生物技術(shù)之-基因工程載體(vector)

1、現(xiàn)代生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)第二章第二章 基因工程基因工程王旻王旻中國(guó)藥科大學(xué)中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 參考書(shū)參考書(shū)1、基因工程原理 吳乃虎 科學(xué)出版社 第二版 19982、分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第二版 J.薩姆布魯克等 科學(xué)出版社 19923、現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論 瞿禮嘉等 高等教育出版社 19984、現(xiàn)代生物技術(shù)概論 何忠效等 北京師范大學(xué)出版社5、生物制藥技術(shù) 王旻等 化學(xué)工業(yè)出版社 20036、基因工程 樓士林等 科學(xué)出版社 20027、生物技術(shù)與生物藥物 王旻等譯 化學(xué)工業(yè)出版社 2006第一節(jié) 基因工程的發(fā)展歷史和基本概念一、基因工程的發(fā)展歷史基因工程發(fā)展史有關(guān)的重要事

2、件年份重要事件186919441953195819611965196619671970197219731974197519771982198519972000F.Miescher首次從鮭魚(yú)精子中分離到DNAO.T.Avery等人在肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)J.D.Watson和H.C.Creck提出了DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA半保留復(fù)制模型M.W.Nirenberg等人應(yīng)用合成的mRNA分子poly(U)破譯出了第一批遺傳密碼F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型證明細(xì)菌的抗藥性通常有一

3、類(lèi)叫”質(zhì)?！钡念~外染色體攜帶M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana共同破譯了全部的遺傳密碼發(fā)現(xiàn)了可將DNA連接起來(lái)的DNA連接酶H.O.Smith等分離到第一種核酸內(nèi)切限制酶,它可以在特定位點(diǎn)將DNA分子切割開(kāi)來(lái)以H.Boyer,P.Berg等人為代表的一批美國(guó)科學(xué)家發(fā)展了重組DNA技術(shù),并于己于1972年得到第一個(gè)重組的DNA分子,1973年完成第一個(gè)細(xì)菌基因的克隆首次實(shí)現(xiàn)了異源真核生物基因在大腸桿菌中的表達(dá)F.Sanger及A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了快速的DNA序列測(cè)定技術(shù).1977年第一個(gè)全長(zhǎng)5387bp的嗜菌體X174基因組測(cè)定完成第一個(gè)基因工

4、程藥物-胰島素在美國(guó)和英國(guó)獲準(zhǔn)使用第一批轉(zhuǎn)基因家畜(兔,豬和羊)誕生多莉羊誕生人類(lèi)基因組草圖繪制完成基因工程歷史中的三個(gè)重要事件1、1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的P. Berg博士率先完成了DNA體外重組試驗(yàn)。（分享1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）SV40DNA+嗜菌體DNA EcoR1 T4DNA連接酶 重組DNA2、具有性狀功能的基因能否重組？1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的S.Cohen等人成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外DNA重組試驗(yàn)。 R6-5 +pSC101 EcoR1 T4DNA連接酶 重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌重組菌 Kanr Tetr Kanr + Tetr 3、不同物種、尤其是真核基因能否在原核生物中

5、重組與表達(dá)？ 1974年，S.Cohen與H.Boyer合作進(jìn)行了如下試驗(yàn)，結(jié)果表明：動(dòng)物基因的確進(jìn)入到大腸桿菌細(xì)胞，并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA.以上試驗(yàn)的重要意義有三點(diǎn)：以上試驗(yàn)的重要意義有三點(diǎn)：1、說(shuō)明像pSC101這樣的質(zhì)粒分子是可以作為基因克隆的載體，能夠?qū)⑼庠碊NA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞。2、說(shuō)明像非洲爪蟾這樣真核動(dòng)物的基因是可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞重并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)。3、說(shuō)明了質(zhì)粒-大腸桿菌不失為一種成功的基因克隆體系，可以作為基因克隆的模式系統(tǒng)進(jìn)行深入研究。二、基本概念定義：基因工程是指按照人們的意愿，在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之轉(zhuǎn)入到原先沒(méi)有

6、這類(lèi)分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，形成能持續(xù)穩(wěn)定繁殖的新物種。其目的是為人類(lèi)提供有用產(chǎn)品及服務(wù)。三、主要步驟與內(nèi)容：1 1、獲得目的基因、獲得目的基因2 2、在體外，將帶有目的基因的外源、在體外，將帶有目的基因的外源DNADNA片段連接到能自我片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組復(fù)制并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNADNA分子。分子。3 3、將重組、將重組DNADNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖。增殖。4、從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組、從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的分子的宿主細(xì)胞克隆。宿主細(xì)胞克隆。5

7、、從這些篩選出來(lái)的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到、從這些篩選出來(lái)的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用。擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用。6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的物質(zhì)。物質(zhì)。第二節(jié) 基因工程的工具酶 定義：凡在基因工程中應(yīng)用的酶統(tǒng)稱(chēng)為工具酶。 一、限制酶 (restrict enzymes) （一）限制與修飾現(xiàn)象 大多數(shù)的細(xì)菌對(duì)于噬菌體的感染都存在一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制(restr

8、iction)和修飾(modification)現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱(chēng)R/M體系。作用：一是保護(hù)自身的DNA不受限制，而是破壞外源DNA使之迅速降解。 （二）限制酶的命名和分類(lèi)（二）限制酶的命名和分類(lèi) 定義：凡在識(shí)別并切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱(chēng)為限制酶。（1）限制酶命名：）限制酶命名： （2）限制酶分類(lèi)：）限制酶分類(lèi)：根據(jù)酶的性質(zhì)，可分為三類(lèi)（三）第型限制酶的作用性質(zhì) 1、基本特性：（1）識(shí)別位點(diǎn)為48個(gè)核苷酸序列；（2）識(shí)別位點(diǎn)即為切割位點(diǎn)；（3）位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A

9、A G C T C 5EcoR I的識(shí)別序列的識(shí)別序列EcoR I的切割位點(diǎn)的切割位點(diǎn)切割方式通常有三種：在識(shí)別順序兩條鏈對(duì)稱(chēng)軸上同時(shí)切斷磷酸二酯鍵，形成齊平末端。如Hae， PvuII。在識(shí)別順序兩條鏈對(duì)稱(chēng)軸上兩側(cè)同時(shí)從5 端切斷磷酸二酯鍵，形成5 磷酰基端25個(gè)核苷酸單鏈粘性末端。如EcoR。在識(shí)別順序兩條鏈對(duì)稱(chēng)軸上兩側(cè)同時(shí)從3 端切斷磷酸二酯鍵，形成3羥羥基端25個(gè)核苷酸單鏈粘性末端。入Pst。PvuII等產(chǎn)生的平頭末端等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-

10、OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 EcoRI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的5粘性末端粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P Ho-G-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPPstI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的3粘性末端粘性末端5 G-C-T

11、-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火退火 4-7 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP2、同裂酶識(shí)別順序與切割方式均相同者，為之同裂酶。例如HpaII和和MspI識(shí)別順序都是CCGG,切割方式亦相同。C CGGGGC C3、同尾酶 它是與同裂酶對(duì)應(yīng)的一類(lèi)限制酶，它們雖來(lái)源各異，識(shí)別

12、的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱(chēng)為同尾酶。例如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一組同尾酶。他們切割后都形成GATC4個(gè)核苷酸組成的粘性末端。BamHI GGATCC CCTAGG BclI TGATCA ACTAGT 顯然，由同尾酶所產(chǎn)生DNA片斷，是能夠通過(guò)其粘性末段之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)。因此，在基因克隆實(shí)驗(yàn)中很有用處。有一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱(chēng)之為“雜種位點(diǎn)”。必須指出，這類(lèi)雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，一般是不能夠在被原來(lái)任何一種同尾酶所識(shí)別和切割的。同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5 5GGA

13、TCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT二、二、DNA連接酶（連接酶（ligase）及）及DNA分子體外連接分子體外連接（一）（一） DNA連接酶和連接酶和T4DNA連接酶連接酶1976年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)。目前應(yīng)用的多數(shù)來(lái)自于大

14、腸桿菌，稱(chēng)為E.coliDNA連接酶。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5-磷?；?-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick（T4DNA連接酶）連接酶）T4DNA連接酶連接酶T4DNA連接酶來(lái)自于連接酶來(lái)自于T4噬菌體感染的噬菌體感染的E.coli，為，為T(mén)4噬菌體自噬菌體自身的表達(dá)產(chǎn)物。分子量身的表達(dá)產(chǎn)物。

15、分子量6.8萬(wàn)萬(wàn)dal，輔因子位，輔因子位ATP，該酶既能，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。連接粘性末端，亦能連接齊平末端。修復(fù)與修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5連接多個(gè)平頭雙鏈連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-

16、A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶連接酶（二）粘性末端（二）粘性末端DNA片段的連接（連接酶的作用）片段的連接（連接酶的作用） 用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。 具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當(dāng)載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEc

17、oRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG用粘性末端構(gòu)建重組體用粘性末端構(gòu)建重組體DNA的最主要缺點(diǎn)：的最主要缺點(diǎn)：1、無(wú)法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)混合物中會(huì)發(fā)生自我環(huán)化作用，經(jīng)連接酶作用，形成共價(jià)閉環(huán)的穩(wěn)定環(huán)形結(jié)構(gòu)?？朔撊秉c(diǎn)的方法是，用堿性磷酸酶預(yù)先

18、處理線(xiàn)性的載體DNA分子，以移去末端的5磷酸基團(tuán)，于是在連接反應(yīng)中，它自身的兩個(gè)末端之間就再也不能被連接酶共價(jià)連接起來(lái)了。（三）平末端（三）平末端DNA片段的連接片段的連接1、同聚物加尾法、同聚物加尾法 是由美國(guó)斯坦福大學(xué)的P.Labban和D.Kaiser1972年發(fā)展起來(lái)的，可以連接任何兩段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH上。如果在目的基因兩側(cè)加polydA，則在載體兩側(cè)加polydT。長(zhǎng)度一般1040個(gè)殘基。 缺點(diǎn)：插入的片段難以回收。無(wú)法控制外源基因插入方向。人工粘性末端的

19、連接人工粘性末端的連接 平頭末端平頭末端C 3 GG5 G 3C5C3GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT人工粘性末端的連接人工

20、粘性末端的連接 3突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAG

21、GGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I人工粘性末端的連接人工粘性末端的連接 5突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAG

22、GGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amH IBamH IEcoR IBamH I2、銜接物（、銜接物（linker)連接法連接法所謂銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由1012個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。將銜接物的5末段和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶

23、處理使之磷酸化，然后通過(guò)T4DNA連接酶的作用是兩者連接起來(lái)，接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補(bǔ)的粘性末端。優(yōu)點(diǎn)：克隆后還可回收原插入片斷。BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow補(bǔ)平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCCCTAGCCTTAAGG5 5EcoR IGGAATTCCCCTTAAGGEcoR I linkerGGAATTCCGATCCCCTTAAGGCTAGGEcoR I DNA銜接物連接法盡管有諸多優(yōu)點(diǎn)，但明顯的銜接物連接

24、法盡管有諸多優(yōu)點(diǎn)，但明顯的缺點(diǎn)缺點(diǎn)是，是，如果待克隆的如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把所克隆的基因切成不同的片段，從而對(duì)后繼的亞時(shí)，也會(huì)把所克隆的基因切成不同的片段，從而對(duì)后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩?？寺〖捌渌僮髟斐陕闊?。3、DNA接頭接頭(adaptor)連接法連接法 DNA接頭接頭是由美國(guó)康奈爾大學(xué)吳瑞博士于1977年發(fā)明的，它是一類(lèi)人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端它是一類(lèi)人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，

25、另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會(huì)使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。問(wèn)題：各個(gè)DNA接頭分子的粘性末端之間，會(huì)通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來(lái)意義?？朔姆椒ㄊ菍?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的5-OH所取代。如此一來(lái)，雖然兩個(gè)接頭分子粘性末端之間仍具有互補(bǔ)堿基配對(duì)的能力，但終因DNA連接酶無(wú)法在5-OH和3 OH之間形成磷酸二酯鍵而不會(huì)產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。NoImage第三節(jié)第三節(jié) 基因工程載體（基因工程載體（vec

26、tor）能將目的基因攜帶至宿主細(xì)胞并可在其中自主復(fù)制的遺傳因子謂之為基因工程載體相關(guān)概念相關(guān)概念 有用基因亦稱(chēng)為目的基因或插入物 用于接受重組DNA的擴(kuò)增載體及其插入物或表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞謂之宿主 插入物的擴(kuò)增過(guò)程稱(chēng)為分子克隆 攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細(xì)胞（菌）或重組細(xì)胞（菌）基因工程載體的必備條件基因工程載體的必備條件1、具有有效運(yùn)載能力2、攜帶外源性目的基因前后在宿主內(nèi)功能自主復(fù)制3、在宿主內(nèi)能控制外源基因表達(dá)活動(dòng)4、堅(jiān)定方便，裝卸手續(xù)簡(jiǎn)單5、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小, 載力要大6、容易控制、安全可靠、穩(wěn)定性好三大類(lèi)基因工程載體 細(xì)菌質(zhì)粒 病 毒DNA

27、基因真核表達(dá) 植物表達(dá)（煙草花葉病毒） 動(dòng)物表達(dá)（腺病毒） 噬菌體DNA一、細(xì)菌質(zhì)粒 、質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)、質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì) 細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類(lèi)獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)。 絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子。（現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有線(xiàn)性質(zhì)粒，酵母的殺傷質(zhì)粒是一種RNA質(zhì)粒）環(huán)形雙鏈質(zhì)粒分子具有三種不同構(gòu)型1、共價(jià)閉合環(huán)形DNA（SCDNA）：兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu);2、開(kāi)環(huán)DNA（OCDNA）：兩條鏈中只有一條保持完整環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)一至數(shù)個(gè)缺口;3、線(xiàn)性分子DNA（LDNA）通稱(chēng)L構(gòu)型：質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶切割后，發(fā)生雙鏈斷裂而形成; 以上三種不

28、同的構(gòu)型的同一種質(zhì)粒，盡管分子量相同，但在瓊脂糖凝膠電泳中，電泳遷移率不同，順序是SCDNA、LDNA、OCDNA質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)分子量小，差異顯著，小的分子量為106dal,大的可達(dá)108dal。易于在宿主間轉(zhuǎn)移和遷移。在宿主內(nèi)可伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制，與宿主呈共生關(guān)系。 且其存在與否與宿主生死無(wú)關(guān)。 編碼宿主染色體不具有的基因，賦予宿主細(xì)胞額外遺傳特性 （如抗生素抗性）、質(zhì)粒的分類(lèi)、質(zhì)粒的分類(lèi)迄今為止，人們已在大腸桿菌的各種菌株中找到了許多種不同類(lèi)型的質(zhì)粒，其中已經(jīng)作了較詳盡研究，了解比較透徹的主要有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。由于這些質(zhì)粒的存在，寄主細(xì)胞便獲得了各自不同的性狀特征，我們

29、可以依據(jù)這些特征來(lái)鑒別這三種不同類(lèi)型的質(zhì)粒。1、F質(zhì)粒質(zhì)粒 又叫F因子(fertility factor)或性質(zhì)粒(sex plasmid), 這是由于它能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道 轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體胞中去而得名。 是在某些大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種具有代表性的單 拷貝的接合型質(zhì)粒，其大小約為 94kb左右，總共編碼 19個(gè)轉(zhuǎn)移基因（tra)。在寄主中，在寄主中，F(xiàn)質(zhì)粒有三種不同的存在方式質(zhì)粒有三種不同的存在方式1、以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，其上不帶有 任何來(lái)自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。這樣的細(xì)胞 叫F+細(xì)胞2、以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，同時(shí)在其上

30、 還攜帶著細(xì)菌的染色體基因或DNA區(qū)段。這樣的細(xì)胞 叫F細(xì)胞3、以線(xiàn)性DNA形式從不同位點(diǎn)整合到寄主染色體上，這 樣的細(xì)胞叫做Hfr(High frequential recomhimant) 高頻重組細(xì)胞2、R質(zhì)粒質(zhì)粒通稱(chēng)抗藥性因子。在其結(jié)構(gòu)中編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。3、Col質(zhì)粒質(zhì)粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌素是一類(lèi)可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死的蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類(lèi)：革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢?lèi)：接合型質(zhì)粒

31、能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其他成員F因子屬接合型質(zhì)粒，而Col質(zhì)粒和R質(zhì)粒中，既有屬于接合型的，也有屬于非接合型的。從基因工程的角度考慮，感興趣的主要是非接合型質(zhì)粒，這是因?yàn)榻雍闲偷馁|(zhì)粒不僅能夠自我從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞，而是還能夠轉(zhuǎn)移染色體記號(hào)。因此，如果使用接合型質(zhì)粒作載體，在理論上存在著發(fā)生使DNA跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險(xiǎn)性。、重要的質(zhì)粒載體、重要的質(zhì)粒載體目前常用于基因克隆的質(zhì)粒載體均為人工構(gòu)建。經(jīng)改造后達(dá)到這些要求：其分子結(jié)構(gòu)中必須具有多個(gè)單一限制酶切割位點(diǎn)，

32、且切點(diǎn)最好位于選擇性標(biāo)記上構(gòu)建重組質(zhì)粒后必須具有轉(zhuǎn)化功能最好帶有兩個(gè)以上強(qiáng)選擇性標(biāo)記分子量較小，為松弛型復(fù)制控制，易于操作宿主范圍小，無(wú)感染性，不受其他質(zhì)粒誘動(dòng)。1、Col E1質(zhì)粒載體 Col E1質(zhì)粒屬大腸桿菌Col類(lèi)質(zhì)粒中的一種，由于攜 帶Col質(zhì)粒的許多細(xì)菌都能產(chǎn)生一類(lèi)叫做細(xì)菌素的物 質(zhì)，故Col質(zhì)粒又被稱(chēng)作細(xì)菌素質(zhì)粒。細(xì)菌素是一類(lèi)特殊蛋白質(zhì)，它通過(guò)同敏感細(xì)胞細(xì)胞壁的融合作用，而抑制一種或數(shù)種在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的生命過(guò)程，如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及能量代謝等，從而使這些細(xì)胞停止生長(zhǎng)?？偨Y(jié)：總結(jié)：分子量4.2106dal，攜帶Col質(zhì)粒的許多菌能產(chǎn)生細(xì)菌素 Col E1 編碼大腸桿菌素E1基

33、因和大腸桿菌素E1 免疫基因。有單一EcoR切點(diǎn)，切開(kāi)接入外源 基因后，雖失去大腸桿菌素E1能力，但卻不影 響DNA復(fù)制能力屬松弛型復(fù)制，多拷貝，拷貝數(shù)可大1000-30002、pSC101質(zhì)粒載體 pSC101是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌 質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1-2個(gè)拷貝。 其分子大小為9.09kb，編碼一個(gè)四環(huán)素極性基因(tetr), 該質(zhì)粒對(duì)EcoR、Hind、BamH、Sal、Xho、 Pvu和Sma等7種限制酶有單一識(shí)別位點(diǎn)。 其中Hind、 BamH和Sal等3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA 都會(huì)使tetr失活。（插入失活效應(yīng)） pSC101質(zhì)粒載體性質(zhì)：質(zhì)粒載體性質(zhì)：

34、嚴(yán)緊型復(fù)制控制 低拷貝 1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞9.09kb 編碼一個(gè)tetr， 有EcoR、 Hind、BamH等7個(gè) 酶切單一位點(diǎn)，可插入失活。非洲爪蟾核糖體基因即是用該質(zhì)粒克隆缺點(diǎn)：低拷貝，表達(dá)效率低。pSC101是第一個(gè)成為用于克隆真核DNA的大腸桿菌質(zhì)粒載體，1973年成功地將帶有非洲爪蟾核糖體基因的EcoRI DNA片段，連接到pSC101復(fù)制子上。應(yīng)用pSC101質(zhì)粒載體在大腸桿菌細(xì)胞中克隆非洲爪蟾的基因3、pBR322 是一種人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒 特點(diǎn)：帶有多種抗藥性的強(qiáng)選擇記號(hào) 具有低分子量，高拷貝 外源DNA插入不影響復(fù)制功能 有多種核酸內(nèi)切限制酶單切割位點(diǎn)命名: p：表示質(zhì)粒 B

35、R:分別取自?xún)晌恢饕獦?gòu)建者F.Bolioax 和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個(gè)字母 322:指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)自身分子量小 4363bp同時(shí)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)具有較高的拷貝數(shù)重組DNAAmprTcs提取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn)化 無(wú)菌落陽(yáng)性菌落篩選重組子2)DNA重組無(wú)DNA插入有DNA插入外源

36、DNA1)限制酶切pBR322由三個(gè)不同的部分組成1、來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的ampr2、來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的tetr3、來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)4、pUC質(zhì)粒載體是在pBR322載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理的顯色原理 pUC18/19 Plac lacZMCS b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN 5-溴溴-4-氯氯-

37、3-吲哚基吲哚基-b b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal5-溴溴-4-氯靛藍(lán)（藍(lán)色）氯靛藍(lán)（藍(lán)色）476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子Plac和操縱基因O。lacZ之內(nèi)有M13的多功能連接器多克隆位點(diǎn)（MCS）。BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)具有更小的分子量(2

38、686bp)和更高的拷貝數(shù)(500700)適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因二、噬菌體載體和柯斯載體二、噬菌體載體和柯斯載體(cosmid) 及單鏈及單鏈DNA噬菌體載體噬菌體載體(M13)(一一)噬菌體噬菌體DNA1、噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)噬菌體為雙鏈DNA病毒，宿主為E.Coli。在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式，在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中，伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。噬菌體DNA是有48502bp組成的線(xiàn)性雙螺旋分子，分子量3.1107dal。迄今已定位的基因至少61個(gè)，其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動(dòng)，我們稱(chēng)這類(lèi)基

39、因?yàn)槭删w的“必要基因 ”；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)槭删w的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體的基礎(chǔ)。野生型的噬菌體DNA兩端各具12個(gè)核苷酸組成的粘性末端，可用來(lái)構(gòu)建柯斯質(zhì)粒（cosmid）。l l 噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG 3 3CCCGCCGCTGGA 5 COSCOS cos頭部合成基因頭部合成基因 尾部合成基因尾部合成基因 溶菌控制基因溶菌控制基因 晚期控制基因晚期控制基因 DNA合成控制合成控制基因基因 阻遏基因阻遏基因 早期控制基因早期控制基因 阻遏基因阻遏基

40、因 重組基因重組基因 刪除與整合基因刪除與整合基因l - DNA2、 噬菌體DNA克隆載體野生型的DNA不適宜作為克隆載體。因?yàn)槠浞肿恿枯^大，常用的限制酶切點(diǎn)較多。如EcoRI切點(diǎn)5個(gè)，Hind切點(diǎn)7個(gè)，而這些切點(diǎn)大多位于溶菌周期生長(zhǎng)所必須基因內(nèi)，容納不下比其更大的外源性DNA片段，必須對(duì)其進(jìn)行改造。改造方法：將噬菌體感染到具有EcoR I限制修飾體系的和不具有EcoR I 限制修飾體系的兩種寄主細(xì)胞中循環(huán)生長(zhǎng)，使DNA 的EcoR I 位點(diǎn)發(fā)生修飾作用或產(chǎn)生點(diǎn)突變，使其一些EcoR I 位點(diǎn)不能再被EcoR I 切割。最終篩選獲得僅有1-2個(gè)限制酶位點(diǎn)的DNA。將DNA在體外用限制酶消化，再

41、將未切割部分包裝并感E.Coli。如野生型DNA 上有7個(gè)Hind限制位點(diǎn)，從圖中可看出，E.Coli位點(diǎn)1 和2之間片段的缺失，可降去兩個(gè)Hind位點(diǎn)1和2。按此上方法，可構(gòu)建兩類(lèi)噬菌體派生載體取代型載體或替換型載體（replacement vector） 它具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA 區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如EMBL4 和Charon40。 (圖5-12)插入型載體（insertion vectors）只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)（也有一些具有兩個(gè)插入位點(diǎn)）。外源性DNA克隆到插入型的載體分子上會(huì)使噬菌體的某中生物功能喪失，即所謂插入失活效應(yīng)。如免

42、疫功能失活的和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。我們把這些經(jīng)過(guò)改造的噬菌體載體稱(chēng)為：我們把這些經(jīng)過(guò)改造的噬菌體載體稱(chēng)為：凱倫噬菌體載體（凱倫噬菌體載體（Charon bacteriophage）凱倫噬菌體是F.R.Blattner等人于1977年在噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的一種特殊的噬菌體載體。凱倫是古希臘神話(huà)中的一位老擺渡工，專(zhuān)司運(yùn)送亡靈到陰間。這類(lèi)載體有插入型的如Charon2,亦有替換型的如Charon30。他們?cè)诨蚬こ虒?shí)驗(yàn)中用途十分廣泛。許多Charon載體帶有編碼-半乳糖苷酶基因以及它的操控基因和啟動(dòng)子的lac 5取代區(qū)段，如Charon 4噬菌體可以在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出深藍(lán)

43、色的噬菌斑。而當(dāng)含有l(wèi)ac 5的EcoRI片段被外源DNA取代后，所形成的重組噬菌體就只能產(chǎn)生出無(wú)色的噬菌斑，可以很方便的進(jìn)行重組體篩選。（圖5-13）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法顯色篩選法的基本操顯色篩選法的基本操作：作： AprlacZori3、DNA載體重組分子的體外包裝以噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。噬菌體的正常包裝過(guò)程噬菌體的正常包裝過(guò)程1、先按滾環(huán)復(fù)制合成多連體的DNA，2、這些DNA 在具備噬菌體頭部前體和A基因產(chǎn)物的條件下，從cos為點(diǎn)處被切割成DNA 單體分子，并被很快裝填到頭部外殼里邊，3、它具有

44、的12bp長(zhǎng)的粘性末端，又會(huì)重新環(huán)化起來(lái)，4、基因產(chǎn)物便滲入到完整的頭部，接著通過(guò)基因W和基因F II產(chǎn)物的作用，把頭部與尾部結(jié)構(gòu)連成一體，最終形成成熟的噬菌體顆粒。體外包裝過(guò)程體外包裝過(guò)程利用兩個(gè)琥珀突變種噬菌體，一個(gè)是Dam 噬菌體，產(chǎn)生頭部蛋白。另一個(gè)是噬菌體Eam突變體產(chǎn)生尾部蛋白。上述溶菌物與重組DNA混合后，基因E產(chǎn)物（主要為外殼蛋白）在基因A產(chǎn)物作用下，與基因D產(chǎn)物一起將重組DNA包裝成噬菌體頭部，在基因W及基因F產(chǎn)物作用下，將頭部和尾部連接成完整噬菌體顆粒。特點(diǎn)：特點(diǎn)：經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類(lèi)載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。(二)科斯質(zhì)粒

45、載體（Cosmid vectors）1、概述噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右，但有些基因可達(dá)35-40kb，甚至更大，同時(shí)噬菌體不能夠同時(shí)克隆兩個(gè)連鎖基因。為此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質(zhì)粒載體，可滿(mǎn)足以上需要。“cosmid”一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫(xiě)而成，其愿意是指帶有粘性末端位點(diǎn)(cos)的質(zhì)粒。定義：科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的，含有DNA 的粘性(cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個(gè)抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。（圖5-18）2、Cosmid的特點(diǎn)目前已有許多不同類(lèi)

46、型的科斯質(zhì)粒載體，其特點(diǎn)如下： 具有噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體特性；具有高容量的克隆能力；具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。3、科斯克隆應(yīng)用科斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)，叫做科斯克隆(cosmid cloning)。先用特定的核酸內(nèi)切酶局部切割真核生物DNA，產(chǎn)生較高分子量的外源DNA片段，與經(jīng)同樣酶切割過(guò)的科斯質(zhì)粒線(xiàn)性分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)，由此形成的連接產(chǎn)物群體中，有一定比例的分子是兩端各有一個(gè)cos位點(diǎn)的長(zhǎng)度為40kb左右的真核DNA片段，而且這兩個(gè)cos為點(diǎn)在取向上是一致的，它可作為T(mén)er體系的一種通用底物。當(dāng)加入噬菌體的包裝連接物時(shí)，它將能識(shí)別并切

47、割這種兩端由 cos 位點(diǎn)包圍著的35-45 kb長(zhǎng)的真核DNA片段，并把這些分子包裝進(jìn)入噬菌體的頭部。（圖5-19）(三三)單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13載體載體1、概述 噬菌體M13宿主為絲狀E.Coli，其遺傳物質(zhì)為單 鏈環(huán)狀DNA，故稱(chēng)為單鏈DNA噬菌體。其DNA分子長(zhǎng)度為6500bp。M13是一種雄性大腸桿菌特有的噬菌體，因此它們只能感染帶有F性須的大腸桿菌菌株。其復(fù)制過(guò)程如下：2、M13克隆體系中半乳糖苷酶顯色反應(yīng) M13克隆體系，包括M13噬菌體本身和寄主菌株兩個(gè)組成部分。但無(wú)論M13載體，還是大腸桿菌寄主菌株（如JM101），單獨(dú)都不能產(chǎn)生有功能活性的半乳糖苷酶，而這種酶的活

48、性可以用X-gal顯色法測(cè)定出來(lái)。 在M13體系中，已將Lac阻遏基因的Iq突變引入宿祖細(xì)胞。該Iq突變基因可產(chǎn)生出10余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制Lac操縱子的表達(dá)。IPTG是一種乳糖類(lèi)似物，再無(wú)乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被稱(chēng)為半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物安慰誘導(dǎo)物。安慰誘導(dǎo)劑3、M13載體系列的優(yōu)點(diǎn) 單鏈DNA噬菌體的復(fù)制是以雙鏈環(huán)形DNA為中 間媒介的，這種RFDNA可以如同質(zhì)粒DNA一樣， 在體外進(jìn)行純化和操作。 不論是RFDNA還是ssDNA，它們都能夠轉(zhuǎn)染感 受態(tài)的E.Coli寄主細(xì)胞產(chǎn)生出噬菌斑 單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受

49、其DNA多寡 的制約，因此，并不存在包裝限制。 應(yīng)用這類(lèi)單鏈DNA噬菌體，可以容易地控制外 源DNA片段的插入取向?？僧a(chǎn)生大量純化的含外源DNA片段插入的單鏈 DNA分子。這種單鏈DNA分子可按雙脫氧鏈終 止法做核苷酸序列測(cè)定，也可用于制備具放射 性同位素標(biāo)記的DNA探針，可以進(jìn)行寡核苷酸 定點(diǎn)突變?？傊?，M13載體兼具質(zhì)粒載體與噬菌體的優(yōu)點(diǎn)。采用Sanger雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法：測(cè)序三要素：測(cè)序三要素：1、模板DNA母鏈。新合成鏈按堿基互補(bǔ)原則（A-T，C-G）進(jìn)行。2、引物DNA短鏈。起起始合成作用。3、酶、底物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和非正常底物（ddATP、ddT

50、TP、ddGTP、ddCTP) 。 DNA序列測(cè)定法非正常底物非正常底物三、真核基因病毒載體三、真核基因病毒載體病毒載體優(yōu)點(diǎn)是：1、有很高的拷貝數(shù)；2、強(qiáng)大的啟動(dòng)子，可保證外源基因的高效表達(dá)；3、可保證糖基化。常用的有SV40病毒載體及昆蟲(chóng)桿狀病毒載體。真核基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件：1、含有原核基因的復(fù)制起始序列（如ColEI起始序列ori）以及篩選標(biāo)記（如使E.Coli具有 Ampr的-內(nèi)酰胺酶基因 ）。這樣便于在E.Coli細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和篩選。2、含有真核基因的復(fù)制起始序列（如SV40病毒的復(fù)制序列、酵母自主復(fù)制序列）以及真和細(xì)胞篩選標(biāo)記（如氨基糖苷G418抗性基因，在酵母中與自養(yǎng)有關(guān)的

51、基因）。3、含有有效的啟動(dòng)子序列（可包含增強(qiáng)子序列等各種順式作用元件cis-acting element），保證在其下游的外源基因進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄起始。4、RNA聚合酶II所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號(hào)序列。5、合適的供外源基因插入的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。SV40病毒載體(simian vacuolating virus 40 vector)SV40病毒DNA位環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為5224bp，其基因組分為早期區(qū)域和晚期區(qū)域，前者在整個(gè)病毒生長(zhǎng)循環(huán)中均可表達(dá)，后者則在DNA復(fù)制開(kāi)始后的一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生病毒外殼蛋白。SV40 DNAoriVP2TVP3VP1tpV2(gpt)即為一個(gè)S

52、V40載體它包括pBR322的大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因；大腸桿菌谷氨酸丙氨酸酶基因gpt和SV40的哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制起始位點(diǎn)以及其他一些在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所必須的序列。重組子可以通過(guò)對(duì)gpt進(jìn)行篩選。SV40 DNA為載體的取代克隆方式又分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類(lèi)型。晚期基因區(qū)域取代方式是以外源性DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構(gòu)成的重組DNA在宿主中可以復(fù)制，但不能產(chǎn)生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突變種作為輔助病毒與晚期取代重組DNA或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組DNA可獲得標(biāo)記營(yíng)救，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒的早期基因產(chǎn)物一起

53、可形成完整病毒顆粒。早期區(qū)域取代方式是以外源性DNA片段取代早期基因區(qū)域，但重組DNA形成病毒顆粒與早期區(qū)域基因產(chǎn)物T抗原供應(yīng)有關(guān)，故同樣可采用晚期基因區(qū)域缺失的SV40突變種作為輔助病毒進(jìn)行標(biāo)記營(yíng)救，即可形成完整病毒顆粒。SV40病毒載體的宿主為動(dòng)物細(xì)胞。表達(dá)產(chǎn)物有糖基化。目前很多基因工程藥物如EPO，TPA，-珠蛋白可用其表達(dá)。第四節(jié)第四節(jié) 基因的分離和獲得基因的分離和獲得 獲得目的基因，是基因工程研究中最重要的內(nèi)容，也是基因工程操作中的關(guān)鍵。 每種基因都由四種堿基組成，具有極相似的理化性質(zhì)，這給分離特定的基因帶來(lái)很大困難。 盡管如此，人們?nèi)钥赏ㄟ^(guò)各種方法有效地分離出所要的基因。基因的分離

54、和獲得的常用方法基因的分離和獲得的常用方法一、基因分離的物理方法二、鳥(niǎo)槍法(Shot gun) 又稱(chēng)霰彈法三、cDNA文庫(kù)的建立與基因的分離四、基因組文庫(kù)法五、基因的化學(xué)合成六、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）一、基因分離的物理方法 根據(jù)DNA分子的兩條鏈存在著GC，A=T堿基配對(duì)。 如DNA分子中某段的GC堿基對(duì)含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（Tm）就高。這樣，人們通過(guò)控制溶解溫度使富A=T區(qū)解鏈變性，而富GC區(qū)仍維持雙鏈。當(dāng)利用單鏈核酸酶S，酶去除解開(kāi)的單鏈部分，得到富GC區(qū)的DNA片段 。二、鳥(niǎo)槍法(Shot gun) 又稱(chēng)霰彈法 用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行切割，得到很多在長(zhǎng)度上與

55、一般基因大小相當(dāng)?shù)腄NA片段（1000bp），然后，將這些片段混合物隨機(jī)地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌（如：E.Coli）中進(jìn)行擴(kuò)增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略1、隨機(jī)酶切成基因相當(dāng)大小的片段（約1000bp)；2、重組入適當(dāng)載體（質(zhì)粒）；3、轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌（E.coli)，擴(kuò)增；4、篩選出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥(niǎo)槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離 +鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的優(yōu)缺點(diǎn)鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，命中率較高。缺點(diǎn)：盲目性大，陽(yáng)性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會(huì)漏。三、cDNA

56、文庫(kù)的建立與基因的分離 是以mRNA為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA的方法。 cDNA的克隆對(duì)于特定基因的分離和特性研究是極有價(jià)值的工具。 cDNA文庫(kù)最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細(xì)胞類(lèi)型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列。cDNAcDNA文庫(kù)組建步驟如下：文庫(kù)組建步驟如下：1、分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞。2、從組織和細(xì)胞中制備總RNA和mRNA3、第一條cDNA鏈的合成4、第二條cDNA鏈的合成5、cDNA上接頭的加入6、雙鏈cDNA與載體的連接7、從眾多的重組體中篩選出特定的基因cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAc cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成

57、 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈第一鏈引物引物退火退火逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPsc cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 煮沸煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 5端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTT

58、TTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1c cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：置換合成法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 5端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA l

59、igasec cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 dCTP引導(dǎo)合成法：引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HO CCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 p GGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火退火KlenowdNTPs 雙鏈平頭的雙鏈平頭的cDNA通?？寺∪胼d體中的三種方法：通常克隆入載體中的三種方法： 平

60、頭末端直接與載體連接，平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無(wú)法回收但插入的片段無(wú)法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，平頭兩端分別接同聚物尾，最好是最好是AT同聚物尾，同聚物尾，這樣重組分子可通過(guò)加熱局部變性和這樣重組分子可通過(guò)加熱局部變性和S1核酸酶處理核酸酶處理回收插入片段回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口，加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段的回收以便插入片段的回收cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性四、基因組文庫(kù)法所謂基因組文庫(kù)是將基因組DNA通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列?；蚪M