端粒酶活性檢測方法

1、端粒酶活性檢測方法1.端粒重復序列延伸法端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復序列，用聚丙烯酰胺(PAGE凝膠電泳可顯示6個堿基差異的梯帶。1994年Kim建立了基于PCR基礎上的端粒重復序列擴增法(TelomericRepeatAmplificationProtoc01.TRAP)首先合成一個18nt的TS做上游引物，端粒酶結合TS末端的GTT并合成AGGGTrAG然后每經(jīng)過一次轉(zhuǎn)位合成一個GGTTAG勺6堿基重復序列，端粒酶滅活后，加入一個24nt的CX做下游引物，經(jīng)過多次變性-退火-延伸，擴增端粒酶延伸產(chǎn)物。1994年Kim創(chuàng)建了該方法，

2、它與DNA聚合酶分析方法相似，如；把核酸提取物、代表脊椎動物端粒重復序列的單鏈DNA前體(T1'AGGG和放射標記的磷酸脫氧核糖一起孵育，然后通過放射自顯影檢測凝膠上新添加的DNA重復序列。此方法是最早建立的方法，它穩(wěn)定性好。其缺點是，需要樣本量大，敏感性差，檢測時間長，不適合臨床標本的大量檢測，檢測時需同位素量較大。此法已基本被淘汰2.TRAP法及其改進(關鍵是我們有沒有PCF擴增機、電泳自顯影及圖像分析)其基本原理是利用CHAPS去污劑提取端粒酶后，將反應體系中下游引物CX(5'-(CCATTA)3CCCTAA3'用石蠟層與其他反應隔開，在石蠟層上利用端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄

3、酶活性在非端粒核酸.TS(5.'AACCGTCGAGCAGT3'T-)引物3'末端合成端粒重復序列，然后將反應產(chǎn)物進行PCRT增，石蠟層在高溫時溶化，CX引物加入到反應體系中，反應體系中含有(a-32P)dGTP或(a-32P)CTP由于端粒酶每合成一個TTAGGG就需要RNA模板重新定位，因此，反應產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示為相隔6bp的梯狀條帶，TRAP法由于利用PcR技術對端粒酶合成的端粒DNA進行擴增，因此能從104個正常細胞中檢出混雜在其中的一個腫瘤細胞，這大大提高了檢測的敏感性、速度和效果。此方法較可靠，目前應用最多。但TRAP方法的缺點在于：電泳結果與

4、端粒酶活性程度呈非線性相關，使得測定端粒酶相對活性較困難；8h至兩天，時間太長改進法一：TRAP銀染法們利用銀離子與DNA結合的原理，把TrAP反應物在聚丙烯酰胺凝膠電泳后進行銀染顯示梯狀條帶，此方法的結果與同位素TRAP方法一樣可靠、靈敏。法二：接近閃爍分析法為了解決聚丙烯酰胺凝膠電泳操作繁瑣等問題，有人利用接近閃爍分析技術，在96孔板上進行.TRAP操作，使大規(guī)模篩選臨床標本成為可能，其基本原理是將CX引物.5'端用生物紊標記，2siMe-3HTTP取代a一32PdGTRPcR擴增31個循環(huán)，吸取反應物與鏈霉抗生素蛋白包被的液態(tài)微球相混合，由于生物素3H標記的反應產(chǎn)物與微球相結合，因此當其接近反應發(fā)生器時，能激發(fā)含有3H的核酸液閃，從而產(chǎn)生信號，并由液閃計數(shù)儀計數(shù)，未結合3H標記的游離核酸其能量被吸收在分析緩沖液中，不能激發(fā)液閃，故不會干擾實驗結果。xx：TRAPELISA&CTRAELISA試劑盒）先擴增，引物TS含生物素，擴增產(chǎn)物與包被有親和素的微孔板結合，并與含地高辛標記的探針雜交，酶標記抗地高辛抗體與之結合而顯色，酶標儀測定結果，根據(jù)顏色的深淺進行半定量分析。TrAP的幾種方法的具體步驟我也有，但比較復雜，不好寫出來，字母混亂很難復制的