硒增強細胞免疫的研究——Ⅲ硒通過增強抗原遞呈促進遲發(fā)超敏反應

1、硒增強細胞免疫的研究。硒通過增強抗原遞呈促進遲發(fā)超敏反應夏漢章 張友會（腫瘤研究所，北京）提要 硒處理小鼠能提高小鼠對致敏劑三硝基氯苯（TNCB）誘發(fā)的遲發(fā)超敏反應（DTH）的敏感性。體外實驗證明，經(jīng)硒處理的小鼠脾臟粘附細胞向TNCB致敏的T淋巴細胞遞呈半抗原三硝基苯基進而刺激T細胞增殖反應的能力。即抗原遞呈功能比未處理的對照強。正常小鼠的脾臟粘附細胞在體外經(jīng)硒處理后，其遞呈抗原的能力更強。提示硒通過加強抗原遞呈細胞的功能實現(xiàn)促進DTH反應。關(guān)鍵詞 遲發(fā)超敏反應 抗原遞呈 硒 自然界硒分布和機體血硒含量與人類某些腫瘤的發(fā)生率成負相關(guān)關(guān)系1，硒可抑制某些化學致癌物的致癌效應2。免疫系統(tǒng)的功能與硒

2、的含量相關(guān)，多數(shù)研究表明，硒可促進機體的體液免疫反應3，4，但有關(guān)硒對細胞免疫之影響的報道為數(shù)不多。Spallholz5曾報道硒處理豚鼠可提高動物對二硝基氯苯（DNCB）刺激的遲發(fā)超敏反應的敏感性。硒不僅能促進T細胞的功能，如細胞毒T細胞的活性6、白細胞介素2的分泌7，也能促進巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷效應8，消除抑制性巨噬細胞的抑制功能9。本文報道硒通過增強抗原遞呈細胞活性從而加強小鼠的遲發(fā)超敏反應。材料與方法動物 健康BALB/c小鼠，2-3月齡，由中國醫(yī)學科學院動物中心或腫瘤研究所動物室提供。試劑 RPMI1640（GIBCO）培養(yǎng)液含青霉素100u/ml，鏈霉素100u/ml，小牛血清1

3、0%。臨用時加新配制的2-巰基乙醇（Sigma）5×10-5mol/L。致敏劑1，3，5-三硝基氯苯（TNBS，Sigma），用磷酸緩沖液（PBS）配成10mmol/L的溶液，并用1NnaOH調(diào)酸堿度至pH7.4，-20保存。亞硒酸鈉（Na2SeO3）購于北京化工廠。氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，比活性25Ci/mmol），購于中國科學院原子能研究所。遲發(fā)超敏反應 取0.2ml 7%TNCB，涂在剪除毛發(fā)的小鼠腹部皮膚上，使動物致敏。4d后，在動物左耳殼涂1%TNCB刺激。24h后測量動物左右耳殼的厚度差，來表示遲發(fā)超敏反應的強度。對照為未致敏小鼠耳殼厚度差。抗原特異性T淋巴細胞增

4、殖反應 半抗原三硝基苯基（TNP）刺激的T細胞增殖反應的實驗方法見文獻10。用液閃儀（Beckman）測量樣品每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。結(jié)果用三個重復孔cpm的均值表達。結(jié) 果圖1示硒對遲發(fā)超敏反應（DTH）的影響。以未致敏的小鼠對三硝基氯苯（TNCB）的刺激為對照，四天前經(jīng)TNCB致敏的小鼠能對TNCB的再刺激產(chǎn)生較強的DTH反應。如果在致敏的同時經(jīng)腹腔注射Na2SeO3 (1mg/kg)，小鼠對TNCB刺激的DTH反應明顯增強，提示硒提高了動物對致敏劑的敏感性。圖2示硒對抗原特異性T淋巴細胞增殖反應的影響。結(jié)合半抗原三硝基苯基（TNP）的小鼠脾臟粘附細胞（SAC）能刺激TNCB致敏小鼠的淋巴

5、結(jié)T細胞（LNT）活化，產(chǎn)生強烈的增殖反應，而未結(jié)合TNP的SAC只引起LNT輕度增殖。此外如前文所述10，SAC-TNP不能刺激TNCB非致敏的LNT產(chǎn)生增殖反應，而結(jié)合TNP的脾臟非粘附細胞（SNAC）也只能刺激LNT產(chǎn)生微弱的增殖反應。提示SAC在該實驗系統(tǒng)中實際起著遞呈抗原的作用。 25 SAC SAC-TNPEar inctcment(×0.01mm) 20 60 15 50 40 10 30 20 5 10 6 0圖2 亞硒酸鈉對TNP特異性增殖反應影 響的劑量效應關(guān)系Fig 2 Dose-dependent effect of selenium on TNP-speci

6、fic proliferative response4×103 LNT were stimulated by SAC or SAC-TNP in the prosence of various doses of sodium selenite for thrce days,LNT proliferative response was mensured by 3H-TdR incorporation 0 0.5 5 50 500Na2SeO3 treniment 1mg/kgSensitlzition 7%TNCB 7%TNCBChallengc 1%TNCB 1%TNCB 1%TNC

7、B 圖1 TNCB誘導的遲發(fā)超敏反應Fig 1 Delayed type hypersensitivity in mouse skininduced by TNCB從圖2可知，TNP特異性T細胞增殖反應可因Na2SeO3的加入而改變，其程度取決于Na2SeO3的劑量。適量的Na2SeO3能促進TNP特異的增殖反應，當濃度為50ng/ml時，硒可使增殖反應提高85%。Na2SeO3濃度過高（500ng/ml）TNP特異性T細胞增殖反應反而被強烈地抑制。為研究硒在適量的濃度范圍內(nèi)促進DTH和抗原特異性T細胞增殖反應的機理，實驗觀察硒對脾臟粘附細胞抗原遞呈功能的影響。給小鼠腹腔注射Na2SeO3（1

8、mg/kg），以未處理的小鼠作對照，4d后制備小鼠SAC并與TNP結(jié)合。結(jié)果表明，在圖3所示的S/R比值范圍內(nèi)，經(jīng)硒處理的小鼠SAC向TNCB致敏的LNT遞呈TNP的能力比正常小鼠的SAC強，引起LNT較強烈的增殖反應，提示硒在體內(nèi)處理動物能使機體的抗原遞呈細胞的活性增強。圖3 亞硒酸鈉體內(nèi)處理對抗原遞呈細胞活性的影響Fig 3 The effect of selenium in vivo treatment on antigen presenting cells SAC,obtained from normal mice or mice injected i.p.with sodium se

9、lenite(1mg/kg)4d earlier,was used to stimulate 4×105 LNT for three days;proliferation was measured by 3H-TdR uptake by LNT;cpm is the defference between cpm of LNT stimulated by SAC-TNP and cpm of LNT stimulated by SAC3H-TdR incorporation(Acpm,×10-3) Normal mice35 Micc injeetcd302520151050

10、 1/16 1/8 1/4 1/2 S/R表1 經(jīng)硒處理的巨噬細胞遞呈抗原的能力Table 1 Antigen presentation capacity of macrophagesPretreated with seleniumStimulating cellsNa2SeO3 treatment*TNP-coupledLNT proliferation (3H-TdR uptake,cpm)*-432±33SAC,104-663±40SAC,104-+7392±503SAC,104250ng/ml+24573±1297SAC,104500ng/ml+

11、38985±1842SAC,1041000ng/ml+18132±2252SAC, 5×104-1615±210SAC, 5×104-+16287±2357SAC, 5×104500ng/ml+40009±1486SAC, 5×1041000ng/ml+24717±1943*SAC were pretreated with selenium for 1h,washed three times with PBS and then coupled with TNP;*4×105 LNT w

12、ere stimulated for three days by SAC or SAC-TNP and cell proliferative response was measured by 3H-TdR incorporation by LNT同樣，用較大劑量的Na2SeO3在體外短時間內(nèi)（1h）直接處理過的正常小鼠的SAC比未經(jīng)處理的SAC的抗原遞呈活性增強，使T淋巴細胞產(chǎn)生較強烈的增殖反應（表1）。盡管在培養(yǎng)過程中加入500ng/ml Na2SeO3能強烈的抑制抗原特異性T細胞增殖反應（圖2）。但短時間處理SAC卻提高了SAC的抗原遞呈活性（表1）。如果進一步提高SAC的劑量，硒對抗原遞

13、呈細胞活性的促進效應便會減弱。如果硒處理SAC時間太久（如 >3h），硒反而對SAC的抗原遞呈功能呈抑制效應（表2）。因此，硒對抗原遞呈細胞活性的促進作用取決于Na2SeO3的劑量及其作用于細胞的時間。表2 硒處理時間長短對巨噬細胞抗原遞呈功能的影響Table 2 Effect of time of selenium treatment on antigenPresentation by macrophagesStimulating cellsNa2SeO3 treatment*TNP-coupledLNT proliferation (3H-TdR uptake,cpm)*-

14、570±35SAC, 5×104-1331±21SAC, 5×104-+18876±3627SAC, 5×1041h+23000±874SAC, 5×1042h+28751±711SAC, 5×1043h+14809±736* SAC were treated with selenium(1000ng/ml)for various lengths of time,washed three times with PBS and then coupled with TNP;*4×

15、105 primed LNT were stimulated by SAC or SAC-TNP for three days and cell proliferative response was measured by 3H-TdR incorporation by LNT討 論Spallholz曾報道硒可提高豚鼠對致敏劑二硝基氯苯的敏感性，但未探索其作用機理5。本組也得到相似的實驗結(jié)果，硒處理能提高動物對致敏劑三硝基氯苯（TNCB）的敏感性，明顯加強小鼠的遲發(fā)超敏反應（DTH）。本研究檢查DTH反應在體外的表現(xiàn)抗原特異性T淋巴細胞增殖反應。結(jié)果證明，在劑量合適時，硒在體外能明顯增強T淋巴

16、細胞對抗原刺激產(chǎn)生的增殖反應。在該體外實驗系統(tǒng)中，刺激細胞是結(jié)合了半抗原三硝基苯基（TNP）的正常小鼠脾臟粘附細胞（SAC）。本組以前的實驗結(jié)果證明，SAC在反應中實際上起著遞呈抗原的作用10。國外有報道已證明，體內(nèi)的DTH反應依賴于巨噬細胞遞呈抗原。例如，經(jīng)皮下給小鼠注射結(jié)合了TNP的巨噬細胞如SAC，也能象TNCB那樣使動物致敏，而非巨噬細胞不具備這種能力11。巨噬細胞遞呈抗原的功能在免疫反應的誘導階段超著很重要的作用。許多研究表明，抗原直接刺激T細胞往往誘導抑制性T細胞產(chǎn)生，加入巨噬細胞后，則能誘導產(chǎn)生輔助性T細胞12，13。巨噬細胞遞呈抗原功能受障礙時，機體的免疫功能低下14。所以從某

17、種角度來說，研究巨噬細胞的抗原遞呈功能可以了解機體免疫功能狀態(tài)。本結(jié)果表明，用硒處理小鼠后，硒在體內(nèi)能增強SAC的抗原遞呈活性，體外用適量的Na2SeO3直接處理正常小鼠SAC一段時間后，SAC的抗原遞呈功能也得以增強。這說明，硒對遲發(fā)超敏反應的促進作用與硒增強象SAC這樣的巨噬細胞的抗原遞呈功能有關(guān)。硒很可能在體內(nèi)促進皮膚內(nèi)的巨噬細胞郎格罕氏細胞（Langerhans cells）的抗原遞呈功能因而使DTH反應得以加強。當然，硒也可能通過其它途徑來加強DTH反應。這還有待深入研究。硒對抗原遞呈細胞功能的增強作用也可部分解釋硒對體液免疫反應的增強作用，因為抗體產(chǎn)生的過程也依賴于巨噬細胞遞呈抗原

18、。目前尚不知道硒促進抗原遞呈功能的作用機理。一條重要的線索是硒為體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的輔因子。GSH-Px的功能是在體內(nèi)降解代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物。有的過氧化物對細胞膜和溶酶體膜具有損傷作用，有的能進一步氧化成免疫抑制劑如前列腺素。硒很可能增強GSH-Px酶活性，來加速降解過氧化物1，從而消除免疫抑制物的影響，保證巨噬細胞細胞膜和溶酶體膜的結(jié)構(gòu)完整，這都有利于巨噬細胞對抗原的攝入、加工處理和再表達。關(guān)于這點也有待深入研究。參考文獻1.Griffin AC.Role of selenium in the chemoprevention of cancer.Adv Cancer

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