層析填料CaptoMMC的使用說明

1、CaptoMMC皇家藥院CaptorMMC是一種耐鹽的多模式的生物處理媒介，在使用填充床色譜法從大量的培養(yǎng)液中純化蛋白質(zhì)時可以作為捕獲介質(zhì)和中間純化介質(zhì)。CaptoMMC在提高生產(chǎn)力的同時降低了生產(chǎn)成本：在高電導(dǎo)率下具有很高的動態(tài)載量；高容量的吞吐量；新的選擇性；更小的操作單元。1生物處理媒介生物處理媒介因為生產(chǎn)規(guī)模的色譜層析而得到發(fā)展。所有的生物處理媒介均經(jīng)驗證方法進行生產(chǎn)，并且經(jīng)過測試以滿足生產(chǎn)的需求。安全的訂購和交付模式能夠為規(guī)模生產(chǎn)需要的媒介提供可靠的供應(yīng)。法規(guī)支持文件（RSF）可用來協(xié)助工藝驗證和提交給監(jiān)管機構(gòu)。生物處理媒介可以覆蓋從捕獲到精純的所有純化步驟。2CaptoMMC的特性

2、CaptoMMC具有多種官能團的配體，多種作用方式的官能團使配體具有不同于傳統(tǒng)離子交換劑的選擇性，且在高鹽條件下仍具有結(jié)合蛋白質(zhì)的活性。CaptoMMC與大分子間存在多種作用方式，其中最顯著就是離子作用，氫鍵和疏水作用。CaptoMMC是為了提高介質(zhì)在捕獲和中間純化步驟中的速度和通量而設(shè)計的。通過提高高鹽濃度下的容量和低反壓條件下的流速，而減短生產(chǎn)周期和提供生產(chǎn)力。該媒介以高流速的瓊脂糖為基質(zhì)，典型的大規(guī)模柱子（直徑為1m,柱床高專業(yè)資料度為20cm）在頂板壓力低于3bar時流速為600cm/h或者更高。高交聯(lián)度的瓊脂糖基質(zhì)提供了很高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。容量、洗脫行為和壓力/流速等特性不受層析

3、過程常用溶液的影響。CaptoMMCSepharose6PostFlow乏K1O口一學(xué)CaptoMMC和瓊脂糖6快速的壓力-流速特性比較，工作條件Table1.CharacteristicsofCaptoMMC.Matrixhighlycross-linkedagaroseFunctionalgroupmultimodalweakcationexchangerTotalioniccapacity0.07-0.09mmolH7mlmediumParticlesize*75pmld50v)Flowvelocityatleast600cm/hina1mdiametercolumnwith20cmbe

4、dheightat20&Cusingprocessbufferswiththesameviscosityaswcite1rat<3bar(0.3MPa).Dynamicbindingcapacity1>45mgBSA/mlmediumat30mS/cmpHstability1shortterm2-14longterrn2-12Workingtemperature4+4to+30Chemicalstabilityoilcommonlyusedaqueousbuffers,1Maceticocid,1Msodiumhydroxide1.8Mureah6Mguonidinehyd

5、rochloride,and70%ethanolAvoidoxidizingagents,cationicdetergents3方法設(shè)計和優(yōu)化設(shè)計和優(yōu)化生物大分子分離方法的目的是確定實驗條件，在盡可能短的時間和盡可能高的產(chǎn)品回收率的條件下提高目的分子的最大吸附量。專業(yè)資料在結(jié)合蛋白時，CaptoMMC的作用類似于弱陽離子交換劑。因為允許在高電導(dǎo)率條件下吸附蛋白，所以可能不需要為了提高填料的結(jié)合能力而去篩選最優(yōu)化的加載電導(dǎo)率。然而加載電導(dǎo)率可能會影響吸附選擇性。CaptoMMC在高電導(dǎo)率條件下對蛋白的有效捕獲的特性在許多情況下會限制提高鹽濃度以洗脫蛋白質(zhì)的方法的使用。通?？梢酝ㄟ^聯(lián)合改變pH、緩

6、沖液濃度和洗脫鹽而摸索到最優(yōu)的洗脫條件。為了建立最優(yōu)的洗脫方案，實驗設(shè)計是一種研究多種參數(shù)對蛋白回收率的影響的有效方法，實驗設(shè)計方法的例子如應(yīng)用說明11-0035-48所述，或者可以應(yīng)用最優(yōu)化的梯度洗脫方法。4建議的純化方案使培養(yǎng)液的pH比目標蛋白的等電點低0.52.0個pH。需要根據(jù)具體的目標分子確定精確的pH0使用與培養(yǎng)液相同pH的起始緩沖液平衡柱子；上樣；用起始緩沖液洗去未結(jié)合的樣品；按照以下方式洗脫目標蛋白：4.1 通過使用低于目標蛋白等電點0.5、1.5、2.5個pH的緩沖液或者使用pH梯度緩沖液篩選最優(yōu)洗脫pH。如果需要可以將目標蛋白開始洗脫的pH作為基礎(chǔ)進行優(yōu)化。4.2 在步驟1

7、確定的pH條件下，使用0.5、1.0、1.5M的鹽溶液篩選洗脫的鹽濃度。4.3 如果需要進一步優(yōu)化，可以提高緩沖鹽的濃度，如從50Mm250mM。4.4 如果目標蛋白仍然以級分的不對稱峰洗脫，可以更換洗脫鹽，如NaCl改為NH4CL。4.5 尿素和有機修飾劑等添加劑某些蛋白的回收率。5通量的優(yōu)化優(yōu)化方案主要需要考慮產(chǎn)品回收率和吞吐量之間的關(guān)系。使用實際給料過程的前沿分析檢測對目標蛋白的動態(tài)結(jié)合能力。由于在樣本應(yīng)用程序中，動態(tài)結(jié)合能力是流速的函數(shù)，突破能力必須通過各種不同的停留時間來定義（流速），以顯示最佳的吞吐量水平。專業(yè)資料6放大在實驗室規(guī)模的方法得到優(yōu)化之后，可以按比例進行放大。6.1 根

8、據(jù)載量的需要選擇柱床體積。6.2 選擇一個直徑合適的柱子使柱床高度能達到1045cm之間，為了充分利用CaptoMMC,在大規(guī)模生產(chǎn)時我們建議柱床的高度為20cm或更高。6.3 在進行放大實驗時，在增加柱子直徑和體積流量的同時通常都會保持柱床高度和流速恒定。然而，在優(yōu)化方案時會優(yōu)先選擇小的柱體積，這是為了節(jié)省樣品和緩沖液，如優(yōu)化動態(tài)結(jié)合能力等參數(shù)時會選擇比最終高度更低的柱子高度。只要保留時間是恒定的，目標分子的結(jié)合能力就保持不變。其它的因素如關(guān)鍵雜質(zhì)的清洗會隨著柱床高度的改變而改變，需要在最終柱床高度進行驗證。滯留時間近似等于柱床高度與流速的比值。7實驗室規(guī)模柱子的填裝以下是關(guān)于實驗室規(guī)模柱子

9、的填裝的說明：10cm柱床高度的Tricorn5/100,Tricorn10/100,XK16/20；40cm的XK16/70。需要更詳細的了解Tricorn的填裝，可以查看相關(guān)資料。7.1 填裝Tricorn5/100and10/1007.1.1 材料：CaptoMMC;玻璃過濾漏斗；塑料勺；過濾瓶；量筒；20%乙醇媒介的量：所需的CaptoMMC可以通過以下公式計算：柱子的橫截面積（cm2）x柱床高度（cm）蟲縮因子（媒介的沉降體積/填裝后媒介的體積）。壓縮因子近似等于1.15。例如：柱床高度為10cm的Tricorn5/100需要的沉降媒介體積為：0.7810X1.15=9ml。準備懸浮

10、液：懸浮液的體積等于沉降媒介體積除以懸浮液的濃度。填裝的時候，懸浮液的濃度應(yīng)該達到60%o平衡所有的物料至室溫，將玻璃過濾漏斗安裝到過濾瓶上。將填料傾倒至漏斗并用20%乙醇洗滌（每1ml填料使用6ml的20%乙醇）。將沉降的填料轉(zhuǎn)移至燒杯加入適量的20%的乙醇。為了最終得到一個準確的柱床高度，懸浮液過夜靜置或3000rpm離心3min后，使用量筒進行測量，度數(shù)專業(yè)資料前應(yīng)等待5min。也可以先使用過量的填料裝住然后再移去多余的填料。7.1.2 填裝步驟1.8裝柱效果的評價通過測定柱效來檢查裝柱的質(zhì)量。在裝柱和柱子的工作壽命之間應(yīng)定期測定柱效，特別是柱子的分離性能降低的時候。柱子效果的最好的表達

11、方式是在同等高度條件下的理論塔板（HEPT）和非對稱因子（As）,使用1%的丙酮溶液作為樣品，可以很容易的檢測出以上兩者的值。氯化鈉也可以作為檢測物質(zhì)，使用2M、0.5M的氯化鈉水溶液作為洗脫液。注解：計算出來的塔板數(shù)會隨著檢測條件的變化而變化，它只能作為一個參考值。保持測試條件和設(shè)備的穩(wěn)定對于結(jié)果的可比性是非常重要的。溶質(zhì)、溶劑、洗脫液、上樣體積、流速、液體通路、溫度等的變化都會對結(jié)果造成影響。為了達到最佳的效果，上樣體積應(yīng)為柱床最大體積的2.5%,流速應(yīng)為1530cm/h。如果定義一個與柱效相關(guān)的驗收極限，柱子的理論塔板數(shù)可以作為柱子使用的驗收標準。理論塔板（HETP）和不對稱因子（As）

12、的測量方法：HETP=L/NN=5.54X（Vr/Wh）2L為柱床高度（cm）N為理論塔板數(shù)VR為從進樣開始至峰最高值的洗脫體積Wh為1/2最高峰處的峰寬折合板高常作為柱效比較的參數(shù)?？赏ㄟ^以下公式計算：HETP/dd為填料的粒徑，指導(dǎo)性原則：3通常都可以接受。吸收峰應(yīng)該是對稱，不對稱因子應(yīng)盡可能接近與1（081.5之間均可以接受）。峰形的改變常常是柱床發(fā)生改變的第一個跡象。不對稱因子的計算方法：AS=b/a專業(yè)資料a為10%峰高處的半峰寬（前）b為10%峰高處的半峰寬（后）。以丙酮為標志物，通過紫外檢測的計算HETP和As的經(jīng)典方法，如下圖所示Fig.3.AtypicaltestchoEdt

13、ogQmshowingthepQQmetesusedforHETPandA5calculations.9保養(yǎng)為了能使CaptoMMC在工作壽命期間保持最好的分離效果，按以下步驟進行保養(yǎng)。9.1 平衡在裝柱之后或進行層析操作之前，使用至少5個柱床體積的起始緩沖液沖洗，或者直到流穿的電導(dǎo)和pH值保持不變。9.2 再生每次分離后，用高離子強度的溶液洗脫可逆性的結(jié)合物（例如2MNaCL的緩沖液），此外將pH調(diào)至1011o使用至少5個柱床體積的起始緩沖液沖洗，專業(yè)資料或者直到流穿的電導(dǎo)和pH值保持不變。9.3 原位清洗原位清洗是指除去柱子再生之后仍殘留的脂肪、內(nèi)毒素、沉淀或變性蛋白質(zhì)等污漬。在用粗料液上

14、樣的時候常會帶來這樣的雜質(zhì)。定期的原位清洗能夠防止污漬在柱床的堆積，還可以保持CaptoMMC的載量、流速和常規(guī)性能。應(yīng)根據(jù)污漬類型的不同設(shè)置特定的原位清洗步驟。原位清洗的頻率取決于環(huán)境和料液的情況，但是對于捕獲來說，建議每次循環(huán)后都進行一次原位清洗。CIPprotocolsPrecipitated,hydrophobicallyboundWashwith1MNaOHat40cm/hwithproteinsorlipoproteinsp/esedflowdirection.Contacttime1-2hours,dependentonfeed.Ionicallyboundpctein5Wash

15、with0.5-2columnvolumesof2MNoCiwithreversedflawdirection.Contacttimel0-15min.Lipidsand?eryhydrophobicproteinsWashwith2-4columnvolumesofupto70%ethanol*or30%iso-propanolwithevRsEdflowdirection.Contacttime1-2hours,dependentonfeed.Alternatively,washwith2-4columnvolumesof0.1%non-ionicdetergentwithreversedflowdirection.Contacttime1-2hours,dependentonfeed.*Specificregulationsmayapplywhenusing70%e