酶工程 10有機溶劑中的酶催化作用

1、第十章第十章 有機溶劑中的酶催化作用有機溶劑中的酶催化作用長期的觀點認為長期的觀點認為: : 有機溶劑是酶的變性劑、失有機溶劑是酶的變性劑、失活劑這一傳統(tǒng)酶學(xué)思想的影響下，活劑這一傳統(tǒng)酶學(xué)思想的影響下，酶在有機介質(zhì)中催化作用的研究酶在有機介質(zhì)中催化作用的研究此前幾乎毫無進展。此前幾乎毫無進展。 這一觀點直到這一觀點直到19841984年，非水年，非水溶劑中酶催化的研究才取得了突溶劑中酶催化的研究才取得了突破性的進展。破性的進展。 1984年美國年美國Klibanov, A.M.在在Science上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有機介質(zhì)中催化條件和特點的綜述。機介質(zhì)中催化條件和特點的綜

2、述。Klibanov等的工作等的工作在僅含微量水的有機介質(zhì)在僅含微量水的有機介質(zhì)(Microaqueous media)中成功地酶中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等許多促合成了酯、肽、手性醇等許多有機化合物。有機化合物?；谘芯抗ぷ?，基于研究工作，libanov等提出等提出只要條件合適，酶可以在非生物體系只要條件合適，酶可以在非生物體系的疏水介質(zhì)中催化天然或非天然的疏的疏水介質(zhì)中催化天然或非天然的疏水性底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，酶不僅可以水性底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，酶不僅可以在水與有機溶劑互溶體系，也可以在在水與有機溶劑互溶體系，也可以在水與有機溶劑組成的雙液相體系，甚水與有機溶劑組成的雙液相體系，甚至在僅

3、含微量水或幾乎無水的有機溶至在僅含微量水或幾乎無水的有機溶劑中表現(xiàn)出催化活性劑中表現(xiàn)出催化活性。這一觀點無疑是對酶只能在這一觀點無疑是對酶只能在水溶液中起作用傳統(tǒng)酶學(xué)思想的水溶液中起作用傳統(tǒng)酶學(xué)思想的挑戰(zhàn)挑戰(zhàn)酶在非水介質(zhì)中的催化反應(yīng)具有在許多常規(guī)水溶液中所沒有酶在非水介質(zhì)中的催化反應(yīng)具有在許多常規(guī)水溶液中所沒有的新特征和優(yōu)勢：的新特征和優(yōu)勢：可進行水不溶或水溶性差化合物的催化轉(zhuǎn)化，大大拓展了酶催化可進行水不溶或水溶性差化合物的催化轉(zhuǎn)化，大大拓展了酶催化 作用的底物和生成產(chǎn)物的范圍；作用的底物和生成產(chǎn)物的范圍；改變了催化反應(yīng)的平衡點，使在水溶液中不能或很難發(fā)生的反應(yīng)改變了催化反應(yīng)的平衡點，使在水

4、溶液中不能或很難發(fā)生的反應(yīng) 向期望的方向得以順利進行，如在水溶液中催化水解反應(yīng)的酶在向期望的方向得以順利進行，如在水溶液中催化水解反應(yīng)的酶在 非水介質(zhì)中可有效催化合成反應(yīng)的進行；非水介質(zhì)中可有效催化合成反應(yīng)的進行；使酶對包括區(qū)域?qū)Ｒ恍院蛯τ丑w專一性在內(nèi)的底物專一性大為提使酶對包括區(qū)域?qū)Ｒ恍院蛯τ丑w專一性在內(nèi)的底物專一性大為提 高，使對酶催化作用的選擇性的有目的的調(diào)控的實現(xiàn)成為可能；高，使對酶催化作用的選擇性的有目的的調(diào)控的實現(xiàn)成為可能；大大提高了一些酶的熱穩(wěn)定性；大大提高了一些酶的熱穩(wěn)定性；由于酶不溶于大多數(shù)的有機溶劑，使催化后酶易于回收和重復(fù)利由于酶不溶于大多數(shù)的有機溶劑，使催化后酶易于回收

5、和重復(fù)利 用；用；可有效減少或防止由水引起的副反應(yīng)的產(chǎn)生；可有效減少或防止由水引起的副反應(yīng)的產(chǎn)生；可避免雜水溶液中進行長期反應(yīng)時微生物引起的污染；可避免雜水溶液中進行長期反應(yīng)時微生物引起的污染；可方便地利用對水分敏感的底物進行相關(guān)的反應(yīng)；可方便地利用對水分敏感的底物進行相關(guān)的反應(yīng)；當使用揮發(fā)性溶劑作為介質(zhì)時，可使反應(yīng)后的分離過程能耗降低當使用揮發(fā)性溶劑作為介質(zhì)時，可使反應(yīng)后的分離過程能耗降低 從上世紀八十年代中期開始，從上世紀八十年代中期開始，酶在非水介質(zhì)中催化反應(yīng)的研究酶在非水介質(zhì)中催化反應(yīng)的研究十分活躍。十分活躍。現(xiàn)已報導(dǎo)，酯酶、脂肪酶、蛋白現(xiàn)已報導(dǎo)，酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶

6、等酶、纖維素酶、淀粉酶等水解酶類；水解酶類；過氧化物酶、過氧化氫酶、醇脫氫酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、醇脫氫酶、膽固醇氧化酶、多酚氧化酶、多細胞膽固醇氧化酶、多酚氧化酶、多細胞色素氧化酶等色素氧化酶等氧化還原酶類氧化還原酶類和醛縮酶和醛縮酶等等轉(zhuǎn)移酶類轉(zhuǎn)移酶類中的十幾種酶在適宜的有中的十幾種酶在適宜的有機溶劑中具有與水溶液中可比的催化機溶劑中具有與水溶液中可比的催化活性?；钚?。用于酶催化的非水介質(zhì)包括：用于酶催化的非水介質(zhì)包括：(1) 含微量水的有機溶劑；含微量水的有機溶劑；(2) 與水混溶的有機溶劑和水形成的均一體與水混溶的有機溶劑和水形成的均一體系；系；(3) 水與有機溶劑形成的兩相或多相

7、體系；水與有機溶劑形成的兩相或多相體系；(4) 膠束與反膠束體系；膠束與反膠束體系；(5) 超臨界流體；超臨界流體；(6) 氣氣 相。相。非水酶學(xué)的研究主要集中在三個方面：非水酶學(xué)的研究主要集中在三個方面：一、非水酶學(xué)基本理論的研究，它包括影一、非水酶學(xué)基本理論的研究，它包括影響非水介質(zhì)中酶催化的主要因素以及響非水介質(zhì)中酶催化的主要因素以及非水介質(zhì)中酶學(xué)性質(zhì)。非水介質(zhì)中酶學(xué)性質(zhì)。二、通過對酶在非水介質(zhì)中結(jié)構(gòu)與功能的二、通過對酶在非水介質(zhì)中結(jié)構(gòu)與功能的研究，闡明非水介質(zhì)中酶的催化機制研究，闡明非水介質(zhì)中酶的催化機制，建立和完善非水酶學(xué)的基本理論；，建立和完善非水酶學(xué)的基本理論；三、利用上述理論來

8、指導(dǎo)非水介質(zhì)中酶催三、利用上述理論來指導(dǎo)非水介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的應(yīng)用?；磻?yīng)的應(yīng)用。非水介質(zhì)反應(yīng)體系非水介質(zhì)反應(yīng)體系 通常，酶催化反應(yīng)體系包括了水溶液反應(yīng)通常，酶催化反應(yīng)體系包括了水溶液反應(yīng)體系、有機介質(zhì)反應(yīng)體系、氣相介質(zhì)反應(yīng)體系、體系、有機介質(zhì)反應(yīng)體系、氣相介質(zhì)反應(yīng)體系、超臨界流體介質(zhì)反應(yīng)體系等多種，在這些反應(yīng)超臨界流體介質(zhì)反應(yīng)體系等多種，在這些反應(yīng)體系中，除水溶液反應(yīng)體系外，其他的反應(yīng)體體系中，除水溶液反應(yīng)體系外，其他的反應(yīng)體系統(tǒng)稱為非水介質(zhì)反應(yīng)體系。在眾多非水介質(zhì)系統(tǒng)稱為非水介質(zhì)反應(yīng)體系。在眾多非水介質(zhì)反應(yīng)體系中，以有機介質(zhì)反應(yīng)體系的研究最多，反應(yīng)體系中，以有機介質(zhì)反應(yīng)體系的研究最多，應(yīng)用

9、也最廣泛。應(yīng)用也最廣泛。 常見的有機介質(zhì)反應(yīng)體系主要包括了常見的有機介質(zhì)反應(yīng)體系主要包括了微水微水有機介質(zhì)體系、與水溶性有機溶劑組成的均一有機介質(zhì)體系、與水溶性有機溶劑組成的均一體系、與水不不溶性有機溶劑組成的兩相或多體系、與水不不溶性有機溶劑組成的兩相或多相體系、膠束體系和反膠束體系相體系、膠束體系和反膠束體系等。等。1 微水有機介質(zhì)體系微水有機介質(zhì)體系 微水有機介質(zhì)體系是由有機微水有機介質(zhì)體系是由有機溶劑和微量的水組成的反應(yīng)體系，溶劑和微量的水組成的反應(yīng)體系，也是有機介質(zhì)酶催化中應(yīng)用最為也是有機介質(zhì)酶催化中應(yīng)用最為廣泛的一種反應(yīng)體系。廣泛的一種反應(yīng)體系。 酶分子的酶分子的結(jié)合水結(jié)合水對維持

10、酶分子的空間對維持酶分子的空間構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要。一般酶都是以構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要。一般酶都是以凍干粉或固定化酶的形式懸浮于有機介質(zhì)凍干粉或固定化酶的形式懸浮于有機介質(zhì)之中，在懸浮狀態(tài)下進行催化反應(yīng)。之中，在懸浮狀態(tài)下進行催化反應(yīng)。 2 與水溶性有機溶劑組成的均一體系與水溶性有機溶劑組成的均一體系 由水和極性較大的有機溶劑互相混溶由水和極性較大的有機溶劑互相混溶組成的反應(yīng)體系，體系中水和有機溶劑的組成的反應(yīng)體系，體系中水和有機溶劑的含量均較大。含量均較大。 酶和底物是以溶解狀態(tài)存在于體系之酶和底物是以溶解狀態(tài)存在于體系之中，由于極性大的有機溶劑對一般酶的催中，由于極性大的有機溶劑對一般酶

11、的催化活性影響較大，所以能在這類反應(yīng)體系化活性影響較大，所以能在這類反應(yīng)體系中進行催化反應(yīng)的酶較少。中進行催化反應(yīng)的酶較少。 3 與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相體系體系 由水和疏水性較強的有機溶劑組成由水和疏水性較強的有機溶劑組成的兩相或多相反應(yīng)體系。的兩相或多相反應(yīng)體系。 游離酶、親水性底物或產(chǎn)物溶解于水游離酶、親水性底物或產(chǎn)物溶解于水相，而疏水性底物或產(chǎn)物則溶解于有機溶相，而疏水性底物或產(chǎn)物則溶解于有機溶劑相中。劑相中。 一般這種體系僅適用于底物和產(chǎn)物或一般這種體系僅適用于底物和產(chǎn)物或其中的一種是疏水化合物的酶催化反應(yīng)。其中的一種是疏水化合物的酶催化反

12、應(yīng)。其中，最常用的是兩相體系。其中，最常用的是兩相體系。4 膠束和反膠束體系膠束和反膠束體系 當水和有機溶劑同時存在于反應(yīng)體系當水和有機溶劑同時存在于反應(yīng)體系時，加入表面活性劑后，兩性的表面活性時，加入表面活性劑后，兩性的表面活性劑會形成球狀或橢球狀的膠束，其大小與劑會形成球狀或橢球狀的膠束，其大小與蛋白質(zhì)分子在同一數(shù)量級上。蛋白質(zhì)分子在同一數(shù)量級上。 當體系中水濃度高于有機溶劑時，形當體系中水濃度高于有機溶劑時，形成膠束的表面活性劑的極性端朝向膠束的成膠束的表面活性劑的極性端朝向膠束的外側(cè)，而非極性端則朝向膠束的中心，有外側(cè)，而非極性端則朝向膠束的中心，有機溶劑就被包在膠束的內(nèi)部，此時的膠束

13、機溶劑就被包在膠束的內(nèi)部，此時的膠束就稱為就稱為正相膠束或簡稱為膠束正相膠束或簡稱為膠束； 當體系中水濃度低于有機溶劑時，形當體系中水濃度低于有機溶劑時，形成膠束的表面活性劑的極性端朝向膠束的成膠束的表面活性劑的極性端朝向膠束的中，而非極性端則朝向膠束的外側(cè)，水就中，而非極性端則朝向膠束的外側(cè)，水就被包在膠束的內(nèi)部，此時的膠束就稱為被包在膠束的內(nèi)部，此時的膠束就稱為反反相膠束相膠束或簡稱為或簡稱為反膠束反膠束。 一般而言，在不同的非水介質(zhì)中進行酶催化時所表現(xiàn)出的催化行為是有區(qū)別的 不同反應(yīng)體系中酶的一些催化行為比較不同反應(yīng)體系中酶的一些催化行為比較參數(shù)參數(shù)微水有機介微水有機介質(zhì)體系質(zhì)體系水水-

14、 -有機溶劑有機溶劑兩相體系兩相體系反膠束體反膠束體系系酶活力酶活力酶負載量酶負載量產(chǎn)率產(chǎn)率產(chǎn)物回收產(chǎn)物回收酶重復(fù)使用酶重復(fù)使用連續(xù)操作連續(xù)操作低低高高低低容易容易可能可能可能可能低低高高低低一般一般難難可能可能高高低低高高難難難難難難二二 酶在非水介質(zhì)中的性質(zhì)酶在非水介質(zhì)中的性質(zhì)酶能在非水介質(zhì)中發(fā)揮催化作用的主要原因是酶在有機介質(zhì)中能夠保持完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，然而，酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，由于有機溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定的影響，從而影響酶的熱穩(wěn)定性、底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)鍵選擇性等酶學(xué)性質(zhì)，進而顯示出

15、與水溶液中不同的催化特性。1 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性許多酶在非水介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性比相同酶在水溶液中更好，而且這種熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性的提高是難以用化學(xué)交聯(lián)、固定化甚至是蛋白質(zhì)工程的手段所能達到的，且這種穩(wěn)定性還與介質(zhì)中的水含量有關(guān)。例如，豬胰脂肪酶在有機溶劑中100 時的半衰期可達數(shù)小時，而在水中100幾乎馬上失活。1%的水濃度會使豬胰脂肪酶的穩(wěn)定性降低到與水溶液中相同的水平。又如，胰凝乳蛋白酶在無水辛烷中20放置6個月后酶活力沒有降低，而在同樣溫度下酶在水溶液中的半衰期僅有幾天。表9.2一些酶在有機介質(zhì)和水溶液中的熱穩(wěn)定性比較酶條件熱穩(wěn)定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯,水， pH7.0T1/

16、2 26 hT1/2 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水， pH7.0T1/2 1.5 hT1/2 2 min胰凝乳蛋白酶正辛烷，100水，pH8.0, 55T1/2 80 minT1/2 15 min枯草桿菌蛋白酶 正辛烷， 110 T1/2 80 min溶菌酶環(huán)己烷110水T1/2 140 minT1/2 10 min核糖核酸酶壬烷，110，6 h水，pH8.0, 90剩95%活性T1/2 24 hT1/2 50 daysHind III 正庚烷，55，30days 活性沒有降低脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h 剩余活性40%-葡萄糖苷酶 2-丙醇，50，30 h 剩余活性80%酪

17、氨酸酶氯仿，50水，50T1/2 90 minT1/2 10 min酸性磷酸酯酶正十六烷，80水 ， 70T1/2 8.0 minT1/2 1.0 min細胞色素氧化酶甲苯，0.3%水甲苯，1.3%水T1/2 4.0 hT1/2 1.7 min 2 底物專一性底物專一性同水溶液中的酶催化一樣，酶在非水介質(zhì)中對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)均有嚴格的選擇性。值得指出的是，不同的有機溶劑具有不同的極性，因此，在不同的有機溶劑中酶的底物專一性也是不同的，有機溶劑改變時，酶的底物專一性也會發(fā)生改變。一般來說，在極性較強的有機溶劑中，疏水性較強的底物容易進行反應(yīng)，而在極性較弱的有機溶劑中，疏水性較弱的底物容易

18、進行反應(yīng)。3 對映體選擇性對映體選擇性酶的對映體選擇性是指酶在對稱的外消旋化合物中識別一種異構(gòu)體的能力，這種選擇性是由不同對映體與酶的活性中心的三維空間構(gòu)像的互補性或稱親和力決定的。非水介質(zhì)中酶對底物的對映體選擇性由于介質(zhì)的親（疏）水性的變化而發(fā)生改變。 酶的立體選擇性與反應(yīng)介質(zhì)之間存在著一定的關(guān)系，一般來說，酶在水溶液中的對映體選擇性較強，而在疏水性較強的有機溶劑中，酶的對映體選擇性較差。 4 區(qū)域選擇性區(qū)域選擇性區(qū)域選擇性，即酶能夠選擇性地優(yōu)先催化底物分子中某一區(qū)域的基團進行反應(yīng)。酶在非水介質(zhì)中進行催化時，區(qū)域選擇性可能會發(fā)生一定變化。5 化學(xué)鍵選擇性化學(xué)鍵選擇性酶催化的另一個顯著特點是具

19、有化學(xué)鍵選擇性?；瘜W(xué)鍵選擇性是指當同一個底物分子中有2個以上的化學(xué)鍵都可以與進行反應(yīng)時，酶對其中的一個別化學(xué)鍵可以優(yōu)先進行催化反應(yīng)。在有機介質(zhì)中進行酶催化反應(yīng)時，化學(xué)鍵選擇性可能變化。6 pH記憶記憶 在有機介質(zhì)酶催化反應(yīng)中，酶所處的pH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體之前所使用的緩沖液pH值相同，而酶的催化反應(yīng)速度與其凍干或吸附到載體之前緩沖溶液的pH密切相關(guān)，非水介質(zhì)中的酶能夠“記憶”凍干或吸附到載體之前所處緩沖液中的pH值，反應(yīng)的最適pH接近于水溶液中的最適pH。 三、非水介質(zhì)反應(yīng)體系中有機溶劑對酶三、非水介質(zhì)反應(yīng)體系中有機溶劑對酶催化反應(yīng)的影響催化反應(yīng)的影響1 1 有機溶劑對酶催化活力的影響

20、有機溶劑對酶催化活力的影響 有機溶劑對酶催化活力的影響是非水酶學(xué)有機溶劑對酶催化活力的影響是非水酶學(xué)所要闡明的一個重要因素，溶劑不但直接或間所要闡明的一個重要因素，溶劑不但直接或間接地影響酶的活力和穩(wěn)定性，而且也能夠改變接地影響酶的活力和穩(wěn)定性，而且也能夠改變酶的特異性（包括底物特異性、立體選擇性、酶的特異性（包括底物特異性、立體選擇性、前手性選擇性等）。前手性選擇性等）。 通常有機溶劑通過與水、酶、底物和產(chǎn)物通常有機溶劑通過與水、酶、底物和產(chǎn)物的相互作用來影響酶的這些性質(zhì)。的相互作用來影響酶的這些性質(zhì)。 一些親水性相對較強的極性有機溶劑，一些親水性相對較強的極性有機溶劑，特別是與水互溶的有機

21、溶劑卻能夠奪取酶特別是與水互溶的有機溶劑卻能夠奪取酶蛋白表面的蛋白表面的“必需水必需水”，擾亂酶分子的天，擾亂酶分子的天然構(gòu)象的形成，從而導(dǎo)致酶的失活。然構(gòu)象的形成，從而導(dǎo)致酶的失活。 2 2 有機溶劑對酶結(jié)構(gòu)的影響有機溶劑對酶結(jié)構(gòu)的影響 在含微量水有機介質(zhì)中時，與蛋白質(zhì)在含微量水有機介質(zhì)中時，與蛋白質(zhì)分子形成分子間氫鍵的水分子極少，蛋白分子形成分子間氫鍵的水分子極少，蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵起主導(dǎo)作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)質(zhì)分子內(nèi)氫鍵起主導(dǎo)作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更為構(gòu)變得更為“剛硬剛硬”，活動的自由度變小，活動的自由度變小，限制了疏水環(huán)境下的蛋白質(zhì)構(gòu)象向熱力學(xué)限制了疏水環(huán)境下的蛋白質(zhì)構(gòu)象向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)

22、化，從而能維持著和水溶液中穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)化，從而能維持著和水溶液中同樣的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象。同樣的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象。 3 3 有機溶劑對底物和產(chǎn)物的影響有機溶劑對底物和產(chǎn)物的影響 有機溶劑能直接或間接地與底物和產(chǎn)物相有機溶劑能直接或間接地與底物和產(chǎn)物相互作用，影響酶的活力。有機溶劑能改變酶分互作用，影響酶的活力。有機溶劑能改變酶分子子“必需水必需水”層中底物或產(chǎn)物的濃度，而底物層中底物或產(chǎn)物的濃度，而底物必須滲入必須滲入“必需水必需水”層，產(chǎn)物必須移出此水層，層，產(chǎn)物必須移出此水層，才能使反應(yīng)進行下去。有機溶劑對底物和產(chǎn)物才能使反應(yīng)進行下去。有機溶劑對底物和產(chǎn)物的影響主要體現(xiàn)在底物和產(chǎn)物的溶劑化上，這的影響主要

23、體現(xiàn)在底物和產(chǎn)物的溶劑化上，這種溶劑化作用會直接影響到反應(yīng)的動力學(xué)和熱種溶劑化作用會直接影響到反應(yīng)的動力學(xué)和熱力學(xué)平衡。力學(xué)平衡。 應(yīng)該說，有機溶劑對酶催化反應(yīng)的影應(yīng)該說，有機溶劑對酶催化反應(yīng)的影響是一個綜合而復(fù)雜的過程，其中包括溶響是一個綜合而復(fù)雜的過程，其中包括溶劑對水劑對水- -酶相互作用的擾動和扭曲、與固酶相互作用的擾動和扭曲、與固定化酶微環(huán)境之間的匹配以及對底物和產(chǎn)定化酶微環(huán)境之間的匹配以及對底物和產(chǎn)物的溶劑與擴散等因素。物的溶劑與擴散等因素。 4 有機溶劑對酶選擇性的影響有機溶劑對酶選擇性的影響 應(yīng)該說有機溶劑對酶選擇性的影響是應(yīng)該說有機溶劑對酶選擇性的影響是非常大的，由于有機溶劑

24、的存在是酶蛋白非常大的，由于有機溶劑的存在是酶蛋白分子的剛性得以增強，使之具有水溶液中分子的剛性得以增強，使之具有水溶液中所不可比擬的優(yōu)越性：良好的對映體選擇所不可比擬的優(yōu)越性：良好的對映體選擇性或區(qū)域選擇性。性或區(qū)域選擇性。 目前的模型都是在針對特定的酶、底目前的模型都是在針對特定的酶、底物和體系的研究過程中建立起來的，尚不物和體系的研究過程中建立起來的，尚不足以總結(jié)出普遍適用的規(guī)律。足以總結(jié)出普遍適用的規(guī)律。 四、水對非水介質(zhì)中酶催化的影響四、水對非水介質(zhì)中酶催化的影響 現(xiàn)有的研究成果已經(jīng)證明，酶只有在一定現(xiàn)有的研究成果已經(jīng)證明，酶只有在一定量水的存在下，才能進行催化反應(yīng)，無論是在量水的存

25、在下，才能進行催化反應(yīng)，無論是在水溶液或是在有機介質(zhì)中進行酶的催化反應(yīng)，水溶液或是在有機介質(zhì)中進行酶的催化反應(yīng)，水都是不可缺少的條件之一。特別是在有機介水都是不可缺少的條件之一。特別是在有機介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)，水含量的多少對酶的空間質(zhì)中的酶催化反應(yīng)，水含量的多少對酶的空間構(gòu)象、催化活性、穩(wěn)定性、催化反應(yīng)的速度、構(gòu)象、催化活性、穩(wěn)定性、催化反應(yīng)的速度、底物和產(chǎn)物的溶解度等都有密切關(guān)系。底物和產(chǎn)物的溶解度等都有密切關(guān)系。1 必需水必需水 已經(jīng)知道，酶分子只有在空間構(gòu)已經(jīng)知道，酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下才具有催化功能。在象完整的狀態(tài)下才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，無水的條

26、件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。酶將變性失活。 在有機介質(zhì)中，酶分子需要一層水化在有機介質(zhì)中，酶分子需要一層水化層以維持其完整的空間構(gòu)象。層以維持其完整的空間構(gòu)象。一般將維持一般將維持酶分子完整空間構(gòu)象所必需的最低水含量酶分子完整空間構(gòu)象所必需的最低水含量稱為必需水。稱為必需水。 必需水是酶在非水介質(zhì)中進行催化反必需水是酶在非水介質(zhì)中進行催化反應(yīng)所必需的，它會直接影響酶的催化活性應(yīng)所必需的，它會直接影響酶的催化活性和選擇性，通過必需水的調(diào)控，可以調(diào)節(jié)和選擇性，通過必需水的調(diào)控，可以調(diào)節(jié)有機介質(zhì)中酶催化反應(yīng)中酶的催化活性和有機介質(zhì)中酶催化反應(yīng)中酶的催化活性和選擇性。選擇性。 由于必需水是

27、維持酶分子結(jié)構(gòu)中由于必需水是維持酶分子結(jié)構(gòu)中氫鍵、鹽鍵等所必需的，而氫鍵、鹽氫鍵、鹽鍵等所必需的，而氫鍵、鹽鍵等又是酶空間結(jié)構(gòu)的主要穩(wěn)定因素，鍵等又是酶空間結(jié)構(gòu)的主要穩(wěn)定因素，酶分子一旦失去必需水，就必將使其酶分子一旦失去必需水，就必將使其空間構(gòu)象破壞而失去催化功能?？臻g構(gòu)象破壞而失去催化功能。 有機介質(zhì)反應(yīng)體系中含有的水主要有有機介質(zhì)反應(yīng)體系中含有的水主要有兩類兩類: :一類是與酶分子緊密結(jié)合的一類是與酶分子緊密結(jié)合的結(jié)合水結(jié)合水; ;另一類是溶解于有機溶劑的另一類是溶解于有機溶劑的游離水游離水，可以認為，在有機介質(zhì)反應(yīng)體系中，可以認為，在有機介質(zhì)反應(yīng)體系中，結(jié)合水是影響酶催化活性的關(guān)鍵因素

28、。結(jié)合水是影響酶催化活性的關(guān)鍵因素。 可以通過可以通過用一個飽和鹽水溶液分別預(yù)平衡底物溶用一個飽和鹽水溶液分別預(yù)平衡底物溶 液和酶制劑；液和酶制劑；向反應(yīng)體系中直接加一種水合鹽；向反應(yīng)體系中直接加一種水合鹽；向每一溶劑中加入不同量的水等三種方向每一溶劑中加入不同量的水等三種方 式來獲得恒定的水活度式來獲得恒定的水活度 等方式來控制反應(yīng)體系的水活度。等方式來控制反應(yīng)體系的水活度。 2 水對酶催化反應(yīng)速度的影響水對酶催化反應(yīng)速度的影響 有機介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有有機介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響。顯著影響。 多年來的研究使人們在非水介質(zhì)酶催化反多年來的研究使人們在非水介質(zhì)酶催化

29、反應(yīng)中存在了一個共識，即微量的水對酶有效發(fā)應(yīng)中存在了一個共識，即微量的水對酶有效發(fā)揮催化作用是必需的，因為水間接或直接地參揮催化作用是必需的，因為水間接或直接地參與了酶天然構(gòu)象中包括氫鍵、靜電作用、疏水與了酶天然構(gòu)象中包括氫鍵、靜電作用、疏水相互作用和范德華力在內(nèi)的所有非共價相互作相互作用和范德華力在內(nèi)的所有非共價相互作用。用。 一般認為酶蛋白分子的水化過程可以分為四一般認為酶蛋白分子的水化過程可以分為四個步驟：個步驟：酶蛋白分子的離子化基團水化過程，在此過酶蛋白分子的離子化基團水化過程，在此過 程中，水與酶蛋白分子表面的帶電基團結(jié)合；程中，水與酶蛋白分子表面的帶電基團結(jié)合；酶蛋白分子中的極性

30、部分水簇的生長過程，即酶蛋白分子中的極性部分水簇的生長過程，即 水與酶蛋白分子表面極性基團結(jié)合；水與酶蛋白分子表面極性基團結(jié)合；水吸附到酶蛋白分子表面相互作用較弱的部水吸附到酶蛋白分子表面相互作用較弱的部 位；位；酶蛋白分子表面完全水化，被單層水分子所覆酶蛋白分子表面完全水化，被單層水分子所覆 蓋。蓋。 大量研究表明，非水介質(zhì)中酶的活性比水大量研究表明，非水介質(zhì)中酶的活性比水溶液中要低好幾個數(shù)量級溶液中要低好幾個數(shù)量級酶在有機溶劑中活力低的原因酶在有機溶劑中活力低的原因原原 因因說說 明明解解 決決 辦辦 法法擴散限制擴散限制有機溶劑中的擴散要比水中小，限有機溶劑中的擴散要比水中小，限制了底物

31、的擴散制了底物的擴散增加攪拌速度；降低酶的顆增加攪拌速度；降低酶的顆粒大小粒大小封閉活性中心封閉活性中心導(dǎo)致酶活力降低幾倍導(dǎo)致酶活力降低幾倍用結(jié)晶酶替代用結(jié)晶酶替代構(gòu)象改變構(gòu)象改變凍干過程及其他脫水過程造成的凍干過程及其他脫水過程造成的使用凍干保護劑；制備有機使用凍干保護劑；制備有機溶劑中可溶解的可與兩親性溶劑中可溶解的可與兩親性物質(zhì)絡(luò)合的酶物質(zhì)絡(luò)合的酶底物去溶劑化底物去溶劑化疏水性底物嚴重，可導(dǎo)致酶活力降疏水性底物嚴重，可導(dǎo)致酶活力降低至少低至少100倍倍選擇溶劑以獲得有利的底物選擇溶劑以獲得有利的底物-溶劑相互作用溶劑相互作用過渡態(tài)不穩(wěn)定化過渡態(tài)不穩(wěn)定化當過渡態(tài)至少部分暴露于溶劑時才當過渡

32、態(tài)至少部分暴露于溶劑時才發(fā)生發(fā)生選擇溶劑以期獲得與過渡態(tài)選擇溶劑以期獲得與過渡態(tài)有利的相互作用有利的相互作用構(gòu)象柔性降低構(gòu)象柔性降低無水的親水溶劑尤為顯著，會奪取無水的親水溶劑尤為顯著，會奪取酶分子上必需的結(jié)合水，從而導(dǎo)致酶分子上必需的結(jié)合水，從而導(dǎo)致酶活力降低至少酶活力降低至少100倍倍使水活度使水活度(aw) 最適化；水合溶最適化；水合溶劑劑;使用疏水溶劑；使用仿水使用疏水溶劑；使用仿水和變性共溶添加劑和變性共溶添加劑亞最適亞最適pH值值導(dǎo)致至少導(dǎo)致至少100倍的酶活力降低倍的酶活力降低從酶的最適從酶的最適pH水溶液中脫水；水溶液中脫水；使用有機相緩沖液使用有機相緩沖液4 水對酶活性的影響

33、水對酶活性的影響 在低水含量的非水介質(zhì)酶催化反應(yīng)體系中，在低水含量的非水介質(zhì)酶催化反應(yīng)體系中，水分的影響是至關(guān)重要的，要使酶能夠表現(xiàn)出水分的影響是至關(guān)重要的，要使酶能夠表現(xiàn)出最大的催化活力，確定適宜的體系水活度就顯最大的催化活力，確定適宜的體系水活度就顯得十分重要。不同種類的酶因為其分子結(jié)構(gòu)的得十分重要。不同種類的酶因為其分子結(jié)構(gòu)的不同，維持酶具有活性的構(gòu)象所必需的水量也不同，維持酶具有活性的構(gòu)象所必需的水量也就不同，即使是同一種類的酶，由于酶的源不就不同，即使是同一種類的酶，由于酶的源不同，所需的水量也會有顯著不同。同，所需的水量也會有顯著不同。 酶在非水介質(zhì)中的存在形式酶在非水介質(zhì)中的存在

34、形式在有機溶劑中，酶分子不能直接溶在有機溶劑中，酶分子不能直接溶于其中，它的存在狀態(tài)有多種形式，主要于其中，它的存在狀態(tài)有多種形式，主要分為兩大類：分為兩大類：一、固態(tài)酶，一、固態(tài)酶，二、可溶解酶。二、可溶解酶。固態(tài)酶它包括凍干的酶粉或固定化酶、結(jié)晶酶以固體形式存在有機溶劑中可溶解酶主要包括：可溶解酶主要包括：水溶性大分子共價修飾酶水溶性大分子共價修飾酶非共價修飾的高分子非共價修飾的高分子酶復(fù)合物酶復(fù)合物表面活性劑表面活性劑酶復(fù)合物酶復(fù)合物微乳液中的酶等微乳液中的酶等 五、非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)類型五、非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)類型 酶用于有機合成的范圍在不斷擴酶用于有機合成的范圍在不斷擴大，在機

35、相中酶催化可完成的反應(yīng)有：大，在機相中酶催化可完成的反應(yīng)有：氧化、還原、脫氧、脫氨、羥化、甲氧化、還原、脫氧、脫氨、羥化、甲基化、酰胺化、磷酸化、異構(gòu)化、環(huán)基化、酰胺化、磷酸化、異構(gòu)化、環(huán)氧化、開環(huán)、鹵化等。氧化、開環(huán)、鹵化等。C-O鍵的形成鍵的形成（1）酯類：酯酶和脂肪酶可催化）酯類：酯酶和脂肪酶可催化 酯合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和酸酯合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和酸 酐水解反應(yīng)。酐水解反應(yīng)。（2）環(huán)氧化合物）環(huán)氧化合物（3）糖苷鍵的水解和形成）糖苷鍵的水解和形成 （4）加氧氧化反應(yīng) 酯合成反應(yīng) OOOHOH 98% ee, 產(chǎn)率 78%OOOHOAc假單胞脂肪酶(PCL)醋酸乙烯酯 97% ee, 產(chǎn)率

36、77%OHOHZHNHOAcOHZHNH假單胞脂肪酶(PCL)醋酸乙烯酯轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng) H27C10CO2PrOH74% eeH27C10CO2PrOH+H27C10CO2PrOH98% eeOOH27C10豬豬胰胰脂脂肪肪酶酶( (P PP PL L) )二二乙乙醚醚酸酐水解 OHMeOO假假單單胞胞脂脂肪肪酶酶( (P PC CL L) )B Bu uO OH H二二異異丙丙醚醚9 93 3% % e ee e, , 產(chǎn)產(chǎn)率率 9 90 0% %CO2HCO2BuHMe環(huán)氧化合反應(yīng)環(huán)氧化合反應(yīng) (S)型OArO+RH2NCPhO鼠鼠肝肝微微粒粒體體RNCPhOArOOH+(R)型RNCP

37、hOArOOH糖的焦磷酸化，糖的異構(gòu)化 OHOHOOHOPO3-OHUDPU UD DP P- -G Gl lc c焦焦磷磷酸酸化化酶酶OHOHOOHOHOUDPOHOOHOHOHORROHG Ga al l 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換換酶酶OHOHOOHOHOUDPK=0.17U UD DP P- -G Gl lc c差差向向異異構(gòu)構(gòu)酶酶OHOOHOHOUDPOH糖的衍生物糖的衍生物 OAcOAcONHAcOAcNCO2HNHROHOHOHONHAcOHNHNOOHOOHONHAcOHNHNOOHOOHHOOHOOHOHHOAcHNOCO2HOH固固相相肽肽合合成成UDP-GalGalT轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶醇解醇解 O

38、HOHOOHOHXROH糖糖苷苷酶酶OHOHOOHOHOR加氧氧化反應(yīng) OHCH3CH3OHCH3CH3HO+O2單單加加氧氧酶酶OHOH二二加加氧氧酶酶COOHCOOH+O22. C-N鍵的反應(yīng)鍵的反應(yīng)肽的合成肽的合成3. C-C鍵的形成鍵的形成（1）羥醛反應(yīng)（2）酮醛和羥醛轉(zhuǎn)移反應(yīng)（3）醛縮合反應(yīng) （4）乙酰輔酶A參與的C-C鍵構(gòu)成反應(yīng) （5）醛加成反應(yīng)（1）羥醛反應(yīng)）羥醛反應(yīng)POOPOOHOHOHD-FDFOOHPOOHOPOH( (P PO O= =磷磷酸酸鹽鹽) )+D-Gly 3-PF FD DP P醛醛縮縮酶酶DHAPCHON3+HOOPODHAPN3OHOHOHOH2,Pd(O

39、H)2-CNOHHOOHHOOHPODHAP+OHPOOHOHRAMAOOHOPOHOHOPOHOH48%HOHOOHOHOH+OCH3CO2-K KD DO O醛醛縮縮酶酶HOCO2-OOHOHOHOHKDOD D- -阿阿拉拉伯伯糖糖丙丙酮酮酸酸鹽鹽（2）酮醛和羥醛轉(zhuǎn)移反應(yīng) HOCO2-OHPA+OHHOTKHOOHOOH（3）醛縮合反應(yīng)）醛縮合反應(yīng) HOR1R2+CH3CHOOHCH3OR1R2苯苯甲甲醛醛衍衍生生物物乙乙醛醛酵酵母母酮酮醇醇縮縮合合（4）乙酰輔酶）乙酰輔酶A參與的參與的C-C鍵構(gòu)成反應(yīng)鍵構(gòu)成反應(yīng) ORSCoARSCoAOO酰?；o輔酶酶A AR R= =C CH H3

40、 3( (C CH H2 2) )x xx x= =0 0- -7 7硫硫解解酶酶乙乙酰酰輔輔酶酶A A- -酮酮酰酰基基輔輔酶酶A A（5）醛加成反應(yīng)）醛加成反應(yīng)RCOH+HCNOHCRHCNOHCRHCOOHH2O/H+( (S S) )- -醇醇腈腈酶酶異異丙丙醚醚4. 還原反應(yīng)還原反應(yīng) OOROROHNADHde 63-89%ee98%R=Me,Et,iPr,PhSOCH3OOSOHOCH3O酵酵母母71%馬肝醇脫氫酶5. 氧化反應(yīng)氧化反應(yīng)（1） C-H, C=C 氧化（2） 醇氧化（3）苯酚氧化 （4） 羧酸氧化（5）C-N氧化 （）（） C-H, C=C 氧化氧化OOOHHENCO

41、PhNCOPhOE（）（） 醇氧化醇氧化OOHOHHOOHOH+O2EOOHOHHOOCHOH+H2O2（3）苯酚氧化）苯酚氧化 ROHOHROO（）（） 羧酸氧化羧酸氧化OCOO-+O2磷磷酸酸鹽鹽EOOPO32-+ CO2 + H2O2（5）C-N氧化氧化HNNNNOOHHHNNNNOOOHH+ CO2SODH+ H2O26. 異構(gòu)化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng) NOHNH2HNONH2HHA AC CL L消消旋旋酶酶D-ACLR1HOR2OOHOHOHOR2OHR1OH木木糖糖異異構(gòu)構(gòu)酶酶7. C-X的反應(yīng)鹵化反應(yīng)：的反應(yīng)鹵化反應(yīng)：OHI+90%10%I-,H2O過過氧氧化化物物酶酶Ph過過氧氧化化

42、物物酶酶Br-,H2O2OPhOPhBr+CINH2CINH2Br過過氧氧化化物物酶酶B Br r- -, ,H H2 2O O2 2OO過過氧氧化化物物酶酶C CI I- -, ,H H2 2O O2 2OOCI六、非水介質(zhì)酶催化的應(yīng)用六、非水介質(zhì)酶催化的應(yīng)用 近年來的大量研究已經(jīng)表明，在非近年來的大量研究已經(jīng)表明，在非水介質(zhì)中酶常常會有高度的選擇性，包括水介質(zhì)中酶常常會有高度的選擇性，包括立體選擇性、對映體選擇性、區(qū)域選擇性立體選擇性、對映體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性，這為非水介質(zhì)酶催化在有和化學(xué)選擇性，這為非水介質(zhì)酶催化在有機合成領(lǐng)域中的應(yīng)用開辟了極有意義的新機合成領(lǐng)域中的應(yīng)用開辟了

43、極有意義的新天地。天地。 迄今為止，已有以脂肪酶、蛋白酶為迄今為止，已有以脂肪酶、蛋白酶為典型代表的多種酶被用于非水介質(zhì)中催化典型代表的多種酶被用于非水介質(zhì)中催化酯化、酯交換、肽合成和大環(huán)內(nèi)酯合成等酯化、酯交換、肽合成和大環(huán)內(nèi)酯合成等多種反應(yīng)，其中特別在前手性化合物的不多種反應(yīng)，其中特別在前手性化合物的不對稱合成、對映體的選擇性拆分等方面獲對稱合成、對映體的選擇性拆分等方面獲得了有重要意義的應(yīng)用。得了有重要意義的應(yīng)用。1 光學(xué)活性化合物的制備光學(xué)活性化合物的制備A 可以將有潛在手性的化合物和前體可以將有潛在手性的化合物和前體通過酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為單一對映體的通過酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為單一對映體的光學(xué)活性；光學(xué)活性；B 可以非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)合成可以非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)合成含磷、硫、氮及金屬的光學(xué)活性化合含磷、硫、氮及金屬的光學(xué)活性化合物；物；C 可以利用非水介質(zhì)中的酶催化進行可以利用非水介質(zhì)中的酶催化進行外消旋化合物的拆分反應(yīng)。外消旋化合物的拆分