革蘭氏染色技術(shù)(底版改動)

1、革蘭氏革蘭氏染色染色方法方法（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬?shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（六）注意事項（六）注意事項（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海ㄒ唬?shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí)細(xì)菌革蘭氏染色法。學(xué)習(xí)細(xì)菌革蘭氏染色法。革蘭氏染色法革蘭氏染色法：是是18841884年由丹麥病理年由丹麥病理學(xué)家學(xué)家C.GramC.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G G+ +）和革蘭氏陰性菌和革蘭氏陰性菌（G G）兩大類，兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該是細(xì)菌學(xué)上最常

2、用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為染色法所以能將細(xì)菌分為G G+ +菌和菌和G G菌，菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。不同所決定的。（二）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理G G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的脂質(zhì)類，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，脂質(zhì)類，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)故用乙醇脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅番紅復(fù)染后就成紅色

3、。復(fù)染后就成紅色。 G G+ +菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚含量多含量多且交聯(lián)度且交聯(lián)度高，脂質(zhì)類含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而高，脂質(zhì)類含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。1234？結(jié)晶紫結(jié)晶紫碘液碘液酒精酒精復(fù)紅復(fù)紅 革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陽性桿菌革蘭氏陽性桿菌G+球菌與球菌與G-桿菌桿菌1 1、活材料活材料：培養(yǎng)：培養(yǎng)3 3日日的大腸桿菌和的大腸桿菌和金黃金黃色色葡萄球菌。葡萄球菌。2 2、染色液和試劑染色液和試劑：結(jié)晶紫、：結(jié)晶紫、稀稀碘液、碘液、95%

4、95%酒精、酒精、沙黃（番紅）沙黃（番紅）、蒸餾水、蒸餾水、二甲苯二甲苯、香柏油。、香柏油。3 3、器材器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、杯、酒精燈、吸水紙、吸水紙、擦鏡紙、顯微擦鏡紙、顯微鏡。鏡。（三）實(shí)驗(yàn)器材（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）操作方法（四）操作方法（1 1）涂片涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中央中央取一環(huán)取一環(huán)蒸餾水，按無菌操作法取大腸桿蒸餾水，按無菌操作法取大腸桿菌涂片，做成濃菌液，注意取菌不要太多。菌涂片，做成濃菌液，注意取菌不要太多。（2 2）晾干晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方

5、文火烘干?；鹧嫔戏轿幕鸷娓伞＃? 3）固定固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰通過火焰2-32-3次固定（以不燙手為宜）。次固定（以不燙手為宜）。（4 4）結(jié)晶紫結(jié)晶紫初染初染：將玻片置于廢液缸玻片：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，擱架上，滴滴加適量（蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶加適量（蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色紫染色液染色3030秒秒；水洗：傾去染色液，用；水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。水小心地沖洗。（5 5）媒染媒染：滴加稀滴加稀碘液，媒染碘液，媒染3030秒秒；水洗：；水洗：用水洗去用水洗去稀稀碘液。碘液。（6 6）脫色脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加：將玻片傾斜

6、，連續(xù)滴加95%95%乙醇乙醇脫色脫色3030秒秒至流出液無色，立即水洗。至流出液無色，立即水洗。（7 7）復(fù)染復(fù)染：滴加：滴加沙黃沙黃復(fù)染復(fù)染3030秒秒；水洗：用；水洗：用水洗去涂片上的水洗去涂片上的沙黃沙黃染色液。染色液。（8 8）晾干晾干：將染好的涂片用吸水紙吸干。：將染好的涂片用吸水紙吸干。（9 9）鏡檢鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。反應(yīng)性。將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦

7、去。b.b.用擦鏡紙沾少許用擦鏡紙沾少許二甲苯二甲苯將鏡頭擦將鏡頭擦2-32-3次。次。c.c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-32-3次。注次。注意擦鏡頭時向意擦鏡頭時向同同一個方向一個方向輕輕輕輕擦拭。將顯擦拭。將顯微鏡小心輕拿，按號放入顯微鏡柜中。微鏡小心輕拿，按號放入顯微鏡柜中。 觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，放入回收容器內(nèi)。干凈，放入回收容器內(nèi)。（10)10)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束結(jié)束后的處理后的處理1.1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色酒精脫色。如。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染脫色過度，革蘭氏陽性菌也

8、可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。？（五）注意事項（五）注意事項2.2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。稀釋而影響染色效果。3.3.選用幼齡的細(xì)菌。選用幼齡的細(xì)菌。G+G+菌培養(yǎng)菌培養(yǎng)3 3日內(nèi)日內(nèi)，E.coliE.coli培養(yǎng)培養(yǎng)5 5日內(nèi)日內(nèi)。若菌齡太老，由于菌。若菌齡