2015年藥典通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查

1、通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外， 本法不適用于活菌制劑的檢查。微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵 守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單 向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和 劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表

2、面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使 用中和劑或滅活劑的相容性。計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡稱MPN法）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對于某些微生 物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí),應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方 法，檢測的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所 選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，

3、以確認(rèn)所采用的方法適合 于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用 性試驗(yàn)。表1試驗(yàn)菌液的制備和使用試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)胰酪大豆胨瓊脂胰酪大豆胨瓊脂培金黃色葡萄球胰酪大豆胨瓊脂培培養(yǎng)基和胰酪大養(yǎng)基或胰酪大豆胨菌養(yǎng)基或胰酪大豆胨豆胨液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基（MPN(Staphylococ液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)培養(yǎng)溫度30法），培養(yǎng)溫度30cus aureus)溫度3035,培35,培養(yǎng)時(shí)間不35,培養(yǎng)時(shí)間不超(CMCC(B)26養(yǎng)時(shí)間1824小超過3天

4、，接種過3天，接種量不大003)時(shí)量不大于100cfu于 100cfu胰酪大豆胨瓊脂胰酪大豆胨瓊脂培銅綠假單胞菌胰酪大豆胨瓊脂培培養(yǎng)基和胰酪大養(yǎng)基或胰酪大豆胨(Pseudomona養(yǎng)基或胰酪大豆胨豆胨液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基（MPNs液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)培養(yǎng)溫度30法），培養(yǎng)溫度30aeruginosa)溫度3035,培35,培養(yǎng)時(shí)間不35,培養(yǎng)時(shí)間不超(CMCC(B)10養(yǎng)時(shí)間1824小超過3天，接種過3天，接種量不大104時(shí)量不大于100cfu于 100cfu胰酪大豆胨瓊脂胰酪大豆胨瓊脂培胰酪大豆胨瓊脂培枯草芽抱桿菌養(yǎng)基或胰酪大豆胨培養(yǎng)基和胰酪大養(yǎng)基或胰酪大豆胨(Bacillus液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)

5、豆胨液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基（MPNsubtilis)溫度3035,培培養(yǎng)溫度30法），培養(yǎng)溫度30(CMCC(B) 63養(yǎng)時(shí)間1824小35,培養(yǎng)時(shí)間不35,培養(yǎng)時(shí)間不超501時(shí)超過3天，接種過3天，接種量不大量不大于100cfu于 100cfu沙氏葡萄糖瓊沙氏葡萄糖瓊胰酪大豆胨瓊脂胰酪大豆胨瓊脂培白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)養(yǎng)基（MPN法不適脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)(Candida養(yǎng)基或沙氏葡萄糖3035,培養(yǎng)溫度20用），培養(yǎng)溫度30溫度20albicans)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間不超過525,培養(yǎng)時(shí)間35,培養(yǎng)時(shí)間不超25,培養(yǎng)時(shí)間(CMCC(F) 98溫度2025,培天

6、，接種量不大于不超過5天，接過5天，接種量不大不超過5天，接001養(yǎng)時(shí)間23天100cfu種量不大于于 100cfu種量不大于100cfu100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培胰酪大豆胨瓊脂沙氏葡萄糖瓊胰酪大豆胨瓊脂培沙氏葡萄糖瓊黑曲霉養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度養(yǎng)基（MPN法不適（Aspergillus糖瓊脂培養(yǎng)基，培溫度20溫度203035,培養(yǎng)用），培養(yǎng)溫度30niger）養(yǎng)溫度2025,25,培養(yǎng)時(shí)間25,培養(yǎng)時(shí)間時(shí)間不超過5天，35,培養(yǎng)時(shí)間不超（CMCC（F）98培養(yǎng)時(shí)間57天，不超過5天，接不超過5天，接接種量不大于過5天，接種量不大003或直到獲得豐富的種

7、量不大于種量不大于100cfu于 100cfu抱子100cfu100cfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。菌種及菌液制備菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌 種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué) 特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見表1。菌液制備 按表1規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單 胞菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉

8、的新鮮培養(yǎng)物加 入35ml含0.05%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌 氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)， 用含0.05%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉 溶液制成適宜濃度的黑曲霉抱子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí) 內(nèi)使用；若保存在28,可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液可保存在28, 在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。陰性對照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)無 菌生長。如陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。培養(yǎng)基適用性檢查微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或

9、按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行 培養(yǎng)基適用性檢查。按表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪 大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng)。 每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培 養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在 0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基 管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)L試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液 制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過

10、45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用 培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng) 建立其他適宜的方法。水溶性供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要， 調(diào)節(jié)供試液pH值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。 水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖 液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液。分 散力較差的供試品，可在稀釋液中加

11、入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80,使供試 品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試 液進(jìn)一步10倍系列稀釋。油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量 并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混 勻。表面活性劑的溫度一般不超過40 （特殊情況下，最多不超過45）,小心 混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1：10供試液，保溫， 混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀 釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。需用特殊方法制備供試液的供試品膜劑供試品 取供試品,剪碎,力口PH7.0

12、無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1：10的供試液。 若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10 倍系列稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用 于腸溶制劑）或PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45水浴中， 振搖,使溶解，制成1：10的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍 系列稀釋。氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品，置-20或其它適宜溫度冷凍約1小時(shí)， 取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全

13、部釋出。供試品亦可采用其它適宜的方法取出。 用無菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢查。貼膏劑供試品取供試品取供試品,去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌 玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）， 避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑 （如聚山梨脂80或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘。必要時(shí)，用同 一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。2種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加 菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應(yīng)選擇最低

14、稀釋級的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。（1）試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供 試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。（2）供試品對照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。（3）菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試 驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試 液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果 供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

15、3 .菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn) 組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50%,可采用 下述方法消除供試品的抑菌活性。增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。 加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培 養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對照組， 即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對微生物無毒性。 中和劑或滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍 內(nèi)。表2常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法

16、戊二醛、汞制劑亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對羥基苯甲酸、雙胍類化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對羥基苯甲酸聚山梨醇酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA、喹喏酮類抗生素鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸B-內(nèi)酰胺類抗生素B-內(nèi)酰胺酶用薄膜過濾法。上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供 試品對該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作 用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn) 結(jié)果判斷的

17、前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法 適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級 的供試液進(jìn)行供試品檢查。4 .試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至 少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法 取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌活性的去除 或滅活”制備的供試液1ml,置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml溫度不 超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)

18、基，混勻，凝固，倒置培 養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、 計(jì)數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法取1520ml溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng) 基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面 接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制 備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測定供試品對照組及 菌液對照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用

19、的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45 口 m,直徑一般 為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不 影響濾膜材質(zhì)對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用 時(shí),應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過 濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的 最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄 膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗 量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌活性的去除

20、或滅活” 制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含 的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中混勻，過濾。用適量 的沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上； 若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。 按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測 定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。 MPN法MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在 供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若 使用MPN法，按下列步驟進(jìn)行。取照上

21、述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液至少3個(gè)連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有 910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng) 基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試 品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰 酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。根 據(jù)微生物生長的管數(shù)從表3查被測供試品每1g或每1ml中需氧菌總數(shù)的最可 能數(shù)。表3微生物最可能數(shù)檢索表0206.21.2170309.43.53

22、51003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.53520114435202205382101543821120538212279942202154022128994222359942302999423136994300235943013891043026416181310439181311751719931212030360313160303803209318360321150303803222103040032329090990330240409903314609019803

23、3211002004000333>1100注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用1g （或ml）、0.1g （或ml）和0.01g （或ml）時(shí)， 表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g （或ml）、0.001 g （或ml）和0.0001 g （或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍，其余類推。5.結(jié)果判斷計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供 試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)；采用MPN 法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn) 均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、 霉菌和

24、酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí),若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到 要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。供試品檢查檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn) 行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥 品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽 取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。供試品的檢查按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵 母菌總數(shù)的測定。胰酪大豆胨瓊

25、脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對照試驗(yàn)以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)無 菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。1 .平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用 性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平板。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng) 35天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)57天，觀察菌落生長情 況，點(diǎn)計(jì)平板上生長的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長成片的平板不宜 計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告 菌數(shù)。若同稀釋級兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能 相差1倍或以上。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、 霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告 的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)， 取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，