賴商品供應(yīng)，抗體用量大，價(jià)高，固相抗體貯存不穩(wěn)定價(jià)高，固相抗體貯存不穩(wěn)定活性炭吸附活性炭吸附法法電泳法電泳法沉淀法沉淀法雙抗體法雙抗體法固相法固相法（一）誤差的種類：（一）誤差的種類： 1. 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差 確定的原因確定的原因 :儀器設(shè)備儀器設(shè)備 試劑質(zhì)量試劑質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式等標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式等 結(jié)果：傾向性偏高或偏低結(jié)果：傾向性偏高或偏低 以以“準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度”(accuracy)表示表示 2. 隨機(jī)誤差隨機(jī)誤差

12、 難以確定的原因：放射性測量的統(tǒng)計(jì)難以確定的原因：放射性測量的統(tǒng)計(jì) 漲落漲落 探測儀器不穩(wěn)定等探測儀器不穩(wěn)定等 結(jié)果：雙向性結(jié)果：雙向性 以以“精密度精密度”(percision)表示表示四四. . RIARIA質(zhì)量控制質(zhì)量控制（二）精密度與準(zhǔn)確度的區(qū)別與聯(lián)系（二）精密度與準(zhǔn)確度的區(qū)別與聯(lián)系 四四. . RIARIA質(zhì)量控制質(zhì)量控制 甲：即準(zhǔn)確又甲：即準(zhǔn)確又 乙：不準(zhǔn)確，乙：不準(zhǔn)確， 丙：尚準(zhǔn)確，丙：尚準(zhǔn)確， 丁：即不準(zhǔn)確?。杭床粶?zhǔn)確 精密精密 但精密但精密 但不精密但不精密 也不精密也不精密1 零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（B0%） 30%-50%2 非特異性結(jié)合率（非特異性結(jié)合率（NSB

13、%）5%-10%3 室內(nèi)質(zhì)控圖室內(nèi)質(zhì)控圖 制作及質(zhì)控規(guī)則制作及質(zhì)控規(guī)則四四. . RIARIA質(zhì)量控制質(zhì)量控制（三（三）室內(nèi)質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制 （四（四）室間質(zhì)量控制室間質(zhì)量控制 一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *（一）非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)：（一）非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)： 過量的過量的放射性標(biāo)記抗體（放射性標(biāo)記抗體（*Ab）與非標(biāo)記抗原（與非標(biāo)記抗原（Ag）進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)反應(yīng) （二種試劑（二種試劑 ）*Ab+Ag-*Ab + *AbAg（B）（F）（二）（二） 劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線/標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線： 定量基礎(chǔ)：定量基礎(chǔ)： Ag- * Ab的

14、量（因變量）與的量（因變量）與Ag的的量（自變量）之間存在正相關(guān)的函數(shù)關(guān)系量（自變量）之間存在正相關(guān)的函數(shù)關(guān)系 用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線（簡稱標(biāo)準(zhǔn)曲線）替代用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線（簡稱標(biāo)準(zhǔn)曲線）替代一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *B%標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *B%B%一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *二二. IRMA. IRMA常用方法常用方法 雙抗夾心法雙抗夾心法 (double antibody sandwi

15、ch method) 2.2.標(biāo)記第三抗體法標(biāo)記第三抗體法(labeled third antibody method) 3.3.雙標(biāo)記抗體法雙標(biāo)記抗體法(double labeled antibody method)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：l 反應(yīng)動力學(xué)：非競爭性反應(yīng)動力學(xué)：非競爭性 且抗體過量且抗體過量 容易達(dá)到平衡容易達(dá)到平衡 溫度變溫度變化對結(jié)果影響不大?；瘜Y(jié)果影響不大。l 靈敏度：比靈敏度：比RIA高出高出10100倍。倍。l 加樣誤差少：加樣誤差主要來自抗原一個(gè)環(huán)節(jié)加樣誤差少：加樣誤差主要來自抗原一個(gè)環(huán)節(jié)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：l 需要特殊的分離方法。需要特殊的分離方法。l 對半抗原不適應(yīng)對半抗原不適應(yīng)

16、l 要大量的要大量的*Ab，昂貴昂貴 三三. . IRMAIRMA優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)四四. IRMAIRMA與與RIARIA主要區(qū)別主要區(qū)別* *RIAIRMA競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是限量的所用抗體是過量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測的量與待測Ag的量呈負(fù)相的量呈負(fù)相關(guān)關(guān)Ag*Ab的量與待測的量與待測Ag的量呈正相的量呈正相關(guān)關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快反應(yīng)到達(dá)平衡快低劑量

17、區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素1 1 酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)2 2 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 3 3 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)4 4 膠體金標(biāo)記分析技術(shù)膠體金標(biāo)記分析技術(shù) 一一 酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)（enzyme immumoassay,EIA)enzyme immumoassay,EIA) 酶分子酶分子代替放射性核素代替放射性核素 標(biāo)記抗原或抗體的免疫標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析的技術(shù)分析的技術(shù) 結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性。常見方法為

18、高敏感性。常見方法為ELISA。 常用的酶為常用的酶為辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 底物是底物是四甲基聯(lián)苯四甲基聯(lián)苯胺胺 (TMB) ，反應(yīng)后顯黃色。反應(yīng)后顯黃色。 二二 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)( (CLIA)CLIA) 以以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)。的超微量分析技術(shù)。 1 化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析 吖啶酯吖啶酯2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 金剛烷金剛烷3 電化學(xué)發(fā)光免疫測定電化學(xué)發(fā)光免疫測定 三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕三三 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）四四 膠體金標(biāo)記分析技術(shù)技術(shù)膠體金標(biāo)記分析技術(shù)技術(shù)（colloidal-gold immunoassay，CGIA）問題：問題：放射免疫分析反應(yīng)物有幾種放射免疫分析反應(yīng)物有幾種 ？放射免疫分析抗原通常用什么標(biāo)記放射免疫分析抗原通常用什么標(biāo)記?免疫放射分析反應(yīng)物有幾種？免疫放射分析反應(yīng)物有幾種？ 小結(jié)小結(jié) 掌握掌握: 1.放射免疫分析的原理放射免疫分析的原理 、方法、方法 及質(zhì)量控制及質(zhì)量控制 2.免疫放射分析的原理免疫放