黃酮類成分分析

1、2 2 黃酮黃酮類成分分析類成分分析 一、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)一、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)v結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征 基本母核：2-苯基色原酮（C6-C3-C6）v理化性質(zhì)理化性質(zhì)物理性狀物理性狀結(jié)晶性固體或無定形粉末。大多數(shù)呈黃色，其顏色的有無與交叉共軛體系有關(guān)。如：黃酮、黃酮醇及其苷類多呈黃色；二氫黃酮、二氫黃酮醇及黃烷醇呈無色；異黃酮呈無色或微黃色。溶解性溶解性游離苷元易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶及稀堿水黃酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑OO酸堿性酸堿性酸性：與酚羥基的數(shù)目和位置有關(guān) 7,4- 二羥基 7或4- 羥基 一般酚羥基 5-羥基堿性：r-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子，可表現(xiàn)出微弱堿

2、性顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 還原反應(yīng)（鹽酸鎂粉反應(yīng)） 與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)（鋁、鉛、鋯、鎂鹽） 硼酸顯色反應(yīng)堿性試劑反應(yīng) 五氯化銻反應(yīng) Gibbs反應(yīng)和Emerson反應(yīng)光譜特征光譜特征 I帶(300-400nm) B環(huán)桂皮酰基 II帶(240-285nm) A環(huán)苯甲?；?二、鑒別二、鑒別v化學(xué)反應(yīng)法化學(xué)反應(yīng)法還原反應(yīng)還原反應(yīng)鹽酸鎂粉反應(yīng) 鑒定黃酮類常規(guī)反應(yīng)鈉汞齊還原反應(yīng)四氫硼鈉還原反應(yīng) 專屬性較高 專門鑒別二氫黃酮、二氫黃酮醇與其它黃酮類區(qū)別與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)（鋁、鉛、鋯、鎂鹽）與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)（鋁、鉛、鋯、鎂鹽）三氯化鋁反應(yīng) 鑒別鄰二酚羥基鋯鹽-枸櫞酸反應(yīng) 鑒別黃酮類化合物中是否

3、存在3-羥基或5-羥基氨性氯化鍶反應(yīng) 鄰二酚羥基主要反應(yīng)三氯化鐵反應(yīng) 酚羥基主要反應(yīng)硼酸顯色反應(yīng)硼酸顯色反應(yīng) 5-羥基黃酮或羥基黃酮或6-羥基查耳酮主要反應(yīng)羥基查耳酮主要反應(yīng)堿性試劑反應(yīng)堿性試劑反應(yīng)五氯化銻反應(yīng)五氯化銻反應(yīng) 鑒別查耳酮鑒別查耳酮Gibbs反應(yīng)和反應(yīng)和Emerson反應(yīng)反應(yīng) 鑒別黃酮類化合物酚羥基對位鑒別黃酮類化合物酚羥基對位上是否被取代上是否被取代v色譜法色譜法 1.薄層色譜法薄層色譜法硅膠-分離鑒別弱極性黃酮類化合物遵循正相色譜原理，化合物極性越大，所選擇的展開劑極性也相應(yīng)增大，同時(shí)根據(jù)化合物酸性強(qiáng)弱調(diào)節(jié)展開劑的酸堿性。常用展開劑有苯-甲醇等。聚酰胺-分離檢識含游離酚羥基的黃

4、酮及其苷利用氫鍵吸附原理，由于聚酰胺和黃酮類化合物上酚羥基形成氫鍵締合，所以作用力較強(qiáng)，需要極性強(qiáng)的展開劑，而在展開劑中大多含有醇、酸或水，或兼有兩者。所以，分離檢識游離黃酮常用有機(jī)溶劑作為展開劑，如氯仿- 甲醇等；而分離檢識黃酮苷常用含水有機(jī)溶劑作為展開劑，如甲醇- 水等。纖維素-分離黃酮類多糖苷混合物展開系統(tǒng)：正丁醇-乙酸-水，5%40%乙酸 展開好的色譜，常在紫外燈（365nm）下觀察熒光斑點(diǎn)及其顏色；亦可噴三氯化鋁試劑，在日光燈或紫外燈下觀察熒光是否加強(qiáng)；也可氨熏，是否出現(xiàn)黃色、棕色熒光斑點(diǎn)等。 2.紙色譜法紙色譜法 適用于分離各種類型的黃酮化合物，包括游離黃酮和黃酮苷類。 混合物的檢

5、識常采用雙向色譜法，第一向采用醇性展開劑如正丁醇-乙酸-水（4:1:5上層，BAW）等，此為正相分配色譜，極性小的化合物比極性大的化合物Rf值大。第二向采用水性展開劑，如水、 2%6%乙酸等，其色譜行為類似于反向色譜，極性大的化合物比極性小的化合物Rf值大。 游離黃酮類化合物的檢識，一般宜用醇性展開劑；花色素及花色苷的檢識可用含鹽酸或乙酸的水溶液作展開劑。 多數(shù)黃酮類化合物在紙色譜上用紫外燈檢查時(shí)，可以看到有色點(diǎn)，以氨蒸氣處理后常產(chǎn)生明顯的顏色變化。此外，還可以噴以2%AlCl3甲醇溶液（在紫外燈下檢查）或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液等顯色劑。三、含量測定三、含量測定

6、 中藥制劑中含有黃酮類成分，可按要求測定總黃酮含量、黃酮類單體含量或兩者均須測定。含量測定方法主要有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法等。（一）、總黃酮含量測定（一）、總黃酮含量測定 分光光度法一般用于總酮類成分的含量測定。大多數(shù)黃酮類化合物在甲醇溶液中的紫外吸收光譜由兩個(gè)主要吸收帶組成。 帶出現(xiàn)在300400nm之間的吸收帶 帶出現(xiàn)在240285nm之間的吸收帶 含黃酮類化合物的原料藥及部分制劑經(jīng)必要的提取純化后，可直接于最大吸收波長附近測定總黃酮的吸光度，對照品的選定應(yīng)以最大吸收波長與總黃酮的相近為原則，單體黃酮和總黃酮均可作為對照品，常以蘆丁等對照品計(jì)算總黃酮的含量。 毛冬青注射液中

7、黃酮苷的測定（書P132）（二）、單體黃酮含量測定（二）、單體黃酮含量測定v薄層掃描法樣品經(jīng)適宜的溶劑提取得到供試液，經(jīng)硅膠、聚酰胺或纖維素薄層 色譜有效分離后，用薄層掃描儀直接進(jìn)行含量測定。對黃酮類單體 既可以進(jìn)行紫外-可見光掃描，又可以進(jìn)行熒光掃描。v高效液相色譜法正相色譜(多用于沒有羥基或乙?；S酮類成分化合物） 固定相為硅膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要相對小一點(diǎn)。反相色譜（C18或C8） 固定相多為十八烷基硅烷鍵合相 流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸（磷酸緩沖液），乙腈-水v檢測器：紫外檢測器或熒光檢測器 心通口服液中葛根素的含量測定（書P133）銀杏葉提取物銀杏葉提取物總黃酮醇苷總黃酮

8、醇苷含量含量測定測定 含量測定含量測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）為流動(dòng)相；檢測波長為360nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，山柰素酚峰與異鼠李素峰的分離度應(yīng)大于1.5。 對照品溶液的制備對照品溶液的制備（略） 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約相當(dāng)于總黃酮醇苷19.2mg的粉末，精密稱定，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10ml，置100ml錐形瓶中，加甲醇10ml、25%鹽酸溶液5ml，搖勻，置水浴中加熱回流30分鐘，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用