層析填料CaptoMMC的使用說明

1、CaptoMMC皇家藥院CaptorMMC是一種耐鹽的多模式的生物處理媒介，在使用填充床色譜法從大量的培養(yǎng)液中純化蛋白質(zhì)時(shí)可以作為捕獲介質(zhì)和中間純化介質(zhì)。CaptoMMC在提高生產(chǎn)力的同時(shí)降低了生產(chǎn)成本：在高電導(dǎo)率下具有很高的動(dòng)態(tài)載量；高容量的吞吐量；新的選擇性；更小的操作單元。1生物處理媒介生物處理媒介因?yàn)樯a(chǎn)規(guī)模的色譜層析而得到發(fā)展。所有的生物處理媒介均經(jīng)驗(yàn)證方法進(jìn)行生產(chǎn)，并且經(jīng)過測(cè)試以滿足生產(chǎn)的需求。安全的訂購和交付模式能夠?yàn)橐?guī)模生產(chǎn)需要的媒介提供可靠的供應(yīng)。法規(guī)支持文件（RSF）可用來協(xié)助工藝驗(yàn)證和提交給監(jiān)管機(jī)構(gòu)。生物處理媒介可以覆蓋從捕獲到精純的所有純化步驟。2CaptoMMC的特性

2、CaptoMMC具有多種官能團(tuán)的配體，多種作用方式的官能團(tuán)使配體具有不同于傳統(tǒng)離子交換劑的選擇性，且在高鹽條件下仍具有結(jié)合蛋白質(zhì)的活性。CaptoMMC與大分子間存在多種作用方式，其中最顯著就是離子作用，氫鍵和疏水作用。CaptoMMC是為了提高介質(zhì)在捕獲和中間純化步驟中的速度和通量而設(shè)計(jì)的。通過提高高鹽濃度下的容量和低反壓條件下的流速，而減短生產(chǎn)周期和提供生產(chǎn)力。該媒介以高流速的瓊脂糖為基質(zhì)，典型的大規(guī)模柱子（直徑為1m,柱床高專業(yè)資料度為20cm）在頂板壓力低于3bar時(shí)流速為600cm/h或者更高。高交聯(lián)度的瓊脂糖基質(zhì)提供了很高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。容量、洗脫行為和壓力/流速等特性不受層析

3、過程常用溶液的影響。CaptoMMCSepharose6PostFlow乏K1O口一學(xué)CaptoMMC和瓊脂糖6快速的壓力-流速特性比較，工作條件Table1.CharacteristicsofCaptoMMC.Matrixhighlycross-linkedagaroseFunctionalgroupmultimodalweakcationexchangerTotalioniccapacity0.07-0.09mmolH7mlmediumParticlesize*75pmld50v)Flowvelocityatleast600cm/hina1mdiametercolumnwith20cmbe

4、dheightat20&Cusingprocessbufferswiththesameviscosityaswcite1rat<3bar(0.3MPa).Dynamicbindingcapacity1>45mgBSA/mlmediumat30mS/cmpHstability1shortterm2-14longterrn2-12Workingtemperature4+4to+30Chemicalstabilityoilcommonlyusedaqueousbuffers,1Maceticocid,1Msodiumhydroxide1.8Mureah6Mguonidinehyd

5、rochloride,and70%ethanolAvoidoxidizingagents,cationicdetergents3方法設(shè)計(jì)和優(yōu)化設(shè)計(jì)和優(yōu)化生物大分子分離方法的目的是確定實(shí)驗(yàn)條件，在盡可能短的時(shí)間和盡可能高的產(chǎn)品回收率的條件下提高目的分子的最大吸附量。專業(yè)資料在結(jié)合蛋白時(shí)，CaptoMMC的作用類似于弱陽離子交換劑。因?yàn)樵试S在高電導(dǎo)率條件下吸附蛋白，所以可能不需要為了提高填料的結(jié)合能力而去篩選最優(yōu)化的加載電導(dǎo)率。然而加載電導(dǎo)率可能會(huì)影響吸附選擇性。CaptoMMC在高電導(dǎo)率條件下對(duì)蛋白的有效捕獲的特性在許多情況下會(huì)限制提高鹽濃度以洗脫蛋白質(zhì)的方法的使用。通常可以通過聯(lián)合改變pH、緩

6、沖液濃度和洗脫鹽而摸索到最優(yōu)的洗脫條件。為了建立最優(yōu)的洗脫方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種研究多種參數(shù)對(duì)蛋白回收率的影響的有效方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的例子如應(yīng)用說明11-0035-48所述，或者可以應(yīng)用最優(yōu)化的梯度洗脫方法。4建議的純化方案使培養(yǎng)液的pH比目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)低0.52.0個(gè)pH。需要根據(jù)具體的目標(biāo)分子確定精確的pH0使用與培養(yǎng)液相同pH的起始緩沖液平衡柱子；上樣；用起始緩沖液洗去未結(jié)合的樣品；按照以下方式洗脫目標(biāo)蛋白：4.1 通過使用低于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5、1.5、2.5個(gè)pH的緩沖液或者使用pH梯度緩沖液篩選最優(yōu)洗脫pH。如果需要可以將目標(biāo)蛋白開始洗脫的pH作為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化。4.2 在步驟1

7、確定的pH條件下，使用0.5、1.0、1.5M的鹽溶液篩選洗脫的鹽濃度。4.3 如果需要進(jìn)一步優(yōu)化，可以提高緩沖鹽的濃度，如從50Mm250mM。4.4 如果目標(biāo)蛋白仍然以級(jí)分的不對(duì)稱峰洗脫，可以更換洗脫鹽，如NaCl改為NH4CL。4.5 尿素和有機(jī)修飾劑等添加劑某些蛋白的回收率。5通量的優(yōu)化優(yōu)化方案主要需要考慮產(chǎn)品回收率和吞吐量之間的關(guān)系。使用實(shí)際給料過程的前沿分析檢測(cè)對(duì)目標(biāo)蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。由于在樣本應(yīng)用程序中，動(dòng)態(tài)結(jié)合能力是流速的函數(shù)，突破能力必須通過各種不同的停留時(shí)間來定義（流速），以顯示最佳的吞吐量水平。專業(yè)資料6放大在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的方法得到優(yōu)化之后，可以按比例進(jìn)行放大。6.1 根

8、據(jù)載量的需要選擇柱床體積。6.2 選擇一個(gè)直徑合適的柱子使柱床高度能達(dá)到1045cm之間，為了充分利用CaptoMMC,在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)我們建議柱床的高度為20cm或更高。6.3 在進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)時(shí)，在增加柱子直徑和體積流量的同時(shí)通常都會(huì)保持柱床高度和流速恒定。然而，在優(yōu)化方案時(shí)會(huì)優(yōu)先選擇小的柱體積，這是為了節(jié)省樣品和緩沖液，如優(yōu)化動(dòng)態(tài)結(jié)合能力等參數(shù)時(shí)會(huì)選擇比最終高度更低的柱子高度。只要保留時(shí)間是恒定的，目標(biāo)分子的結(jié)合能力就保持不變。其它的因素如關(guān)鍵雜質(zhì)的清洗會(huì)隨著柱床高度的改變而改變，需要在最終柱床高度進(jìn)行驗(yàn)證。滯留時(shí)間近似等于柱床高度與流速的比值。7實(shí)驗(yàn)室規(guī)模柱子的填裝以下是關(guān)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模柱子

9、的填裝的說明：10cm柱床高度的Tricorn5/100,Tricorn10/100,XK16/20；40cm的XK16/70。需要更詳細(xì)的了解Tricorn的填裝，可以查看相關(guān)資料。7.1 填裝Tricorn5/100and10/1007.1.1 材料：CaptoMMC;玻璃過濾漏斗；塑料勺；過濾瓶；量筒；20%乙醇媒介的量：所需的CaptoMMC可以通過以下公式計(jì)算：柱子的橫截面積（cm2）x柱床高度（cm）蟲縮因子（媒介的沉降體積/填裝后媒介的體積）。壓縮因子近似等于1.15。例如：柱床高度為10cm的Tricorn5/100需要的沉降媒介體積為：0.7810X1.15=9ml。準(zhǔn)備懸浮

10、液：懸浮液的體積等于沉降媒介體積除以懸浮液的濃度。填裝的時(shí)候，懸浮液的濃度應(yīng)該達(dá)到60%o平衡所有的物料至室溫，將玻璃過濾漏斗安裝到過濾瓶上。將填料傾倒至漏斗并用20%乙醇洗滌（每1ml填料使用6ml的20%乙醇）。將沉降的填料轉(zhuǎn)移至燒杯加入適量的20%的乙醇。為了最終得到一個(gè)準(zhǔn)確的柱床高度，懸浮液過夜靜置或3000rpm離心3min后，使用量筒進(jìn)行測(cè)量，度數(shù)專業(yè)資料前應(yīng)等待5min。也可以先使用過量的填料裝住然后再移去多余的填料。7.1.2 填裝步驟1.8裝柱效果的評(píng)價(jià)通過測(cè)定柱效來檢查裝柱的質(zhì)量。在裝柱和柱子的工作壽命之間應(yīng)定期測(cè)定柱效，特別是柱子的分離性能降低的時(shí)候。柱子效果的最好的表達(dá)

11、方式是在同等高度條件下的理論塔板（HEPT）和非對(duì)稱因子（As）,使用1%的丙酮溶液作為樣品，可以很容易的檢測(cè)出以上兩者的值。氯化鈉也可以作為檢測(cè)物質(zhì)，使用2M、0.5M的氯化鈉水溶液作為洗脫液。注解：計(jì)算出來的塔板數(shù)會(huì)隨著檢測(cè)條件的變化而變化，它只能作為一個(gè)參考值。保持測(cè)試條件和設(shè)備的穩(wěn)定對(duì)于結(jié)果的可比性是非常重要的。溶質(zhì)、溶劑、洗脫液、上樣體積、流速、液體通路、溫度等的變化都會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。為了達(dá)到最佳的效果，上樣體積應(yīng)為柱床最大體積的2.5%,流速應(yīng)為1530cm/h。如果定義一個(gè)與柱效相關(guān)的驗(yàn)收極限，柱子的理論塔板數(shù)可以作為柱子使用的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。理論塔板（HETP）和不對(duì)稱因子（As）

12、的測(cè)量方法：HETP=L/NN=5.54X（Vr/Wh）2L為柱床高度（cm）N為理論塔板數(shù)VR為從進(jìn)樣開始至峰最高值的洗脫體積Wh為1/2最高峰處的峰寬折合板高常作為柱效比較的參數(shù)?？赏ㄟ^以下公式計(jì)算：HETP/dd為填料的粒徑，指導(dǎo)性原則：3通常都可以接受。吸收峰應(yīng)該是對(duì)稱，不對(duì)稱因子應(yīng)盡可能接近與1（081.5之間均可以接受）。峰形的改變常常是柱床發(fā)生改變的第一個(gè)跡象。不對(duì)稱因子的計(jì)算方法：AS=b/a專業(yè)資料a為10%峰高處的半峰寬（前）b為10%峰高處的半峰寬（后）。以丙酮為標(biāo)志物，通過紫外檢測(cè)的計(jì)算HETP和As的經(jīng)典方法，如下圖所示Fig.3.AtypicaltestchoEdt

13、ogQmshowingthepQQmetesusedforHETPandA5calculations.9保養(yǎng)為了能使CaptoMMC在工作壽命期間保持最好的分離效果，按以下步驟進(jìn)行保養(yǎng)。9.1 平衡在裝柱之后或進(jìn)行層析操作之前，使用至少5個(gè)柱床體積的起始緩沖液沖洗，或者直到流穿的電導(dǎo)和pH值保持不變。9.2 再生每次分離后，用高離子強(qiáng)度的溶液洗脫可逆性的結(jié)合物（例如2MNaCL的緩沖液），此外將pH調(diào)至1011o使用至少5個(gè)柱床體積的起始緩沖液沖洗，專業(yè)資料或者直到流穿的電導(dǎo)和pH值保持不變。9.3 原位清洗原位清洗是指除去柱子再生之后仍殘留的脂肪、內(nèi)毒素、沉淀或變性蛋白質(zhì)等污漬。在用粗料液上

14、樣的時(shí)候常會(huì)帶來這樣的雜質(zhì)。定期的原位清洗能夠防止污漬在柱床的堆積，還可以保持CaptoMMC的載量、流速和常規(guī)性能。應(yīng)根據(jù)污漬類型的不同設(shè)置特定的原位清洗步驟。原位清洗的頻率取決于環(huán)境和料液的情況，但是對(duì)于捕獲來說，建議每次循環(huán)后都進(jìn)行一次原位清洗。CIPprotocolsPrecipitated,hydrophobicallyboundWashwith1MNaOHat40cm/hwithproteinsorlipoproteinsp/esedflowdirection.Contacttime1-2hours,dependentonfeed.Ionicallyboundpctein5Wash

15、with0.5-2columnvolumesof2MNoCiwithreversedflawdirection.Contacttimel0-15min.Lipidsand?eryhydrophobicproteinsWashwith2-4columnvolumesofupto70%ethanol*or30%iso-propanolwithevRsEdflowdirection.Contacttime1-2hours,dependentonfeed.Alternatively,washwith2-4columnvolumesof0.1%non-ionicdetergentwithreversedflowdirection.Contacttime1-2hours,dependentonfeed.*Specificregulationsmayapplywhenusing70%e