微生物實(shí)驗(yàn)室菌種管理規(guī)程審核

1、取 代新文件文件發(fā)放號涉及部門：質(zhì)監(jiān)科質(zhì)檢科1、目 的：規(guī)范微生物試驗(yàn)用菌種的管理，確保菌種的有效使用。2、適用范圍：微生物試驗(yàn)用菌種的管理。3、責(zé) 任 者：質(zhì)檢科負(fù)責(zé)人、微生物試驗(yàn)人員、菌種管理人員4、正 文：4.1概念a、標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國內(nèi)或國際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。b、標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。c、商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。d、工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。e、代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。4.

2、2菌種的采購和接收4.2.1菌種的采購4.2.1.1從藥檢所或菌種保藏中心等外單位購入菌種斜面或凍干菌種。4.2.1.2根據(jù)工作需要對購買國內(nèi)保藏中心提供的菌種斜面提前1個月填寫采購申請單，凍干菌種提前2個月申請購買，國外保藏中心提供的菌種應(yīng)提前3個月申請購買。4.2.2菌種的接收4.2.2.1檢定菌應(yīng)設(shè)專人保管，管理人員應(yīng)接受過專業(yè)培訓(xùn)，有足夠的菌種保存經(jīng)驗(yàn)。4.2.2.2接收菌種時，應(yīng)核實(shí)菌種的名稱、編號、傳代代數(shù)、數(shù)量、有效期等，并調(diào)查清楚菌種的保存條件和注意事項(xiàng)。接收時應(yīng)填寫菌種接收登記表。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種保藏中心編號、傳代次數(shù)、接收日期、菌種來源等。4.2.3對新購入的凍干菌

3、種在使用前應(yīng)按要求對其進(jìn)行生物形態(tài)確證試驗(yàn)和純度鑒定，由于新購買的菌種斜面已由菌種提供單位做過生物形態(tài)確證試驗(yàn)和純度鑒定，所以傳代5代以內(nèi)的菌種斜面不需要進(jìn)行純度鑒定。4.2.4對新購入的斜面菌種應(yīng)在28保存，并應(yīng)在1周內(nèi)轉(zhuǎn)接。4.3菌種的復(fù)蘇4.3.1使用人員根據(jù)需要應(yīng)向菌種管理人員領(lǐng)取菌種，仔細(xì)核對標(biāo)簽上菌名、編號，并在菌種接收及領(lǐng)用登記表上記錄菌名、數(shù)量、領(lǐng)用人、領(lǐng)用日期等信息。4.3.2菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用。4.3.3菌種復(fù)蘇應(yīng)在生物安全柜內(nèi)操作。4.3.4常用菌種接種用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件表菌種名稱接種用培養(yǎng)基培養(yǎng)條件大腸埃希菌Escherichia coli 營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)

4、瓊脂培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa 營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時短小芽孢桿菌Bacillus pumilus營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時藤黃微球菌Micrococcus luteus營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時沙門菌Salmonella營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)

5、基30-35培養(yǎng)18-24小時生孢梭菌Clostridium sporogenes 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基30-35培養(yǎng)18-24小時白色念珠菌Candida albicans 改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂23-28培養(yǎng)24-48小時黑曲霉 Aspergillus niger 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基23-28培養(yǎng)（5-7天）4.4菌種的傳代4.4.1每株菌種應(yīng)建立菌種使用及傳代記錄，斜面菌種應(yīng)根據(jù)其特性決定傳代時間間隔。各類斜面菌種保藏溫度與傳代間隔時間表菌種保藏溫度傳代間隔時間細(xì)菌28每一個月移植一次放線菌28每2-4個月 移植一次酵母菌28每2個月移植一次芽孢桿菌28每3個月移植一次霉菌28每3

6、個月移植一次 4.4.2傳代時使用須核對名稱、編號，傳代代數(shù)及日期，所用培養(yǎng)基傳代和接種規(guī)程4.4.2.1控制傳代次數(shù)，傳代次數(shù)越多，突變的幾率越大，因此要盡量少傳代；根據(jù)菌種特性和實(shí)際保存情況，最多傳代不超過5代，超過此次數(shù)，應(yīng)加熱滅活，菌種有異常情況或有雜菌生長，則應(yīng)隨時更代。4.4.2.2菌種的傳代應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。4.4.2.3在規(guī)定的保存期內(nèi),取 5代以內(nèi)的菌種管（瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物） ，取其中1支重復(fù)接種斜面培養(yǎng)基，制備下一代工作菌種用于傳代。4.4.3傳代和接種規(guī)程4.4.3.1 先點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁的上部空間操作，燒灼接種環(huán)。4.4.3.2 再將原有的菌種斜面培養(yǎng)基（簡

7、稱菌種管）與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基（簡稱接種管），持在左手拇指、食指及中指之間，要注意能清楚地觀察到斜面，菌種管在前，接種管在后，應(yīng)斜持試管呈45角，使試管內(nèi)斜面向上，兩試管口平齊，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。4.4.3.3首先，以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動兩管的棉塞，以便接種時易于拔取。再以右手持接種環(huán)的柄端，垂直或稍斜地把接種環(huán)在火焰上燒灼。頂端的環(huán)必須燒紅，以徹底滅菌。環(huán)以上凡接種時可進(jìn)入試管的部分，也應(yīng)通過火焰燒灼。燒灼時，應(yīng)把環(huán)置于酒精燈的外焰上，因外焰的濃度比內(nèi)焰高，容易燒紅。4.4.3.4使用右手的小指和手掌之間以及無名指與小指之間，在火焰旁分別拔出兩支試管的棉塞，持住

8、，再將試管口在火焰上通過，以殺滅管口可能沾污的細(xì)菌，但勿燒燙。4.4.3.5先將燒灼過的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基土，如有熔印則表明接種環(huán)未冷卻能燙死細(xì)菌。一定待冷后，再從斜面上挑取菌苔少許，取出時接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)從火焰旁迅速插入接種管，在斜面上輕輕劃線接種。劃線時，一般先由下而上劃一直線后，再由下而上劃曲線。操作過程應(yīng)迅速，勿使菌苔粘至管壁或管口。4.4.3.6 當(dāng)接種完畢，立即將管口通過火焰滅菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要將管口離開火焰旁去迎接右手的棉塞。最后將接種環(huán)燒灼滅菌放置原處，再把可能未塞緊的棉塞塞緊，即可進(jìn)行培養(yǎng)。4.4.3.7 操作過程中，如因不慎使棉塞

9、觸及火焰而著火，卻勿用口吹，須在剛剛著火時迅速塞入試管，因管內(nèi)氧氣不足會很快熄滅。若棉塞外端著火，可用手捏熄。若棉塞燒壞不宜再用，可另取未接種斜面培養(yǎng)基上的滅菌棉塞，代替塞上。4.4.3.8接種完畢, 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、沙門菌、生孢梭菌在30-35培養(yǎng)18-24小時，白色念珠菌在23-28培養(yǎng)24-48小時，黑曲霉在23-28培養(yǎng)（5-7天）。4.4.3.9傳代和接種使用后，應(yīng)填寫菌種傳代、使用記錄，并記錄傳代菌種實(shí)驗(yàn)室編號。 實(shí)驗(yàn)室菌種編號由以下內(nèi)容組成：傳代日期（年兩位月兩位日兩位）+ 傳代代數(shù)（一位數(shù)字）+序號（兩位數(shù)字）如： 1303

10、12-4-01表示13年3月12月接種的第四代第1支菌種管4.4.3.10最后貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽應(yīng)有菌種名稱、保藏中心編號、實(shí)驗(yàn)室編號、有效期。4.5菌種的保藏4.5.1凍干菌種在低溫冰箱-20冷凍。4.5.2為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成無菌橡膠塞，放在2-8左右的冰箱內(nèi)保藏。4.5.3 在保藏前，應(yīng)貼上菌種標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括菌名、菌號、傳代日期和有效期。4.5.4每天檢查一次保存菌種的冰箱溫度，并作記錄，每周檢查菌種管的棉塞是否松動，菌種外觀及干燥狀態(tài)，如有異常應(yīng)及時處理，并填寫菌種檢查記錄。4.5.5每次移植培養(yǎng)后，要與原種的編號、名稱逐一核對，確認(rèn)培養(yǎng)特征和溫度無誤后，再繼續(xù)保存。4.6菌種的使用和銷毀4.6.1受污染的菌種、過期菌種或菌種傳代使用后應(yīng)及時銷毀，銷毀時應(yīng)經(jīng)121高壓蒸汽滅菌30分鐘的生物滅活處理。記錄、附錄、參引文件清單序號名稱編號1外購菌種接收、領(lǐng)用登記表SOP-QCP00101002-Red01-002菌種檢查記錄SOP-QCP00101002-Red02-003菌種傳代、使用及后處理情況表SOP-QCP00101002-Red03-00 變 更 記 錄文件編號變 更 內(nèi) 容生效日期SOP-QCP00101002 菌種檢查記錄菌種名稱 實(shí)驗(yàn)室編號檢查人及日期有效期檢