RTPCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)

1、P53基因P53基因命名該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)功能作用重要的抑癌基因，防止癌變細(xì)胞基因的修復(fù)功能RT-PCRRT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)) RNA的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。在GenBank中查找p53基因設(shè)計(jì)引物確定參數(shù)檢測(cè)p53基因在血細(xì)胞中的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄的引物基因表達(dá)的檢測(cè)方法Ques在蛋白質(zhì)水平基因檢測(cè)的方法在DNA水平在MRNA水平Northern印記雜交RT-PCR.Reverse Transcription PCR RNA提取cDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCRNorthern 印記雜交Nort

2、hern印記雜交印記雜交基因表達(dá)水平隨機(jī)六核苷酸引隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)物引導(dǎo)Oligo(dT)引導(dǎo)引導(dǎo)特異性引導(dǎo)特異性引導(dǎo)Ques反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ) 的雙鏈cDNA.反轉(zhuǎn)錄可用的引物010305 Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Pol

3、y(A )尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。 隨機(jī)六聚體引物隨機(jī)六聚體引物：用此種方法時(shí)，體系中所有：用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分分子全部充當(dāng)了子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過(guò)程引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中中96%來(lái)源于來(lái)源于rRNA。特異性引物特異性引物：用含目標(biāo)：用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特，導(dǎo)致更為特異的異的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。Ques查找P53序列使用GENBA

4、NK，P53登陸號(hào)AH007667/genbank查找P53序列查找P53序列查找P53序列引物設(shè)計(jì)的原則15263748引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性并具有特異性產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)引物長(zhǎng)度一般在引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間堿基之間G+C含量在含量在40%60%之間之間堿基要隨機(jī)分布?jí)A基要隨機(jī)分布引物自身及之間不能有連續(xù)引物自身及之間不能有連續(xù)4個(gè)堿個(gè)堿基的互補(bǔ)基的互補(bǔ)引物引物5端可以修飾端可以修飾引物引物3端不可修飾端不可修飾引物引物3端要避開密碼子的第端要避開密碼子的第3位位Q

5、ues引物設(shè)計(jì)PRIMER PREMIER 5.0Primer Premier5.0是由加拿大的是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（口（Genetank），引物設(shè)計(jì)窗口（），引物設(shè)計(jì)窗口（Primer Design），酶切分析窗口（），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引），這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能。物設(shè)計(jì)功能。引物設(shè)計(jì)1啟動(dòng)界面啟動(dòng)界面引物

6、設(shè)計(jì)2在此輸入需擴(kuò)增的DNA序列引物設(shè)計(jì)3引物設(shè)計(jì)4引物設(shè)計(jì)5引物設(shè)計(jì)6引物設(shè)計(jì)7引物設(shè)計(jì)8Hairpin：發(fā)夾結(jié)構(gòu)：發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer：二聚體：二聚體False Priming：錯(cuò)配：錯(cuò)配Cross Dimer：交叉二聚體：交叉二聚體引物設(shè)計(jì)9引物設(shè)計(jì)10引物設(shè)計(jì)11保存保存選擇滿意的引物選擇滿意的引物引物設(shè)計(jì)12所選引物所選引物確定參數(shù)cDNA size:434bp94度 30秒變性155度 45秒退火273度 60秒延伸327次循環(huán)4確定參數(shù)四項(xiàng)參數(shù)循環(huán)次數(shù)退火延伸變性模板DNA由雙鏈變成單鏈，有利于與引物結(jié)合。可根據(jù)模板的復(fù)雜程度調(diào)整變性溫度和時(shí)間，一般情況下94 C 30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。變性的DNA快速冷卻至4060 C可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合?？筛鶕?jù)引物的長(zhǎng)度和GC的含量選擇復(fù)性溫度一般是7075 C，此時(shí)Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。理論上2025個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物的累計(jì)即可達(dá)到最大值、實(shí)際操作中2530較合理。確定參數(shù)退火溫度：5054Ques檢測(cè)基因的表達(dá) 根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠，取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10V/cm電泳4560min。成像系統(tǒng)成像分析。瓊