真核生物基因組總DNA的提取與鑒定

1、基因組基因組DNA的分離與純化的分離與純化一、酚抽提法的原理一、酚抽提法的原理 以含以含EDTA、SDS的裂解液的裂解液裂解裂解細(xì)細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶胞，經(jīng)蛋白酶K消化消化后，用后，用PH8.0的的Tris 飽和酚飽和酚抽提抽提蛋白質(zhì)，離心后取上蛋白質(zhì)，離心后取上層水相，無水乙醇層水相，無水乙醇沉淀沉淀DNA。二、技術(shù)路線二、技術(shù)路線破破 膜膜提提 純純沉淀、洗滌沉淀、洗滌細(xì)胞膜碎片，細(xì)細(xì)胞膜碎片，細(xì)胞器，脂、蛋白胞器，脂、蛋白質(zhì)，質(zhì)，DNA，RNA 去除脂、去除脂、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 濃縮濃縮DNA、去鹽雜質(zhì)去鹽雜質(zhì)真核生物基因組真核生物基因組DNA的提?。ㄒ唬┑奶崛。ㄒ唬?.低滲去除紅細(xì)胞低滲去除紅細(xì)

2、胞2.裂解白細(xì)胞裂解白細(xì)胞真核生物基因組真核生物基因組DNA的提取（二）的提?。ǘ?.酚抽提酚抽提4.無水乙醇沉淀無水乙醇沉淀500l真核生物基因組真核生物基因組DNA的提?。ㄈ┑奶崛。ㄈ?.DNA沉淀的洗滌與干燥沉淀的洗滌與干燥6.DNA溶解與電泳鑒定溶解與電泳鑒定三三 結(jié)果結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳鑒定瓊脂糖凝膠電泳鑒定EBEB與與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合EB可嵌入到可嵌入到堿基平面，使堿基平面，使核酸在核酸在 UV 激激發(fā)下發(fā)出桔紅發(fā)下發(fā)出桔紅色熒光。色熒光。三三 結(jié)果結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳鑒定瓊脂糖凝膠電泳鑒定The End裂解液的作用裂解液的作用裂裂 解解 液液EDTASDS乙二胺四乙

3、酸乙二胺四乙酸(絡(luò)合物絡(luò)合物)二價金屬螯合劑，抑制二價金屬螯合劑，抑制DNA酶酶十二烷基磺酸鈉（去污劑）十二烷基磺酸鈉（去污劑）使細(xì)胞膜破裂；將核酸釋放出來；使細(xì)胞膜破裂；將核酸釋放出來；使蛋白質(zhì)變性使蛋白質(zhì)變性Tris -HCl緩沖夜，維持穩(wěn)定的緩沖夜，維持穩(wěn)定的pH值（值（8.0）DNA酚抽提法示意圖酚抽提法示意圖酚的作用酚的作用酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。酶活性。PH8.0的的Tris溶液可以使抽提出的溶液可以使抽提出的DNA進(jìn)入水相進(jìn)入水相 。DNA酚抽提法示意圖酚抽提法示意圖蛋白酶蛋白酶K K的作用的作用水解組蛋白，促進(jìn)水解組蛋白，促進(jìn)DNA

4、與組蛋白的分開。與組蛋白的分開。DNA的沉淀的沉淀無水乙醇沉淀無水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaAc等鹽離子，作用是中和等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。聚集。 無水乙醇可以吸收分子之間的水，使無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。的損傷。TE10mmol/L Tris-HCl1mmol/L EDTA上樣緩沖溶液（上樣緩沖溶液（6 或或10）溴酚藍(lán)（電泳指示劑，約相當(dāng)于溴酚藍(lán)（電泳指示劑，約相當(dāng)于300bpDNA）二甲苯氰（電泳指示劑，約相當(dāng)于二甲苯氰（電泳指示劑，約相當(dāng)于4000bpDNA）甘油甘油