第一節(jié)克隆載體

1、第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的的遺傳成份遺傳成份.Plasmid一詞由一詞由Joshua Lederberg于于1952年提出。年提出。質(zhì)粒的命名質(zhì)粒的命名:例例:pBR322一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體p代表質(zhì)粒代表質(zhì)粒;“BR”代表兩位研究者代表兩位研究者Bolivar和和Rogigerus姓氏的字首姓氏的字首,“322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào)是實(shí)驗(yàn)編號(hào) .已在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍已在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍較窄，只能生存于親緣關(guān)系很近的少數(shù)細(xì)菌種類中。較窄，只能

2、生存于親緣關(guān)系很近的少數(shù)細(xì)菌種類中。是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位已進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝已進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝并將質(zhì)粒分子精確地分配給子代細(xì)胞。并將質(zhì)粒分子精確地分配給子代細(xì)胞。1. 質(zhì)粒的特點(diǎn)：質(zhì)粒的特點(diǎn)：（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄或多或少依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)。其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄或多或少依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)。常常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌宿主有利的基因。常常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌宿主有利的基因。 這些基因可賦予宿主迥然不同的特征，其中不少具有這些基

3、因可賦予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的醫(yī)學(xué)和商業(yè)價(jià)值。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括產(chǎn)生抗重要的醫(yī)學(xué)和商業(yè)價(jià)值。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括產(chǎn)生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素、限制酶與修飾酶，以及降生素、大腸桿菌素、腸毒素、限制酶與修飾酶，以及降解復(fù)雜的有機(jī)化合物等。解復(fù)雜的有機(jī)化合物等。質(zhì)粒通過(guò)合成長(zhǎng)質(zhì)粒通過(guò)合成長(zhǎng)效致死物和短效效致死物和短效解毒劑得以在細(xì)解毒劑得以在細(xì)菌中生存菌中生存.5、 質(zhì)粒的類型質(zhì)粒的類型F質(zhì)粒的質(zhì)粒的tra區(qū)包含細(xì)菌接合所需的基因區(qū)包含細(xì)菌接合所需的基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與遷移質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與遷移.轉(zhuǎn)移一般指一個(gè)質(zhì)粒獨(dú)立地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移一般指一個(gè)質(zhì)粒獨(dú)立地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一

4、個(gè)細(xì)胞.遷移則指本身不能轉(zhuǎn)移遷移則指本身不能轉(zhuǎn)移,在另一個(gè)接合型質(zhì)粒存在下在另一個(gè)接合型質(zhì)粒存在下,從一個(gè)細(xì)從一個(gè)細(xì)胞移至另一種細(xì)胞胞移至另一種細(xì)胞.質(zhì)粒遷移的條件質(zhì)粒遷移的條件:bom位點(diǎn)位點(diǎn)(col E1) nic 位點(diǎn)位點(diǎn).mob基因基因.結(jié)合動(dòng)員基因結(jié)合動(dòng)員基因.編碼遷移蛋白編碼遷移蛋白,實(shí)質(zhì)是一種核酸酶實(shí)質(zhì)是一種核酸酶,切割切割nic位點(diǎn)位點(diǎn).遷移作用遷移作用(mobiligation):由共存接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的遷移過(guò)程由共存接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的遷移過(guò)程.因?yàn)閺睦碚撋洗嬖谥l(fā)生使跨越生物種間遺傳屏障因?yàn)閺睦碚撋洗嬖谥l(fā)生使跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險(xiǎn)的潛在危險(xiǎn)

5、.而利用遷移作用可能將非接合型質(zhì)粒從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另而利用遷移作用可能將非接合型質(zhì)粒從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞一種細(xì)胞,這種方法叫三親雜交法這種方法叫三親雜交法. 一般將受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌一般將受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌 三者共培養(yǎng)過(guò)夜.在基因工程中得到大量的應(yīng)用在基因工程中得到大量的應(yīng)用.輔助質(zhì)粒重組質(zhì)粒供體細(xì)胞 受體細(xì)胞接合DNA轉(zhuǎn)移三親雜交法三親雜交法根據(jù)質(zhì)粒的表現(xiàn)分為根據(jù)質(zhì)粒的表現(xiàn)分為:定義：質(zhì)粒除了與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，定義：質(zhì)粒除了與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，有的質(zhì)粒還攜帶一些其他的基因，宿主細(xì)胞由于含有有的質(zhì)粒還攜帶一些其他的基因，宿主細(xì)胞由于含有這樣的

6、質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，這樣的質(zhì)粒稱為顯性質(zhì)這樣的質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，這樣的質(zhì)粒稱為顯性質(zhì)粒。粒。相反，即使宿主細(xì)胞含有某種質(zhì)粒，但無(wú)異樣性狀表露，相反，即使宿主細(xì)胞含有某種質(zhì)粒，但無(wú)異樣性狀表露，這樣的質(zhì)粒稱為隱蔽質(zhì)粒。這樣的質(zhì)粒稱為隱蔽質(zhì)粒。受檢測(cè)手段的限制，現(xiàn)定為隱蔽型的質(zhì)粒未必是真正的受檢測(cè)手段的限制，現(xiàn)定為隱蔽型的質(zhì)粒未必是真正的隱蔽質(zhì)粒。隱蔽質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為: (1)多拷貝質(zhì)粒多拷貝質(zhì)粒 (2)測(cè)序質(zhì)粒測(cè)序質(zhì)粒 (3)整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒 (4)穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒 (5)表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒 (6)探針質(zhì)粒探針質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒的復(fù)制形式

7、主要分環(huán)狀質(zhì)粒的復(fù)制形式主要分theta ()及及rolling circle兩兩種。種。質(zhì)粒的復(fù)制子決定其拷貝數(shù)。質(zhì)粒的復(fù)制子決定其拷貝數(shù)。復(fù)制子是一個(gè)遺傳單位，包括復(fù)制子是一個(gè)遺傳單位，包括DNA復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn),相關(guān)的相關(guān)的調(diào)控元件調(diào)控元件,復(fù)制終點(diǎn)。復(fù)制終點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的DNA片段，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，片段，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，常稱為常稱為oriV (origin of vegetative replication)；有時(shí)；有時(shí)R-質(zhì)粒的復(fù)制原質(zhì)粒的復(fù)制原稱為稱為oriR ,其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與DNA合成起合成起始的由

8、質(zhì)粒或宿主編碼的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。始的由質(zhì)?；蛩拗骶幋a的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。定義：質(zhì)粒定義：質(zhì)粒DNA中能自主復(fù)制并維持正?？截悢?shù)的一段最小中能自主復(fù)制并維持正?？截悢?shù)的一段最小的核酸序列單位。的核酸序列單位。與一個(gè)起始點(diǎn)相連而沒(méi)有被終點(diǎn)隔斷的任何序列與一個(gè)起始點(diǎn)相連而沒(méi)有被終點(diǎn)隔斷的任何序列,都是作為復(fù)制子的一部分而被復(fù)制都是作為復(fù)制子的一部分而被復(fù)制.起始點(diǎn)是一種順式作用位點(diǎn)起始點(diǎn)是一種順式作用位點(diǎn),只能作用于該位點(diǎn)所只能作用于該位點(diǎn)所在的在的DNA分子分子.質(zhì)粒的拷貝數(shù)定義質(zhì)粒的拷貝數(shù)定義:(1)通常定義通常定義:生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基)每個(gè)細(xì)菌

9、細(xì)胞每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中平均所含有的質(zhì)粒的拷貝數(shù)中平均所含有的質(zhì)粒的拷貝數(shù).(2)特殊定義特殊定義:在營(yíng)養(yǎng)富有余的培養(yǎng)基中在營(yíng)養(yǎng)富有余的培養(yǎng)基中,每個(gè)細(xì)胞當(dāng)中每條每個(gè)細(xì)胞當(dāng)中每條染色體所擁有的平均質(zhì)粒染色體所擁有的平均質(zhì)粒DNA分子數(shù)分子數(shù).(3)中定義中定義:在在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞,如果具有如果具有20個(gè)及以上的個(gè)及以上的質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子分子,就叫高拷貝質(zhì)粒就叫高拷貝質(zhì)粒,如果低于如果低于20個(gè)則叫低拷貝質(zhì)個(gè)則叫低拷貝質(zhì)粒粒.質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：嚴(yán)緊型（嚴(yán)緊型（stringent plasmid)每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有每個(gè)

10、寄主細(xì)胞中僅有份的拷貝份的拷貝松弛型（松弛型（relaxed plasmid) 每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有份的拷貝每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有份的拷貝一般接合型的質(zhì)粒是嚴(yán)緊型，具有較高的分子量。一般接合型的質(zhì)粒是嚴(yán)緊型，具有較高的分子量。而非接合型的質(zhì)粒是松馳型的，具有較低的分子量。而非接合型的質(zhì)粒是松馳型的，具有較低的分子量。例外，接合型的質(zhì)粒例外，接合型的質(zhì)粒6K分子量較小，為松馳型。分子量較小，為松馳型。質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾30個(gè)，但分子克隆中常用的幾乎個(gè)，但分子克隆中常用的幾乎都帶有一個(gè)來(lái)源于都帶有一個(gè)來(lái)源于pMB1的復(fù)制子，可使每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中維持的復(fù)制子，可使每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中

11、維持個(gè)拷貝。個(gè)拷貝。即同一種質(zhì)粒在不同的寄主類型中可能屬于嚴(yán)緊型的也可能屬于松馳型的如ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松弛型的,在奇異變形桿菌中是嚴(yán)緊型的.氯霉素?cái)U(kuò)增氯霉素?cái)U(kuò)增: : pMB1或ColEI類質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制完全依靠宿主細(xì)胞提供的半衰期較長(zhǎng)的復(fù)制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增。另外兩種質(zhì)粒（

12、另外兩種質(zhì)粒（psc101和和p15A）的復(fù)制子的復(fù)制）的復(fù)制子的復(fù)制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制。蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制。 抑制蛋白稀釋模型阻遏蛋白在低濃度時(shí)處于單體狀體，高濃度時(shí)處于多體狀態(tài)。只有多體狀態(tài)具有活性自體阻遏蛋白質(zhì)模型阻遏蛋白具有自體阻遏活性。指指在沒(méi)有選擇壓力下在沒(méi)有選擇壓力下，兩種，兩種親緣關(guān)系密切親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，的不同質(zhì)粒，不能夠共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞系中的現(xiàn)象。不能夠共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞系中的現(xiàn)象。只有當(dāng)兩種只有當(dāng)兩種質(zhì)粒在同一寄主細(xì)胞中都不受限制時(shí)質(zhì)粒在同一

13、寄主細(xì)胞中都不受限制時(shí)，才能判斷，才能判斷親緣關(guān)系較近的質(zhì)粒，彼此之間互不相容，它們屬于同親緣關(guān)系較近的質(zhì)粒，彼此之間互不相容，它們屬于同一種不親和群。一種不親和群。大腸桿菌質(zhì)粒中至少已鑒別出種以上的不親和群。大腸桿菌質(zhì)粒中至少已鑒別出種以上的不親和群。質(zhì)粒不相容性現(xiàn)象與質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分離的調(diào)控有關(guān)質(zhì)粒不相容性現(xiàn)象與質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分離的調(diào)控有關(guān).攜帶相同復(fù)制子的不同質(zhì)粒屬于同一不相容組。攜帶相同復(fù)制子的不同質(zhì)粒屬于同一不相容組。帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。大多數(shù)質(zhì)粒都會(huì)產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，大多數(shù)質(zhì)粒都會(huì)

14、產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。其濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。阻遏蛋白通過(guò)同其靶序列間的相互作用，使雙鏈中阻遏蛋白通過(guò)同其靶序列間的相互作用，使雙鏈中的一條斷裂從而導(dǎo)致質(zhì)粒復(fù)制的啟動(dòng)。并建立起一的一條斷裂從而導(dǎo)致質(zhì)粒復(fù)制的啟動(dòng)。并建立起一種調(diào)節(jié)質(zhì)粒拷貝數(shù)的負(fù)反饋環(huán)。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高種調(diào)節(jié)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)反饋環(huán)。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。反之，復(fù)制濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。反之，復(fù)制反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。(1)氯化銫密度梯度離心法(2)堿變性法堿變性法一般條件：一般條件：選擇適合手頭工作目標(biāo)的質(zhì)粒載體選擇適

15、合手頭工作目標(biāo)的質(zhì)粒載體選擇載體上的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)選擇載體上的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)用合適的連接反應(yīng)條件用合適的連接反應(yīng)條件選用最適合擴(kuò)增外源目的的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。選用最適合擴(kuò)增外源目的的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。具備篩選轉(zhuǎn)化子的方法和驗(yàn)證目的基因克隆的技術(shù)具備篩選轉(zhuǎn)化子的方法和驗(yàn)證目的基因克隆的技術(shù)有時(shí)需要特殊的步驟以降低轉(zhuǎn)化菌落的背景。有時(shí)需要特殊的步驟以降低轉(zhuǎn)化菌落的背景。在每一階段都需要設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照。在每一階段都需要設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照。構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略：構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略：()質(zhì)粒載體應(yīng)該能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制。質(zhì)粒載體應(yīng)該能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行

16、有效的復(fù)制。作為質(zhì)粒的克隆載體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。作為質(zhì)粒的克隆載體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。所以含有能在受體細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)所以含有能在受體細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori)，最好是松弛型質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。，最好是松弛型質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。()必須含有允許外源必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，且這樣的片段克隆的位點(diǎn)，且這樣的克隆位點(diǎn)盡可能多?？寺∥稽c(diǎn)盡可能多。為了便于多種類型末端的為了便于多種類型末端的DNA片段的克隆，質(zhì)?？寺∑蔚目寺。|(zhì)?？寺≥d體中往往組裝一個(gè)含多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列載體中往往組裝一個(gè)含多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序

17、列的多克隆位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS)連桿。連桿。()必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。(4)質(zhì)粒載體本身質(zhì)粒載體本身DNA分子應(yīng)盡可能小。分子應(yīng)盡可能小。()根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種元件元件，構(gòu)建，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)粒克隆載體。成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。如在克隆位點(diǎn)上游組裝強(qiáng)的啟動(dòng)子，下游組裝相應(yīng)的終止子，如在克隆位點(diǎn)上游組裝強(qiáng)的啟動(dòng)子，下游組裝相應(yīng)的終止子，就成為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)?？寺≥d體。或者在質(zhì)?？寺≥d體的合適位置就成為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒克隆載體。或者在質(zhì)?？寺≥d體的合適位置組入受體細(xì)胞染色體組入受體細(xì)胞染色體DNA的

18、同源序列，成為基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的同源序列，成為基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的供體質(zhì)?？寺≥d體。的供體質(zhì)?？寺≥d體。質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程應(yīng)遵循的原則質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程應(yīng)遵循的原則：() 選擇合適的復(fù)制起始位點(diǎn)。選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。選擇合適的復(fù)制起始位點(diǎn)。選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。()組裝合適的選擇標(biāo)記基因。組裝合適的選擇標(biāo)記基因。()增加或減少酶切位點(diǎn)。增加或減少酶切位點(diǎn)。正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件。正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。組裝一個(gè)含有多種單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)組裝一個(gè)含有多種單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)(MCS)(4)縮短長(zhǎng)度?？s短長(zhǎng)度。 在能達(dá)到預(yù)期目的前提

19、下，構(gòu)建過(guò)程應(yīng)力求簡(jiǎn)單。在能達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過(guò)程應(yīng)力求簡(jiǎn)單。1、天然質(zhì)粒、天然質(zhì)粒指那些沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。指那些沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。常見(jiàn)的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有：常見(jiàn)的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有：ColE1, RSF2124和和pSC101pSC101是第一個(gè)用于基因克隆的載體。它對(duì)于限制酶是第一個(gè)用于基因克隆的載體。它對(duì)于限制酶EcoR1只有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，而且在此克隆外源不影響只有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，而且在此克隆外源不影響它的復(fù)制功能，也不破壞其唯一的四環(huán)素抗性基因。它的復(fù)制功能，也不破壞其唯一的四環(huán)素抗性基因。其缺點(diǎn)是分子量較大，

20、拷貝數(shù)少，且又只有一個(gè)抗菌素抗性其缺點(diǎn)是分子量較大，拷貝數(shù)少，且又只有一個(gè)抗菌素抗性基因，無(wú)法用插入失活技術(shù)選擇重組分子?；?，無(wú)法用插入失活技術(shù)選擇重組分子。ColE1也只有唯一的單切割位點(diǎn)，且可以根據(jù)大腸桿菌素也只有唯一的單切割位點(diǎn)，且可以根據(jù)大腸桿菌素的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)?？截悢?shù)較高，但要用免疫篩選，的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)?？截悢?shù)較高，但要用免疫篩選，在化學(xué)上相當(dāng)麻煩。在化學(xué)上相當(dāng)麻煩。RSF2124派生于派生于ColE1,可用氨芐青霉素可用氨芐青霉素的抗性標(biāo)記進(jìn)行選擇。但仍然不是較好的載體。的抗性標(biāo)記進(jìn)行選擇。但仍然不是較好的載體。2、理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備以下條件：、理想的質(zhì)粒載

21、體應(yīng)具備以下條件：）具有復(fù)制位點(diǎn)）具有復(fù)制位點(diǎn)）具有抗菌素抗性基因。）具有抗菌素抗性基因。）具有若干個(gè)限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)?？梢詽M足基因克隆的需要）具有若干個(gè)限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)?？梢詽M足基因克隆的需要而且在其中插入適當(dāng)大小的外源片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)而且在其中插入適當(dāng)大小的外源片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能。粒的復(fù)制功能。）具有較少的分子量和較高的拷貝數(shù)。）具有較少的分子量和較高的拷貝數(shù)。3、選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記質(zhì)粒載體含有遺傳標(biāo)記，它賦予帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在選擇條質(zhì)粒載體含有遺傳標(biāo)記，它賦予帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在選擇條件下以較強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。件下以較強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在分子克隆中，這些標(biāo)記用來(lái)：在分子克隆中，這

22、些標(biāo)記用來(lái)：選擇帶有質(zhì)粒的細(xì)菌克隆。選擇帶有質(zhì)粒的細(xì)菌克隆。防止負(fù)載質(zhì)?；蛸|(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)所致的危險(xiǎn)因素，保持防止負(fù)載質(zhì)?；蛸|(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)所致的危險(xiǎn)因素，保持轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。因?yàn)楦呖截惖馁|(zhì)粒和大量的重組蛋白質(zhì)可嚴(yán)重妨礙轉(zhuǎn)化因?yàn)楦呖截惖馁|(zhì)粒和大量的重組蛋白質(zhì)可嚴(yán)重妨礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至生存，為了防止質(zhì)粒被從細(xì)菌中清除，細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至生存，為了防止質(zhì)粒被從細(xì)菌中清除，在培養(yǎng)基中一直加入合適的抗生素來(lái)維持選擇壓力是重在培養(yǎng)基中一直加入合適的抗生素來(lái)維持選擇壓力是重要的。要的。()高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體()低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體目的基因產(chǎn)物含量高時(shí)對(duì)寄主細(xì)胞的正常新陳

23、代謝具有擾亂目的基因產(chǎn)物含量高時(shí)對(duì)寄主細(xì)胞的正常新陳代謝具有擾亂作用時(shí)用。作用時(shí)用。()失控的質(zhì)粒載體失控的質(zhì)粒載體是一些低拷貝的質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型的，也就是一些低拷貝的質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型的，也就是說(shuō)在不同的溫度下，拷貝數(shù)會(huì)有顯著的變化。是說(shuō)在不同的溫度下，拷貝數(shù)會(huì)有顯著的變化。根據(jù)此原理，發(fā)展了失控的質(zhì)粒載體根據(jù)此原理，發(fā)展了失控的質(zhì)粒載體pBEU1和和pBEU2，并成功地用來(lái)擴(kuò)增克隆基因及其編碼產(chǎn)物。并成功地用來(lái)擴(kuò)增克隆基因及其編碼產(chǎn)物。質(zhì)?？衫鄯e到細(xì)胞總的質(zhì)?？衫鄯e到細(xì)胞總的()插入失活的質(zhì)粒載體插入失活的質(zhì)粒載體該類質(zhì)粒至少含有兩個(gè)選擇記號(hào)，在與外源該類質(zhì)粒至少含有

24、兩個(gè)選擇記號(hào)，在與外源DNA的重組過(guò)程中，其中一個(gè)記號(hào)保持完整，用作選擇轉(zhuǎn)化子的重組過(guò)程中，其中一個(gè)記號(hào)保持完整，用作選擇轉(zhuǎn)化子然后根據(jù)另一記號(hào)的插入失活效應(yīng)進(jìn)一步篩選出轉(zhuǎn)化子，此然后根據(jù)另一記號(hào)的插入失活效應(yīng)進(jìn)一步篩選出轉(zhuǎn)化子，此表明它帶有外源表明它帶有外源DNA.()正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體應(yīng)用只有突變體或重組體分子才能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)應(yīng)用只有突變體或重組體分子才能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇?？梢灾苯舆x擇記號(hào)并給予寄主細(xì)胞相應(yīng)條件進(jìn)行選擇?？梢灾苯舆x擇記號(hào)并給予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。的表型。質(zhì)粒質(zhì)粒pKN80帶有來(lái)自帶有來(lái)自Mu噬菌體噬菌體DNA的的EcoR1-C片段，片段，它編碼一種

25、致死功能的它編碼一種致死功能的kil基因。質(zhì)?；颉Ｙ|(zhì)粒pKN80可以在可以在Mu噬菌體溶源菌株中正常地復(fù)制，而對(duì)非溶源菌株是致死噬菌體溶源菌株中正常地復(fù)制，而對(duì)非溶源菌株是致死的。當(dāng)其的。當(dāng)其Hpa1或或HINd3位點(diǎn)插入外源位點(diǎn)插入外源DNA后，便會(huì)使后，便會(huì)使這種致死功能失活。這種致死功能失活。pUR2是另一種正選擇質(zhì)粒載體：是另一種正選擇質(zhì)粒載體：在在X-gal培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子菌落，只有含有培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子菌落，只有含有pUR2質(zhì)粒質(zhì)粒的才能顯示出特有的藍(lán)色，而那些在的才能顯示出特有的藍(lán)色，而那些在EcoR1、BamH1或或Hind3位點(diǎn)具外源插入的位點(diǎn)具外源插入的pUR2

26、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子菌落則質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子菌落則呈現(xiàn)白色。呈現(xiàn)白色。()表達(dá)載體表達(dá)載體按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為表達(dá)載體。的克隆載體特稱為表達(dá)載體。主要組成主要組成包括大腸桿菌的啟動(dòng)子及操縱子位點(diǎn)序列，多克隆位點(diǎn)、包括大腸桿菌的啟動(dòng)子及操縱子位點(diǎn)序列，多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成：由

27、三個(gè)不同來(lái)源的部分組成：第一部分來(lái)源于第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素的氨芐青霉素抗性基因（抗性基因（ampr)第二部分來(lái)源于第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(tetr),第三部分是來(lái)源于第三部分是來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒的派生質(zhì)粒pMB1DNA復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)。其優(yōu)點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)：分子量小分子量小具有兩個(gè)抗菌素抗性基因具有兩個(gè)抗菌素抗性基因插入外源基因后變成插入外源基因后變成ampsTetr 5、常用克隆質(zhì)粒載體介紹、常用克隆質(zhì)粒載體介紹tet 四個(gè)組成部分：來(lái)自于來(lái)自于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性

28、基因，但它的核苷酸序列發(fā)生變化氨芐青霉素抗性基因，但它的核苷酸序列發(fā)生變化不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶位點(diǎn)。不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶位點(diǎn)。大腸桿菌大腸桿菌半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼）的啟動(dòng)子及其編碼肽鏈的序列，此特稱為肽鏈的序列，此特稱為lacZ基因，基因，位于位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5端的一段端的一段多克隆位點(diǎn)區(qū)段多克隆位點(diǎn)區(qū)段。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI

29、 I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pUC19載體載體其多克隆位點(diǎn)是一段特殊設(shè)計(jì)的具有許多不同的核酸內(nèi)切其多克隆位點(diǎn)是一段特殊設(shè)計(jì)的具有許多不同的核酸內(nèi)切酶單一識(shí)別序列的短序列。酶單一識(shí)別序列的短序列。 lacZ基因編碼的基因編碼的肽鏈?zhǔn)请逆準(zhǔn)前肴樘擒彰傅陌被┒说亩唐?，半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的它同失去了正常氨基末端的半乳糖苷酶基因突變體半乳糖苷酶基因突變體互補(bǔ)時(shí)，便會(huì)產(chǎn)出有功能活性的互補(bǔ)時(shí)，便會(huì)產(chǎn)出有功能活性的半乳糖苷酶分子。當(dāng)半乳糖苷酶分子。當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在此種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在此種半乳糖苷酶突變的大

30、腸半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞之后，便會(huì)出現(xiàn)具有功能活性的桿菌細(xì)胞之后，便會(huì)出現(xiàn)具有功能活性的半乳糖酶的積累半乳糖酶的積累,稱為稱為 互補(bǔ)互補(bǔ)。半乳糖苷酶催化二糖乳糖水解為單糖：葡萄糖和半乳糖。半乳糖苷酶催化二糖乳糖水解為單糖：葡萄糖和半乳糖。該酶的活性可以用該酶的活性可以用X-gal(-溴溴-4-氫氫-吲哚吲哚-3- -半乳糖苷）等半乳糖苷）等顯色底物加以檢測(cè)，顯色底物加以檢測(cè)， 半乳糖苷酶可將半乳糖苷酶可將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄赞D(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{(lán)色沉淀。的深藍(lán)色沉淀。由于在正常情況下，任何插入到多克隆位點(diǎn)的外源由于在正常情況下，任何插入到多克隆位點(diǎn)的外源片段，都會(huì)阻斷片段，都會(huì)阻斷肽鏈的合

31、成，因此含有重組質(zhì)粒載體的肽鏈的合成，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆是無(wú)色的，它可以與含有非重組質(zhì)粒載體的克隆形成克隆是無(wú)色的，它可以與含有非重組質(zhì)粒載體的克隆形成的藍(lán)色背景明顯地區(qū)別。的藍(lán)色背景明顯地區(qū)別。其優(yōu)點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)：具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。一步實(shí)現(xiàn)對(duì)重組子克隆適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。一步實(shí)現(xiàn)對(duì)重組子克隆的鑒定。的鑒定。TA載體載體耐熱聚合酶可在耐熱聚合酶可在PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷(A)，根據(jù)此特點(diǎn)研制出線性，根據(jù)此特點(diǎn)研制出線性TA質(zhì)粒載體，其質(zhì)粒載體，

32、其5端各帶有一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺嘧啶端各帶有一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺嘧啶(T)，用該載體可進(jìn)行，用該載體可進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接克隆。產(chǎn)物的直接克隆。 TA質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)普通質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建而成。其方法是將一般質(zhì)粒可通過(guò)普通質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建而成。其方法是將一般質(zhì)粒線性化，然后通過(guò)一些方法形成平末端，再在末端加質(zhì)粒線性化，然后通過(guò)一些方法形成平末端，再在末端加上上T就可得到。就可得到。 常見(jiàn)的有常見(jiàn)的有TaKaRa公司的公司的pMD18-T穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體具有兩種具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)不同復(fù)制起點(diǎn)和和選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記，可在，可在兩種不同的寄主兩種不同的寄主細(xì)胞細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體?？梢詳y帶外源基因在不

33、同中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體?？梢詳y帶外源基因在不同物種細(xì)胞之間，特別是真核和原核細(xì)胞之間往返穿梭，所物種細(xì)胞之間，特別是真核和原核細(xì)胞之間往返穿梭，所以十分有用。以十分有用。目前已構(gòu)建了可在大腸桿菌與枯草桿菌、釀酒酵母和動(dòng)物目前已構(gòu)建了可在大腸桿菌與枯草桿菌、釀酒酵母和動(dòng)物體中進(jìn)行穿梭的載體。植物與大腸桿菌的穿梭載體還未發(fā)體中進(jìn)行穿梭的載體。植物與大腸桿菌的穿梭載體還未發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)。二噬菌體載體二噬菌體載體病毒核酸外殼蛋白外殼蛋白包裝包裝病毒顆粒病毒顆粒病毒顆粒病毒顆粒實(shí)現(xiàn)病毒的實(shí)現(xiàn)病毒的增殖增殖利用此性質(zhì)，可以構(gòu)建各類病毒載體。利用此性質(zhì)，可以構(gòu)建各類病毒載體。感染感染利用其利用其體系體系宿主細(xì)胞

34、宿主細(xì)胞DNA(RNA)復(fù)制復(fù)制和蛋白的和蛋白的合成合成病毒病毒細(xì)菌病毒細(xì)菌病毒植物病毒植物病毒動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒稱噬菌體，有雙鏈的，單鏈的稱噬菌體，有雙鏈的，單鏈的如花椰菜花葉病毒，如花椰菜花葉病毒，煙草花葉病毒等煙草花葉病毒等如如SV40,勞斯肉瘤病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒）勞斯肉瘤病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒）腺病毒哺乳動(dòng)物和禽類中都有分布腺病毒哺乳動(dòng)物和禽類中都有分布痘苗病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿中增殖痘苗病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿中增殖桿狀病毒（感染昆蟲(chóng)等無(wú)脊椎動(dòng)物）桿狀病毒（感染昆蟲(chóng)等無(wú)脊椎動(dòng)物）在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，比原核和真核簡(jiǎn)單但比質(zhì)粒復(fù)雜，因?yàn)樗€編碼蛋白質(zhì)外殼。噬菌體概念噬菌體概念1 保護(hù)自已的核酸分子

35、免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞保護(hù)自已的核酸分子免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞2 將其核酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞將其核酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞3 將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，大量將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，大量產(chǎn)生子代噬菌體。產(chǎn)生子代噬菌體。4 4 使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代噬菌體顆粒使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代噬菌體顆粒無(wú)尾部的二十面體型具尾部的二十面體型（多數(shù)）線狀體型。雙鏈環(huán)性DNA單鏈環(huán)形DNA單鏈線性DNA單鏈RNA噬菌體的感染性噬菌體的感染性噬菌體的感染效率高到令人生畏的程度。噬菌體的感染效率高到令人生畏的程度。在瓊脂糖在瓊脂糖平板上形平板上形成噬菌斑。成噬菌斑。

36、吸附、注入，整合、復(fù)吸附、注入，整合、復(fù)制制形成清晰的噬菌斑形成清晰的噬菌斑噬菌體的噬菌體的生命周期生命周期溶菌周期溶菌周期溶源周期溶源周期吸附、注入，轉(zhuǎn)變、合吸附、注入，轉(zhuǎn)變、合成成 組裝組裝 釋放釋放溶源化溶源化lysogenization：用溫和的噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物：用溫和的噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過(guò)程使之形成溶源性細(xì)菌的過(guò)程。整合：如果噬菌體的整合：如果噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)菌染色體是被包容在寄主細(xì)菌染色體DNA之中，便叫做已整合的噬菌體之中，便叫做已整合的噬菌體DNA.這種噬菌體這種噬菌體DNA組入細(xì)組入細(xì)菌染色體菌染色體DNA的過(guò)程，稱噬菌體的過(guò)程，稱噬菌

37、體DNA的整合或插入。以游的整合或插入。以游離離DNA分子形式存在的噬菌體分子形式存在的噬菌體DNA，叫做非整合的噬菌體，叫做非整合的噬菌體DNA.一些常見(jiàn)概念 一般當(dāng)這些質(zhì)粒或原噬菌體缺失或變異時(shí)也用一般當(dāng)這些質(zhì)?；蛟删w缺失或變異時(shí)也用“( )”或或“/”等加以區(qū)別表示。等加以區(qū)別表示。這種類型的基本特征是不存在噬菌體這種類型的基本特征是不存在噬菌體DNA分子的整合分子的整合作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒粒DNA分子。分子。溶源性細(xì)菌有兩個(gè)重要特點(diǎn)溶源性細(xì)菌有兩個(gè)重要特點(diǎn)第一，不能被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再第一，

38、不能被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種抗御同種噬菌體再感染感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種抗御同種噬菌體再感染的特性，叫做超感染免疫性。的特性，叫做超感染免疫性。第二，經(jīng)過(guò)許多世代之后，溶源性的細(xì)菌便能夠開(kāi)始進(jìn)第二，經(jīng)過(guò)許多世代之后，溶源性的細(xì)菌便能夠開(kāi)始進(jìn)入溶菌周期。這個(gè)過(guò)程叫做溶源性細(xì)菌的誘發(fā)。入溶菌周期。這個(gè)過(guò)程叫做溶源性細(xì)菌的誘發(fā)。在誘發(fā)過(guò)程中，噬菌體基因組以單一在誘發(fā)過(guò)程中，噬菌體基因組以單一DNA片段的形式從片段的形式從寄主染色體寄主染色體DNA上刪除下來(lái)。上刪除下來(lái)。DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)2 選用選用ABCDEFABD+E+F *4 構(gòu)建構(gòu)建BHB2688

39、是是E基因缺失的基因缺失的噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力是有一定限度的。的能力是有一定限度的。上限不得超過(guò)其正常野生型上限不得超過(guò)其正常野生型DNA總量的總量的5左右，而低限左右，而低限又不得少于正常野生型又不得少于正常野生型DNA總量的總量的75。 按野生型按野生型DNA分子長(zhǎng)度為分子長(zhǎng)度為 48kb計(jì)算，即計(jì)算，即噬菌體只容許噬菌體只容許包裝包裝34.6kb的的DNA片段。片段。 編碼必要基因的編碼必要基因的DNA區(qū)段占區(qū)段占28kb，因此，因此載體克隆外源載體克隆外源DNA的理論極限值應(yīng)是最大的理論極限值應(yīng)是最大23kb,最小最小6.6Kb。外源外源DNA克

40、隆到插入型的克隆到插入型的 載體分子上，會(huì)使噬菌體的某些生載體分子上，會(huì)使噬菌體的某些生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。在其免疫區(qū)帶有一兩種核酸內(nèi)切酶的單切割位點(diǎn)。外源片段在其免疫區(qū)帶有一兩種核酸內(nèi)切酶的單切割位點(diǎn)。外源片段插入到該位點(diǎn)之后插入到該位點(diǎn)之后,合成活性阻遏物的功能遭受破壞，不能進(jìn)合成活性阻遏物的功能遭受破壞，不能進(jìn)入溶源周期。入溶源周期。凡帶有外源凡帶有外源DNA插入的插入的 重組體都只能形成清晰的噬菌斑，重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒(méi)有外源而沒(méi)有外源DNA插入的親本噬菌體就會(huì)形成混濁的噬菌斑。插入的親本噬菌體就會(huì)形成混濁的噬菌斑。

41、這種形態(tài)上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標(biāo)志。這種形態(tài)上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標(biāo)志。根據(jù)插入效應(yīng)的特異性，又可分為以下兩種根據(jù)插入效應(yīng)的特異性，又可分為以下兩種可以通過(guò)噬菌斑的顏色判斷有無(wú)外源基因的插入可以通過(guò)噬菌斑的顏色判斷有無(wú)外源基因的插入替換型載體又叫取代型載體，在其中央部替換型載體又叫取代型載體，在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入的分有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子所分子所取代的取代的DNA片段的克隆載體。片段的克隆載體。在構(gòu)建此類載體時(shí)，安排在中央可取代片在構(gòu)建此類載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此當(dāng)

42、外源此當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之間的間的DNA片段便會(huì)被置換掉，從而有效片段便會(huì)被置換掉，從而有效地提高克隆外源地提高克隆外源DNA的能力。的能力。（二）（二） M13噬菌體噬菌體為了測(cè)序的需要，可應(yīng)用絲狀噬菌體產(chǎn)生單鏈為了測(cè)序的需要，可應(yīng)用絲狀噬菌體產(chǎn)生單鏈DNA。M13噬菌體載體以野生型M13噬菌體為原始載體，進(jìn)行以下改造：在IS區(qū)加入選擇性標(biāo)記基因，組裝合適的多克隆位點(diǎn)噬菌體展示載體噬菌體展示載體 在絲狀噬菌體顆粒一端的表面，存在在絲狀噬菌體顆粒一端的表面，存在3-5個(gè)拷貝的基因個(gè)拷貝的基因 編碼的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)對(duì)于噬菌體顆粒的正確組裝，編碼的蛋白質(zhì)。這

43、類蛋白質(zhì)對(duì)于噬菌體顆粒的正確組裝，及其對(duì)大腸桿菌雄性細(xì)胞及其對(duì)大腸桿菌雄性細(xì)胞F性須的吸附過(guò)程，均具有重要性須的吸附過(guò)程，均具有重要功能。功能。 當(dāng)外源當(dāng)外源DNA插入在噬菌體的基因插入在噬菌體的基因 編碼序列中時(shí)，編碼序列中時(shí)，在兩者讀碼結(jié)構(gòu)保持一致的情況下，就會(huì)產(chǎn)生出由克隆基在兩者讀碼結(jié)構(gòu)保持一致的情況下，就會(huì)產(chǎn)生出由克隆基因與基因因與基因 聯(lián)合編碼的融合蛋白質(zhì)。因此可利用此特性構(gòu)聯(lián)合編碼的融合蛋白質(zhì)。因此可利用此特性構(gòu)建噬菌體展示載體。建噬菌體展示載體。 將隨機(jī)的多肽將隨機(jī)的多肽DNA彈夾插入在基因彈夾插入在基因 的編碼序列中，的編碼序列中，使在噬菌體顆粒的表面展現(xiàn)出各種不同的蛋白質(zhì)或多

44、肽使在噬菌體顆粒的表面展現(xiàn)出各種不同的蛋白質(zhì)或多肽此即是通常所說(shuō)的隨機(jī)多肽文庫(kù)。然后通過(guò)親和層析處此即是通常所說(shuō)的隨機(jī)多肽文庫(kù)。然后通過(guò)親和層析處理，將所要分離的某種特定的目標(biāo)噬菌體，例如展示具理，將所要分離的某種特定的目標(biāo)噬菌體，例如展示具有抗體結(jié)合特性的多肽的噬菌體顆粒分離出來(lái)。經(jīng)過(guò)如有抗體結(jié)合特性的多肽的噬菌體顆粒分離出來(lái)。經(jīng)過(guò)如此多次的層析和增殖后，所得的噬菌體制劑便可用于進(jìn)此多次的層析和增殖后，所得的噬菌體制劑便可用于進(jìn)一步富集具有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。一步富集具有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。三、噬菌體三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體質(zhì)粒雜合載體1978年，年，Collins 及及B.Ho

45、hn等人發(fā)展出的柯斯質(zhì)粒載體等人發(fā)展出的柯斯質(zhì)粒載體(cosmid vectors)可以滿足這一要求?？梢詽M足這一要求。Cosmid：是英文：是英文cos site-carrying plasmid縮寫(xiě)而成的?？s寫(xiě)而成的。其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)（其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)（cos）的質(zhì)粒。）的質(zhì)粒。即一類由人工構(gòu)建的含有即一類由人工構(gòu)建的含有Cos位點(diǎn)位點(diǎn)：柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，因此在寄主細(xì)胞內(nèi)能柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，因此在寄主細(xì)胞內(nèi)能夠像質(zhì)粒夠像質(zhì)粒DNA一樣復(fù)制，并且在氯霉素作用下，同樣也一樣復(fù)制，并且在氯霉素作用下，同樣也會(huì)獲得進(jìn)一步的擴(kuò)增。且具有抗菌素標(biāo)記，可供作重組會(huì)獲得

46、進(jìn)一步的擴(kuò)增。且具有抗菌素標(biāo)記，可供作重組體分子表型選擇，有的還帶有插入位點(diǎn)。體分子表型選擇，有的還帶有插入位點(diǎn)。由于其載體分子僅具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一兩個(gè)選擇標(biāo)記和由于其載體分子僅具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一兩個(gè)選擇標(biāo)記和Cos位點(diǎn)等三個(gè)組成部分，其分子量較少，一般只有位點(diǎn)等三個(gè)組成部分，其分子量較少，一般只有5-7kb左右。其克隆極限可達(dá)左右。其克隆極限可達(dá)45kb，比噬菌體和質(zhì)粒載體的最大，比噬菌體和質(zhì)粒載體的最大克隆能力都要大很多。由于包裝限制的緣故，柯斯質(zhì)粒載克隆能力都要大很多。由于包裝限制的緣故，柯斯質(zhì)粒載體的克隆能力還有一個(gè)最低極限制值。如果載體分子為體的克隆能力還有一個(gè)最低極限制值。如果

47、載體分子為5Kb,那么插入片段最少得有那么插入片段最少得有30kb長(zhǎng)。才能夠裝形成具有感染長(zhǎng)。才能夠裝形成具有感染能力的噬菌體顆粒。能力的噬菌體顆粒。因此柯斯質(zhì)粒載體用于克隆大片段的因此柯斯質(zhì)粒載體用于克隆大片段的DNA分子。分子。()一旦柯斯載體與一種帶有同源序列的質(zhì)粒載體共存于同一旦柯斯載體與一種帶有同源序列的質(zhì)粒載體共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞，它們之間便會(huì)形成共合體。如果讓柯斯一個(gè)寄主細(xì)胞，它們之間便會(huì)形成共合體。如果讓柯斯質(zhì)粒與質(zhì)粒各自具有一個(gè)互不相同的抗藥性標(biāo)記及相容質(zhì)粒與質(zhì)粒各自具有一個(gè)互不相同的抗藥性標(biāo)記及相容性的復(fù)制起點(diǎn)，那么當(dāng)它們轉(zhuǎn)化到同一寄主細(xì)胞之后，便性的復(fù)制起點(diǎn)，那么當(dāng)它們轉(zhuǎn)

48、化到同一寄主細(xì)胞之后，便可容易地篩選出含有兩個(gè)不同選擇標(biāo)記的共合體分子?？扇菀椎睾Y選出含有兩個(gè)不同選擇標(biāo)記的共合體分子。 由于包裝限制問(wèn)題，只有當(dāng)柯斯質(zhì)粒含有適當(dāng)數(shù)由于包裝限制問(wèn)題，只有當(dāng)柯斯質(zhì)粒含有適當(dāng)數(shù)量的外源量的外源DNA分子插入的情況下，才會(huì)發(fā)生包裝作用。分子插入的情況下，才會(huì)發(fā)生包裝作用。柯斯克隆的一般過(guò)程：柯斯克隆的一般過(guò)程： 外源基因組的消化外源基因組的消化柯斯質(zhì)粒的線性化及與外源柯斯質(zhì)粒的線性化及與外源DNA分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)。分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)。包裝包裝3 3、柯斯克隆的技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)、柯斯克隆的技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要有兩個(gè)方面：主要有兩個(gè)方面：第一由于柯斯載體兼具了質(zhì)粒和第一由于柯

49、斯載體兼具了質(zhì)粒和 噬菌體兩方面的特性噬菌體兩方面的特性提高了克隆外源提高了克隆外源DNADNA片段的能力片段的能力，可達(dá)，可達(dá)45kb45kb左右，因此左右，因此對(duì)于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)是種特別有用的克隆載體。對(duì)于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)是種特別有用的克隆載體。第二應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作克隆載體，所形成的非重組體的克隆第二應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作克隆載體，所形成的非重組體的克隆本底比較低本底比較低，即便不使用插入失活或堿性磷酸酶對(duì)線性化，即便不使用插入失活或堿性磷酸酶對(duì)線性化的柯斯質(zhì)粒的柯斯質(zhì)粒DNADNA作預(yù)處理，其結(jié)果亦是如此。從而提高了作預(yù)處理，其結(jié)果亦是如此。從而提高了篩選具外源篩選具外源DNADNA的重

50、組體質(zhì)粒的幾率的重組體質(zhì)粒的幾率。（二）噬菌粒載體（二）噬菌粒載體問(wèn)題的提出問(wèn)題的提出M13可方便地用來(lái)制備克隆基因的單鏈可方便地用來(lái)制備克隆基因的單鏈DNA。所以在基因。所以在基因工程研究中很有用。工程研究中很有用。但插入的片段遺傳穩(wěn)定性下降，且隨片段分子量的增加，但插入的片段遺傳穩(wěn)定性下降，且隨片段分子量的增加，其穩(wěn)定性降低的程度也越嚴(yán)重。其穩(wěn)定性降低的程度也越嚴(yán)重。 所以其克隆外源所以其克隆外源DNA的實(shí)際能力十分有限，一般情況下，的實(shí)際能力十分有限，一般情況下，最大克隆能力只有最大克隆能力只有1500bp.使其中真核基因克隆中的實(shí)用價(jià)值大使其中真核基因克隆中的實(shí)用價(jià)值大大折扣。大折扣。

51、 為了解決此問(wèn)題，已經(jīng)發(fā)展出一類由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w為了解決此問(wèn)題，已經(jīng)發(fā)展出一類由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列，稱為噬菌粒載體結(jié)合而成的新型的載體系列，稱為噬菌粒(phasmid)。噬菌粒載體的特點(diǎn)噬菌粒載體的特點(diǎn)噬菌粒載體的分子量一般都比噬菌粒載體的分子量一般都比M13載體的小，約為載體的小，約為3000bp，易于體外操作，可得到長(zhǎng)達(dá)，易于體外操作，可得到長(zhǎng)達(dá)10kb的外源的外源DNA的單鏈序列。的單鏈序列。由于具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)由于具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)因此在大腸桿菌寄主細(xì)胞中，可以按正常的雙鏈質(zhì)粒因此在大腸桿菌寄主細(xì)胞中

52、，可以按正常的雙鏈質(zhì)粒分子形式復(fù)制，形成的雙鏈分子形式復(fù)制，形成的雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)。具有既穩(wěn)定又高產(chǎn)。具有常規(guī)的質(zhì)粒特性。常規(guī)的質(zhì)粒特性。當(dāng)存在著輔助噬菌體的情況下，在噬菌體基因當(dāng)存在著輔助噬菌體的情況下，在噬菌體基因 蛋白蛋白質(zhì)的影響下，噬菌粒的復(fù)制方式發(fā)生改變，又可如同質(zhì)的影響下，噬菌粒的復(fù)制方式發(fā)生改變，又可如同M13載體一樣按滾環(huán)模型復(fù)制產(chǎn)生單鏈的載體一樣按滾環(huán)模型復(fù)制產(chǎn)生單鏈的DNA，并在，并在包裝噬菌體顆粒之后被擠壓出寄主細(xì)胞。包裝噬菌體顆粒之后被擠壓出寄主細(xì)胞。應(yīng)用噬菌?？芍苯舆M(jìn)行克隆應(yīng)用噬菌粒可直接進(jìn)行克隆DNA片段的序列測(cè)定，免片段的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的

53、亞克隆步聚。去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的亞克隆步聚。 與與M13相比，噬菌粒載體具有分子量小、克隆能力大相比，噬菌粒載體具有分子量小、克隆能力大能穩(wěn)定遺傳以及可用來(lái)制備單鏈或雙鏈能穩(wěn)定遺傳以及可用來(lái)制備單鏈或雙鏈DNA等諸多等諸多優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)。 是一對(duì)分別由是一對(duì)分別由pUC18, pUC19質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒與野生型M13噬菌體的基因間隔區(qū)重組而成的噬菌粒載體。除了噬菌體的基因間隔區(qū)重組而成的噬菌粒載體。除了多克隆位點(diǎn)區(qū)的序列取向彼此相反而外，兩者的分多克隆位點(diǎn)區(qū)的序列取向彼此相反而外，兩者的分子結(jié)構(gòu)完全一樣。如果有某一種特定的外源基因被子結(jié)構(gòu)完全一樣。如果有某一種特定的外源基因被插入在這一對(duì)噬菌體

54、多克隆位點(diǎn)區(qū)的同一種限制位插入在這一對(duì)噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的同一種限制位點(diǎn)上，那么所形成的重組載體中的一個(gè)將轉(zhuǎn)錄克隆點(diǎn)上，那么所形成的重組載體中的一個(gè)將轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈基因的正鏈DNA,而另一重組載體則轉(zhuǎn)錄克隆基因的而另一重組載體則轉(zhuǎn)錄克隆基因的負(fù)鏈。負(fù)鏈。染色體結(jié)構(gòu)染色體結(jié)構(gòu)真核生物的染色體在形態(tài)上具有共同的特征：真核生物的染色體在形態(tài)上具有共同的特征：線狀、中間有著絲粒把染色體分成兩臂，兩線狀、中間有著絲粒把染色體分成兩臂，兩臂末端各有一個(gè)端粒，在染色體上有數(shù)目不等臂末端各有一個(gè)端粒，在染色體上有數(shù)目不等的復(fù)制起始點(diǎn)。的復(fù)制起始點(diǎn)。是真核生物染色體是真核生物染色體的三個(gè)最基本的組成元件。的

55、三個(gè)最基本的組成元件。著絲粒著絲粒DNA稱稱CEN DNA復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)DNA為自主復(fù)制序列為自主復(fù)制序列(ARS)人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體 實(shí)際上是一種穿梭載體。實(shí)際上是一種穿梭載體。含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體源質(zhì)粒復(fù)制起始位含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，還含有第二受體染色體點(diǎn)，還含有第二受體染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。人工染色體載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式人工染色體載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外

56、與目的進(jìn)行高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記，篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記，而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特型，與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點(diǎn)是能容納長(zhǎng)達(dá)點(diǎn)是能容納長(zhǎng)達(dá)1000甚至甚至3000kb的外源的外源DNA片段。片段。(一）酵母人工染色體（一）酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC）1983年，年，Murray and zostakYAC 載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：需要，必須含有以下元件：端粒重復(fù)序列端粒重復(fù)序列著絲粒