大鼠超敏C反應蛋白hs-CRP酶聯(lián)免疫分析

1、大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中超敏C反應蛋白（hs-CRP）的含量實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平。用純化的大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入超敏C反應蛋白（hs-CRP）,再與HRP標記的hs-CRP抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的超敏C反應蛋白（hs-CRP

2、）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）濃度。試劑盒組成試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1個1個酶標包被板1X481X962-8C保存標準品：9聞/L0.5mlX1瓶0.5mlX1瓶2-8C保存標準品稀釋液1.5mlX1瓶1.5mlX1瓶2-8C保存酶標試劑3mlX1瓶6mlx1瓶2-8C保存樣品稀釋液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑A液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑B液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存終止液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保

3、存20倍濃縮洗滌液20mlx1瓶23mlx1瓶2-8C保存樣本處理及要求：1 .血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。2 .血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離，3 .尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4 .細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20

4、分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000車t/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。5 .組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8C的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6 .標本采集后盡早進行提

5、取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20C保存，但應避免反復凍融.7 .不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟：1 .標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100出然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液504,混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100d分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50小混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50M棄掉，再各取50M分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻；混勻后從第五、第六孔中各取5

6、0M分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50出混勻后從第七、第八孔中分別取50M加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50口，混勻后從第九第十孔中各取50M棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50小濃度分別為6閔/L,4聞/L,2閔/L,10L,0.5聞/L）。2 .加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40小然后再加待測樣品10口（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3 .溫育:用封板膜封板后置37c溫育30分鐘。4 .配液：將20倍

7、濃縮洗滌液用蒸儲水20倍稀釋后備用。5 .洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6 .加酶：每孔加入酶標試劑504,空白孔除外。7 .溫育:操作同3。8 .洗滌：操作同5。9 .顯色：每孔先加入顯色劑A50U,再加入顯色劑B50M,輕輕震蕩混勻，37c避光顯色15分鐘.10 .終止：每孔加終止液50此終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11 .測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。注意事項:1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板

8、條應裝入密封袋中保存。2 .濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3 .各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 .請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）o5 .封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 .底物請避光保存。7 .嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準8 .所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染

9、物處理。9 .本試劑不同批號組分不得混用。10 .如與英文說明書有異，以英文說明書為準。（此圖僅供參考）計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。試劑盒性能：1 .樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。2 .批內(nèi)與批見應分別小于9%和11%檢測范圍：0.3閔/L-801_保存條件及有效期：1 .試劑盒保存：；2-8C。2 .有效期：6個月Rathighsensit

10、ivityC-ReactiveProteinFORRESEARCHUSEONLYDrugNamesGenericNameRathighsensitivityC-ReactiveProtein(hs-CRP)ELISAKit.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofhs-CRPconcentrationsnRatserum,bloodplasma,andotherbiologicalfluids.PrincipleoftheassayThekitassayRaths-CRPlevelinthesampUsePurifiedRaths-CRPantibod

11、ytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddhs-CRPtowells,Combinedhs-CRPantibodywhichWithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphu

12、ricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyitawavelengthof450nm.Theconcentrationfhs-CRPinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closurepla

13、temembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8CStandard9聞/L0.5ml1Xbottle0.5ml1Xbottle2-8CStandarddiluent1.5ml1Xbottle1.5ml1Xbottle2-8CHRP-Conjugatereagent3ml1bottle6ml1bottle2-8CSamplediluent3ml1bottle6ml1bottle2-8CChromogenSolutionA3ml1bottle6ml1bottle2-8CChromogenSolutionB3ml1bottle6ml1bottle2-

14、8CStopSolution3ml1bottle6ml1bottle2-8Cwashsolution20ml1bottle30ml1bottle2-8CSpecimenrequirements1. serum-coagulationatroomtemperature10-20geistrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.2. plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant

15、,mix10-20mins,centrifugatior20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.3. Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrosp

16、inalfluidReferencetoit.4. cellculturesupernatan-detectsecretorycomponentscollectsueasterilecontainer,centrifugatior20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detedthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS(PH7.2-7.4,Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagece

17、llsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.5. TissuesamplesAftercuttingsamples,checktheweight,addPPHS7.2-7.4,Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-aftermelting,addPBSPH7.4,Homogenizedby

18、handorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.6. extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextractionIfitcant,specimencanbekeptin-20topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.7. Can

19、tdetectthesamplewhichcoN0N3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure1 .DiluteandaddsampletoStandard:set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100仙ltothefirstandthesecondwell,thenaddStand50didilurtittnefirstandthesecondwell,mix;takeout100仙lformthefirstandthesecondwellthenaddittothethiand

20、theforthwellseparatelythenaddStandarddilution50仙tothethirdandtheforthwell,mix;thentakeout50仙lfromthethirdandtheforthwelldiscard,add50thesixthwell,thenaddStandarddili5i0)nltothefifthandthesixthwell,mix;takeout50fromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50仙lt

21、otheseventhandtheeighthwell,mix;takeout50仙lfromtheseveneighthwellandaddtotheninthandthetenthwell,addStandard50lutionotheninthandthetenthwell,mix,takeout50mtheninthpahfrcthetenthwescard(addSample50仙ltoeachwellafterDiluting,(dens6ty:g/Lag/|2ag/Lag/10.5ag/L2 .addsampleSetblankwellsseparately(blankcompa

22、risonwellsdonatddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissame).testingsamplewell.addSampledilution40(itlotestingsamplewel,thenaddtestingsample10仙Qsamplefinaldilutionis5-fold),addsampletoweldonttouhletwellwallasfaraspossible,andGentlymix.1.1 ncubate:AfterclosingplatewithClosureplatememb

23、rane,incubatefor30Cminat374 .Configurateliquid:washsolutiondiluted20-foldwithdistilledwaterandreserve.5 .washingUncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.6 .addenzymeAddHRP-Conjugatereagent仙ltoeachwell,excebtankwell.7.

24、incubateOperationwith3.8.washingOperationwith5.9.colorAddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat23710.StopthereactionAddStopSolutio50(itbeachwell,Stopthereaction(thdoluecolorchangetoyellowcolor).Il.assaytakeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterA

25、ddingStopSolutionandwithin15min.Importantnotes1. Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.2. washingbufferwillCrystallizatiorseparationjtcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.W